Amélioration de l'efficacité antitumorale et de la pharmacocinétique de la bufaline via les liposomes pégylés

Contexte

Les maladies cancéreuses revêtent une importance mondiale énorme, car la population de patients atteints de cancer, qui augmente chaque année, pourrait augmenter de moitié d'ici 2020 [1]. En raison de l'existence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et de la multirésistance aux médicaments, la tumeur gliome est l'une des maladies les plus mortelles sans agents thérapeutiques efficaces cliniquement [2]. La bufaline a été isolée et identifiée à partir de Venenum Bufonis , qui sont les sécrétions de la peau et des glandes à venin parotides du crapaud Bufo bufo gargarizans Cantor ou Bufo melanostictus Schneider [3]. Il a été rapporté qu'il avait de puissants effets pharmacologiques, notamment des effets cardiotoniques, antiviraux, immunitaires et surtout antitumoraux [4,5,6,7]. Cependant, la faible solubilité la rend difficile à disperser dans la solution aqueuse et limite l'application [8].

Les liposomes ont été considérés comme un nouveau système d'administration de médicaments pour améliorer la faible solubilité des médicaments en solution aqueuse, améliorer la biodisponibilité, augmenter l'efficacité thérapeutique et réduire les effets secondaires [9]. Principalement, il peut être utile que les agents chargés passent par la BHE et soient livrés au cerveau [10]. Cependant, l'un des principaux inconvénients de la formulation liposomale est son élimination rapide du sang en raison de l'absorption des protéines plasmatiques par la membrane phospholipidique des liposomes, ce qui déclenche ensuite la reconnaissance et l'absorption des liposomes par le système phagocytaire mononucléaire. Heureusement, lorsque le polyéthylène glycol (PEG) est modifié à la surface des liposomes, ce type de phagocytose peut être lent. Par conséquent, il est nécessaire d'étudier les liposomes pégylés chargés de bufaline en tant que liposomes à longue circulation pour augmenter sa solubilité aqueuse et améliorer sa pharmacocinétique [11].

À ce jour, les études sur la pharmacocinétique de la bufaline n'ont pas encore fait l'objet d'une grande attention. Certains rapports se concentrent uniquement sur la pharmacocinétique de la bufaline libre en solution aqueuse per os. Dans la présente étude, nous avons développé des liposomes pégylés comme système d'administration de bufaline et comparé la différence pharmacocinétique entre les liposomes pégylés chargés de bufaline, les liposomes chargés de bufaline et l'entité bufaline en solution aqueuse par administration intraveineuse chez le rat.

Méthodes

Produits chimiques et réactifs

La bufaline (≥  98 % de pureté) a été achetée auprès de BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (Baoji, Shaanxi, Chine). L-α-phosphatidylcholine, cholestérol et 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium ; DSPE-PEG₂₀₀₀ ) ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co., Ltd. (St. Louis, MO, États-Unis) (les formules moléculaires de ces substances ont été présentées dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1). L'acétonitrile utilisé était de qualité spectroscopique et acheté chez Honeywell (Amérique). Le chloroforme et l'alcool (qualité analytique) ont été achetés auprès de Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (Chine). Tous les produits chimiques étaient de qualité analytique ou de chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Et l'eau a été désionisée à l'aide du système de purification d'eau Millipore (Milford, MA, USA) et filtrée avec une membrane de 0,22 μm.

Animaux et cellules

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de la quatrième université médicale militaire (Shaanxi, Chine) (approbation 2015-1013-R). Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie au pentobarbital sodique et tous les efforts ont été déployés pour minimiser les souffrances. Des rats mâles Sprague-Dawley, pesant initialement 250 ± 20 g, ont été obtenus auprès de la Fourth Military Medical University (Xi'an, Chine). Les lignées cellulaires SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87 et HepG2 ont été respectivement achetées auprès de la Shanghai Cell Bank ou du Experimental Animal Center de la quatrième université médicale militaire, cultivées dans du RPMI 1640 additionné de 10 % ( v /v ) sérum de veau fœtal (FBS) et 1% d'antibiotiques (100 U/mL de pénicilline G et 0,1 mg/mL de streptomycine). Les cellules ont été maintenues dans leur phase de croissance exponentielle dans une atmosphère de 5% de CO₂ et 90 % d'humidité relative à 37 °C.

Synthèse de liposomes chargés de bufaline

Les liposomes ont été préparés sous la forme d'un lot de 10 mL en utilisant une homogénéisation à haute pression. La quantité de bufaline utilisée était la même dans tous les liposomes. En bref, des liposomes communs chargés de bufaline ont été préparés avec une composition de bufaline, de cholestérol et de L-α-phosphatidylcholine dans un rapport molaire de 10:30:60; Des liposomes pégylés chargés de bufaline ont été synthétisés avec une composition de bufaline, de cholestérol, de L-α-phosphatidylcholine et de DSPE-PEG₂₀₀₀ dans un rapport molaire de 10:30:55:5, respectivement.

Les mélanges de phospholipides ci-dessus ont été totalement dispersés dans 3 ml de chloroforme, puis le chloroforme a été complètement volatilisé par un évaporateur rotatif à 50°C dans des conditions de décompression. Par la suite, le solvant résiduel (le cas échéant) a été séché en le plaçant dans un dessiccateur sous vide pendant une nuit, puis le film mince sec préparé a été réhydraté à l'aide d'un vortex dans 10 mL d'eau déminéralisée préchauffée à 50 °C à 10 mmol/mL de phospholipide pendant 15 min. Le mélange ainsi formé a été encore traité avec une homogénéisation à haute pression. La pression et le temps d'homogénéisation ont été optimisés, ce qui s'est avéré être de 500 bars à 35 °C, et le processus a été recyclé 10 fois. La suspension de liposomes résultante a été immédiatement extrudée avec une extrudeuse Lipex (ATS, Canada) deux fois en utilisant des membranes en polycarbonate (taille de pores de 0,2 µm, Whatman, Maidstone, Royaume-Uni) pour former des liposomes unilamellaires. Une suspension liposomale à blanc a également été préparée par la même méthode que celle décrite précédemment en omettant l'étape d'ajout de bufaline.

Caractérisation des liposomes chargés de bufaline

Taille des particules et potentiel Zeta

La taille des particules et zeta le potentiel des liposomes a été déterminé par la technique de diffusion dynamique de la lumière en utilisant le zeta analyseur de potentiel (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, Californie, USA). Tous les liposomes de bufaline ont été dilués avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration appropriée avant de déterminer la distribution de taille et zeta potentiel. Les mesures ont été effectuées en mode entièrement automatique.

Microscopie électronique à transmission haute résolution

Les liposomes de bufaline ont été davantage caractérisés par des études de microscopie électronique à transmission (HR-MET) à haute résolution. La suspension liposomale de bufaline supportée sur une grille de cuivre de 300 mesh a été colorée négativement avec 1% (w /v ) acide phosphotungstique. L'imagerie directe de la morphologie a été réalisée à des tensions d'accélération de 200 kV à l'aide d'un MET (Hitachi H-7650, Tokyo, Japon).

Efficacité de piégeage

La teneur en bufaline a été analysée par la méthode HPLC. Le système HPLC Shimadzu (Kyoto, Japon) était équipé d'une pompe LC-20AT, d'un détecteur à barrette de diodes SPO-M20A, d'un four à colonne CTO-10AS VP et d'un échantillonneur automatique SIL-10AF. Toutes les séparations ont été effectuées sur une colonne SinoChrom ODS-BP C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, Yillite) (Yillite, Dalian, Chine). Le volume d'injection était de 20 μL et l'effluent de la colonne a été contrôlé à 296 nm. Les données ont été acquises et traitées à l'aide du logiciel ClassVP. La phase mobile était constituée d'un mélange d'acétonitrile :0,1 % de dihydrogénophosphate de potassium (avec de l'acide phosphorique pour ajuster la valeur du pH de 3,8) avec un gradient d'élution (50 :50, v /v ). La chromatographie a été réalisée à un débit de 1,0 mL/min. Pour déterminer l'efficacité de piégeage, 1,0 ml de suspension liposomale de bufaline a été ajouté à la colonne Sephadex G50 et élué avec du PBS. La partie bleuâtre de l'effluent a été collectée et complétée à 10,0 mL (le volume final) en ajoutant du PBS. Le montant (W ₁ ) de bufaline dans la suspension liposomale a été déterminée par la méthode HPLC. Du PBS a été ajouté dans l'autre portion de 1,0 mL de suspension liposomale de bufaline, de manière à atteindre le volume final jusqu'à 10,0 mL, et la quantité (W ₂ ) de bufaline contenue a été déterminée par les mêmes moyens. Le pourcentage de bufaline piégée dans les liposomes de bufaline a été calculé par la formule :

Essai de stabilité in vitro

L'efficacité de piégeage testée par la méthode de chromatographie Sephadex et la taille des particules déterminée par zeta analyseur potentiel ont été appliqués pour évaluer le profil de stabilité après stockage à 4 °C aux jours 0, 7, 15, 30 et 90. Aux cinq points temporels, 200 μL de suspension de liposomes ont été aspirés pour déterminer le rapport de fuite liposomale. Immédiatement, la bufaline libre de 200 μL de suspension de liposomes a été séparée par chromatographie sur colonne Sephadex G50, et la quantité de bufaline libre a été déterminée par la méthode HPLC. Le taux de fuite liposomale a été calculé par la formule :

Libération in vitro de bufaline

Les comportements de libération in vitro de la bufaline à partir de liposomes ont été réalisés en utilisant la technique du sac de dialyse à 37 °C comme décrit précédemment avec quelques modifications. Du PBS (pH = 7,4) contenant 10 % de sérum de veau fœtal a été utilisé comme milieu de libération. Le médicament libre a été retiré des liposomes de bufaline par dialyse exhaustive pendant 4 h contre un tampon PBS à 4 °C. Brièvement, 1,0 mL de suspension liposomale de bufaline a été pipeté dans un tube de dialyse (Spectrumlabs, USA ; MWCO 30 kDa) avec une agitation horizontale douce (120 rpm/min) à température ambiante. Le tube de dialyse a été conservé dans 50 mL de PBS (pH = 7,4) contenant 10 % de sérum de veau fœtal et la température a été maintenue à 37 °C. Le dialysat a été retiré du milieu et remplacé par un volume égal de PBS frais à différentes durées, à savoir. heures 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 et 48. La concentration de bufaline libérée a été mesurée par HPLC comme décrit précédemment.

Cytotoxicité

Des études de cytotoxicité in vitro ont été réalisées en utilisant le test MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) sur plusieurs types de lignées cellulaires tumorales, notamment SW620, PC-3, MDA-MB- 231, A549, U251, U87 et HepG2. De plus, les cellules U87 et U251 ont été sélectionnées pour mesurer les effets cytotoxiques des liposomes chargés de bufaline et des liposomes PEGylés chargés de bufaline sur les cellules tumorales de gliome. Les cellules U87 et U251 ont été respectivement ensemencées dans des plaques de microtitration à 96 puits à 1,0 × 10 ⁵ cellules/puits et laisser adhérer (37 °C, 5% CO₂ ) pendant 24 h, après quoi le milieu a été aspiré et remplacé par 0,1 mL de milieu frais. L'entité bufaline, les liposomes vierges, les liposomes vierges pégylés, les liposomes chargés de bufaline et les liposomes pégylés chargés de bufaline ont été dilués dans un milieu complet et ajoutés aux cellules dans un volume total de 0,1 mL pour atteindre la concentration finale souhaitée ; pour le contrôle, aucune solution d'essai n'a été ajoutée. Les liposomes blancs et les liposomes vierges PEGylés ont été évalués pour tester la toxicité des excipients utilisés dans la préparation des liposomes de bufaline. Après 24 h, la viabilité cellulaire a été évaluée en incubant dans un milieu de croissance contenant 5 mg/mL de MTT pendant 4 h à 37 °C. Après avoir aspiré le milieu de culture, les cristaux de formazan formés ont été solubilisés avec 200 μL de solvant organique. L'absorbance a été mesurée sur un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 570 nm.

Étude pharmacocinétique in vivo des liposomes de bufaline à l'aide de la méthode HPLC

L'étude pharmacocinétique a été menée pour évaluer l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion de la bufaline à partir de liposomes communs ou de liposomes à longue circulation et pour rechercher les différences de biodisponibilité de la bufaline, en utilisant la technique HPLC.

Dans cette expérience, de jeunes rats mâles adultes en bonne santé Sprague-Dawley, pesant 250 ± 20 g, ont été achetés à la quatrième université de médecine militaire (Xi'an, Chine). Les rats ont été logés dans des cages bien ventilées à température ambiante (24 ± 2 °C) et 40 à 60 % d'humidité relative tout en suivant un cycle lumière-obscurité régulier de 12 h. Les animaux ont été acclimatés pendant au moins 3 jours avant l'expérience. Les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives du Comité d'éthique animale de la quatrième université médicale militaire.

Des liposomes chargés de bufaline, des liposomes pégylés chargés de bufaline et de la bufaline en solubilisation assistée par suspension aqueuse par de l'éthanol ont été préparés comme décrit précédemment, puis administrés par voie intraveineuse à une dose équivalente de 0,5 mg/kg, respectivement. Des échantillons de sang ont été prélevés sur la fosse orbitale wein de rats sous anesthésie légère à l'éther dans des tubes à micro-centrifugeuse contenant de l'héparine comme anticoagulant à 2, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 600 min post- dosage puis centrifugé à 3500 r/min pendant 15 min à 4 °C. Le plasma séparé a été conservé congelé à -20 °C avant le dosage.

Exemple de prétraitement

Une simple méthode d'extraction liquide-liquide a été suivie pour l'extraction de la bufaline et de l'étalon interne à partir de sang de rat. À 200 μL, une solution étalon interne (20 μL de 100 μg/mL de stock de travail de cinobufagine) équivalente à 10,0 μg a été ajoutée et mélangée pendant 10 s sur un cyclomixer, suivi d'une extraction avec 3,0 mL d'acétate d'éthyle :éther de pétrole, 1 :1(v /v ) et mélange. Le mélange a été vortexé pendant 5 min, suivi d'une centrifugation pendant 15 min à 4000 tr/min sur Sigma 3-16k (Francfort, Allemagne). Une aliquote de 3,0 mL de couche organique a été séparée et évaporée à sec sous azote, puis le résidu a été redissous dans 200 μL d'acétonitrile. Vingt microlitres de liquide surnageant ont été injectés sur une colonne analytique pour analyse après 15 min de centrifugation à 12 000 tr/min.

Analyse pharmacocinétique

La concentration sanguine maximale observée (C _max ) et le temps de demi-vie (T _1/2 ) ont été obtenus par inspection visuelle des données expérimentales. Les données ont été soumises à une analyse pharmacocinétique non compartimentale à l'aide de Drug and Statistics (DAS 2.1.1) éditée par le comité professionnel de pharmacologie mathématique de la Chinese Pharmacological Society pour l'évaluation clinique des médicaments. Les données ont été analysées selon un modèle ouvert à deux compartiments.

Analyse statistique

Tous les résultats ont été exprimés en moyenne  ± SD (n = 3), et les différences entre les formulations ont été comparées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), à l'aide du logiciel GraphPad Prism 5. P < 0,05 indique une importance dans tous les cas.

Résultats

Propriétés physicochimiques

La réhydratation du film combinée à la technologie d'homogénéisation à haute pression a été utilisée pour la préparation de liposomes chargés de bufaline et de liposomes pégylés chargés de bufaline. La réhydratation du film est l'une des méthodes conventionnelles pour synthétiser des liposomes avec des processus matures et contrôlés pour piéger les médicaments lipophiles. En outre, le nombre de cycles d'homogénéisation joue un rôle clé pour obtenir une suspension liposomale uniforme et stable.

Les morphologies des liposomes chargés de bufaline et des liposomes pégylés chargés de bufaline sont soit presque sphériques, soit ovales, comme observé par MET, comme le montre la figure 1. les liposomes étaient tous deux inférieurs à 200 nm. Les tailles de particules moyennes des liposomes chargés de bufaline et des liposomes pégylés chargés de bufaline étaient respectivement de 127,6 ± 3,64 nm et 155,0 ± 8,46 nm (Fig. 1c), mesurées par zeta analyseur de potentiel (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, Californie, USA). Par rapport aux liposomes chargés de bufaline, les liposomes pégylés chargés de bufaline présentaient une charge de surface négative, suggérant une excellente stabilité (liposomes chargés de bufaline 2,24 mV ; liposomes pégylés chargés de bufaline -18,05 mV, fichier supplémentaire 2 :tableau S1). De plus, les distributions de zeta potentiel peut être vu dans la Fig. 1b. Cependant, l'efficacité de piégeage de la bufaline dans les liposomes chargés de bufaline et les liposomes PEGylés chargés de bufaline déterminée par HPLC sont de 76,31 ± 3,40% et 78,40 ± 1,62 %, respectivement.

Propriétés physicochimiques des liposomes chargés de bufaline et des liposomes pégylés chargés de bufaline. un Images MET de liposomes chargés de bufaline et de liposomes pégylés chargés de bufaline de forme presque sphérique ou ovale. b La taille des particules et la distribution typiques des liposomes chargés de bufaline et des liposomes PEGylés chargés de bufaline, telles que mesurées par diffusion dynamique de la lumière. c La surface typique zeta potentiel des liposomes chargés de bufaline et des liposomes pégylés chargés de bufaline

Essai de stabilité in vitro

Les profils de stabilité des liposomes chargés de bufaline et des liposomes pégylés chargés de bufaline sont présentés dans le tableau 1. De plus, le rapport de fuite liposomale a également été calculé. Pour les liposomes chargés de bufaline, les résultats étaient respectivement de 0,0, 16,7, 25,2, 27,9 et 30,6 % à 4 °C aux jours 0, 7, 15, 30 et 90. Pour les liposomes pégylés chargés de bufaline, les résultats étaient respectivement de 0,0 , 5,0, 8,8, 14,5 et 18,0 % à 4 °C les jours 0, 7, 15, 30 et 90.

Profil de libération in vitro

Le profil de libération de bufaline à partir de liposomes chargés de bufaline ou de liposomes PEGylés chargés de bufaline est résumé dans la Fig. 2. À partir des données expérimentales, dans le même milieu de dissolution, la bufaline pourrait diffuser rapidement sans restrictions dans du PBS contenant 10 % de sérum de veau fœtal, suivi de bufaline -des liposomes chargés et enfin des liposomes pégylés chargés de bufaline.

Libération in vitro de bufaline à partir de liposomes communs chargés de bufaline et de liposomes pégylés chargés de bufaline dans un milieu de dissolution tampon phosphate, pH 7,4. Les données sont des moyens  ± SD, n = 3

Cytotoxicité

Les viabilités cellulaires de plusieurs types de lignées cellulaires tumorales affectées par l'entité bufaline sont présentées sur la figure 3a lorsqu'elles sont testées par le test MTT, et leur concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀ ) sont également calculés dans le fichier supplémentaire 2 :tableau S2. La bufaline a provoqué l'inhibition de la croissance de plusieurs cellules tumorales de manière dose-dépendante, tandis que les résultats de l'IC₅₀ ont révélé que la bufaline était plus sensible aux cellules cancéreuses de gliome U251 et U87 que les autres cellules cancéreuses testées, respectivement. Lorsqu'il est appliqué avec une entité bufaline, des liposomes chargés de bufaline et des liposomes PEGylés chargés de bufaline, les viabilités cellulaires de U251 réalisées par dosage MTT sont illustrées à la figure 3b. Lorsqu'elles ont été cultivées pendant 12 h, les viabilités cellulaires de l'entité bufaline, des liposomes chargés de bufaline et des liposomes pégylés chargés de bufaline présentaient des différences différentes, tandis que celles des liposomes vierges et des liposomes vierges pégylés n'ont pas changé. Comme décrit, au même niveau de concentration, les viabilités cellulaires de U251 dans le groupe de liposomes pégylés chargés de bufaline étaient toujours inférieures à celles du groupe de liposomes chargés de bufaline ; pendant ce temps, les impacts de l'entité bufaline sur les viabilités cellulaires étaient minimes.

Cytotoxicité in vitro des liposomes vierges, des liposomes vierges PEGylés, de l'entité bufaline, des liposomes chargés en bufaline et des liposomes PEGylés chargés en bufaline contre les cellules tumorales. un Viabilité cellulaire de plusieurs types de lignées cellulaires tumorales à diverses concentrations d'entité bufaline. b Viabilité cellulaire des cellules U251 à diverses concentrations de liposomes vierges, de liposomes vierges pégylés, d'entité bufaline, de liposomes chargés de bufaline et de liposomes pégylés chargés de bufaline

Étude pharmacocinétique in vivo

Validation de la méthode

La courbe d'étalonnage a été tracée sur la base d'une analyse de régression linéaire de l'objection au rapport pic-surface standard interne (y ) versus concentrations (x , g/mL) de bufaline dans la solution étalon à sept concentrations différentes. L'équation de régression était y = 0.4238 x + 0,2429 (plage linéaire de 0,05 à 10,0 μg/mL) et coefficients de corrélation (R ² ) étaient de 0,9965. La valeur limite de détection (LOD) était de 0,01 μg/mL, qui a été calculée comme la quantité d'échantillon injecté qui a donné un rapport signal sur bruit de 3 (S/N = 3).

Spécificité, précision et récupération

Le degré d'interférence par des substances endogènes a été évalué par l'inspection de chromatogrammes dérivés d'échantillons de plasma blanc traités. Fichier supplémentaire 3 : La figure S2 présente des chromatogrammes typiques de plasma à blanc, de plasma à blanc dopé avec de la bufaline, de plasma à blanc dopé avec de la bufaline et de la résibufogénine (comme étalon interne), des échantillons de plasma dopés avec de la résibufogénine 30 min après l'administration intraveineuse de l'entité bufaline, des échantillons de plasma enrichis avec la résibufogénine 30 min après l'administration intraveineuse de liposomes chargés de bufaline, et des échantillons de plasma enrichis en résibufogénine 30 min après l'administration intraveineuse de liposomes pégylés chargés de bufaline. La bufaline et la résibufogénine ont été éluées à environ 7,191 et 10,131 min, respectivement. Aucun pic de matériaux membranaires interférents et liposomiques n'a été trouvé au temps de rétention de la bufaline ou de l'étalon interne. Les résultats des tests de précision et de récupération sont illustrés dans le tableau 2.

Pharmacocinétique

Les profils concentration-temps dans le sang des liposomes chargés de bufaline, des liposomes pégylés chargés de bufaline, et sa comparaison avec l'entité bufaline en suspension aqueuse sont présentés dans la figure 4. Les paramètres pharmacocinétiques moyens sont présentés dans le tableau 3. Les résultats ont montré qu'il y avait des différences significatives dans la plupart de ces paramètres entre eux, et le C _max des liposomes chargés de bufaline était inférieure à l'entité bufaline, tandis que celle des liposomes pégylés chargés de bufaline était moindre. De plus, le T _1/2z le rapport des liposomes pégylés chargés de bufaline à l'entité bufaline et des liposomes chargés de bufaline à l'entité bufaline était d'environ 2,15 fois (87,84 min/40,52 min) (P < 0,01) et 1,34 fois (54,40 min/40,52 min) (P < 0,05), respectivement. L'AUC_{(0–t )} le rapport des liposomes pégylés chargés de bufaline à l'entité bufaline et des liposomes chargés de bufaline à l'entité bufaline était d'environ 5,49 fois (139 157,83 ng/(mL min)/25 334,27 ng/(mL min)) (P < 0,01) et 2,28 fois (57 751,88 ng/(mL min)/25 334,27 ng/(mL min)) (P < 0,01), respectivement. Il a révélé que l'entité bufaline était rapidement éliminée dans la circulation sanguine et que la préparation de liposomes augmentait la concentration de médicament dans le plasma et résistait à l'élimination. De plus, la modification du PEG pourrait faciliter cet effet.

Courbe concentration-temps de la bufaline dans le plasma du rat

Discussion

Cette étude a préparé avec succès des liposomes chargés de bufaline et des liposomes PEGylés chargés de bufaline par la méthode d'homogénéisation-réhydratation du film, qui avaient tous deux une plage de taille optimale et une faible polydispersité et pouvaient être facilement reproduits dans un lot de grande taille. Cette étude a révélé que la formulation liposomale améliorait considérablement la solubilité de la bufaline.

Les liposomes pégylés chargés de bufaline présentaient une charge de surface négative avec une valeur absolue plus grande que les liposomes chargés de bufaline avec une charge de surface positive. Le zêta Le potentiel est principalement déterminé par les propriétés de surface. Les liposomes chargés de bufaline non modifiés étaient neutres et leurs potentiels étaient généralement de ± 5 mV. Cependant, le DSPE n'est pas chargé dans des conditions neutres, mais le processus de préparation ne peut pas être complètement neutre, de sorte que le DSPE est chargé négativement. Pendant ce temps, le zeta Le potentiel de la macromolécule PEG est environ négatif pendant plusieurs millivolts, près du potentiel négatif neutre. Par conséquent, après la modification de surface du DSPE-PEG₂₀₀₀ sur les liposomes chargés de bufaline, le zeta le potentiel des liposomes pégylés chargés de bufaline est négatif. Ces résultats suggèrent que la modification de surface du DSPE-PEG₂₀₀₀ modifie les potentiels électriques de surface des liposomes, ce qui améliore leur stabilité. Il avait été confirmé par un test de stabilité in vitro. Li et al. [12] ont utilisé un système de co-administration de liposomes qui couplait des mAb anti-CD40 à la surface de liposomes pégylés enveloppés de bufaline. Les liposomes ont été synthétisés avec une composition de bufaline, cholestérol, EPC, DSPE-PEG₂₀₀₀ , et DSPE-PEG₂₀₀₀ -Mal dans un rapport molaire de 20:55:5:5:15, respectivement. Ensuite, l'anticorps monoclonal anti-CD40 a été conjugué aux liposomes par la réaction maléimide-thiol pour la préparation d'anti-CD40 ancré dans les liposomes de bufaline. En ce qui concerne le profil de stabilité, il est seulement mentionné que la charge de surface négative suggère une excellente stabilité sans description de données claire et définie.

Li et al. [13] ont préparé un liposome chargé de bufadiénolide (BU-lipo) constitué de Lipoid E-80® 1,25 % et de cholestérol 0,06 %. Les efficacités de piégeage de la bufaline, de la cinoufagine et de la résibufogénine étaient respectivement de 86,5, 90,0 et 92,1 %. Compte tenu de la stabilité des phospholipides, un pH de 6,5 a été choisi pour la formulation BU-lipo. Les propriétés de BU-lipo, telles que pH, PSD, zeta le potentiel et l'efficacité de piégeage n'ont pas changé pendant au moins 3 mois à 2-8 °C. Cependant, les conditions de stockage devaient être strictement contrôlées. Une préparation plus stable à pH neutre doit être étudiée afin de réduire les coûts de transport et de stockage, ce qui devrait être pris en considération pour la future application clinique.

Selon la formulation de préparation des études précédentes, nous avons reproduit les expériences sur les liposomes chargés de bufaline. Cependant, la stabilité des liposomes ne pouvait pas répondre aux besoins de production.

Dans la présente étude, des liposomes pégylés chargés de bufaline ont été synthétisés avec une composition de bufaline, de cholestérol, de L-α-phosphatidylcholine et de DSPE-PEG₂₀₀₀ dans un rapport molaire de 10:30:55:5, respectivement. Surtout avant d'être extrudé avec une extrudeuse Lipex utilisant des membranes en polycarbonate, le mélange ainsi formé a ensuite été traité avec une homogénéisation à haute pression.

Lorsqu'ils sont conservés à pH neutre à 4 °C pendant 3 mois, la taille des particules des deux liposomes a légèrement augmenté et l'efficacité de piégeage a légèrement diminué dans l'ensemble, ce qui sera pratique pour une application clinique. Une photographie MET a montré qu'une épaisse structure tridimensionnelle semblable à un nuage recouvrait la surface des liposomes chargés de bufaline, ce qui indique que DSPE-PEG₂₀₀₀ joue un rôle dans la stabilisation stérique en raison de sa structure polymère linéaire amphiphile.

Une étude de libération in vitro a révélé que les libérations de bufaline à partir de liposomes chargés de bufaline et de liposomes pégylés chargés de bufaline étaient retardées dans le même milieu de dissolution, tandis que l'entité bufaline se diffusait rapidement dans le PBS sans restrictions. La modification de surface du DSPE-PEG₂₀₀₀ altéré les propriétés de barrière de la couche limite aqueuse et la perméabilité de la membrane, entraînant une faible vitesse de libération de la bufaline à partir des liposomes.

Concernant l'étude de cytotoxicité, la bufaline a provoqué une inhibition évidente de la croissance de plusieurs cellules tumorales de manière dose-dépendante, tandis que les résultats de l'IC₅₀ indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.