131I-Tracé PLGA-Lipid Nanoparticles as Drug Delivery Carriers for the Targeted Chemotherapeutic Treatment of Melanoma

Contexte

L'un des cancers de la peau les plus agressifs, le mélanome, provient de la transformation maligne des mélanocytes [1, 2]. Compte tenu de sa rechute facile et de son potentiel élevé de métastases, la survie à 5 ans des patients atteints de mélanome métastasé n'est que de 10 %. À ce jour, le traitement le plus courant pour les patients atteints de mélanome est la chimiothérapie, qui s'accompagne d'effets secondaires graves indésirables, d'une faible biodisponibilité, d'une mauvaise sélectivité tumorale et d'une toxicité systémique dose-limitante, présentant des défis majeurs en chimiothérapie tumorale [3, 4].

Le paclitaxel (PTX), un extrait naturel de plante dérivé des racines séchées, des branches, des feuilles et de l'écorce de taxus, un genre de conifères [5, 6], montre une activité antitumorale efficace contre plusieurs types de tumeurs, y compris le carcinome de l'ovaire et du poumon. cancer [7,8,9]. De plus, la PTX a également été rapportée comme efficace contre le mélanome humain [10, 11]. Néanmoins, en plus des inconvénients mentionnés ci-dessus des médicaments chimiothérapeutiques, un Cremophor EL et de l'alcool déshydraté (1:1, v /v ) est utilisé dans la pratique clinique actuelle comme milieu de dilution pour la PTX, ce qui peut entraîner des effets secondaires graves, notamment une hypersensibilité [12, 13]. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies pour améliorer la solubilité aqueuse et l'accumulation tumorale d'agents chimiothérapeutiques afin de réduire leur exposition périphérique et de minimiser leur toxicité in vivo est primordial. Le développement récent de nanotransporteurs de médicaments biocompatibles offre le potentiel d'améliorer la stabilité physiologique de la PTX [14,15,16]. De plus, la conjugaison de molécules cibles à ces nanosupports permettrait l'administration sélective d'agents chimiothérapeutiques aux sites tumoraux avec une exposition périphérique réduite grâce à un effet ciblé médié par les récepteurs de la surface des cellules tumorales [17,18,19].

Ici, nous avons préparé un composite poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA)-lipide qui conjugue de manière covalente l'acide folique (FA :une molécule ciblant les tumeurs) et encapsule la PTX comme médicament chimiothérapeutique pour le traitement du mélanome. De plus, ¹³¹ I, un marqueur radioactif, a été utilisé pour radiomarquer les nanoparticules lipidiques PLGA afin d'évaluer clairement leur comportement in vivo. En raison de son émission bêta négative, de sa demi-vie physique et de sa large gamme de propriétés de désintégration, ¹³¹ I est couramment utilisé comme radiomarqueur en clinique [20,21,22]. La morphologie, la stabilité et la dispersion des ¹³¹ Nanoparticules lipidiques PLGA marquées I (FA-PLP- ¹³¹ I) ont été évalués in vitro. De plus, l'absorption cellulaire, la circulation sanguine et la biodistribution de FA-PLP- ¹³¹ J'ai été enquêté en mesurant la radioactivité de ¹³¹ I. Par ailleurs, l'efficacité anticancéreuse ciblée du FA-PLP- ¹³¹ J'ai été étudié in vitro et in vivo. Les résultats indiquent que FA-PLP- ¹³¹ Je peux être une nanoplate-forme polyvalente à utiliser comme nanosupport potentiel d'administration de médicaments contre les tumeurs pour les médicaments chimiothérapeutiques.

Méthodes

Matériaux

Le poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA, MW :5000-15 000, lactide:glycolide (50:50)) et la chloramine-T ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Na ¹³¹ J'ai été obtenu auprès d'Atomic Hitech (Pékin, Chine). Le PTX (99 %) et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ont été achetés auprès d'Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Lécithine de soja composée de 90-95% de phosphatidylcholine, 1,2-distéaroyl-sn-glycérol-3-phosphoéthanolamine-N -[folate (polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀ -FA), et 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N -[carboxy (polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀ -COOH) ont été obtenus auprès d'Avanti (Alabaster, AL, USA). Tous les réactifs de culture cellulaire ont été achetés auprès de Sigma Aldrich.

Préparation des nanoparticules FA-PLP

Les nanoparticules FA-PLP ont été synthétisées par une méthode d'auto-assemblage de nanoprécipitation [23]. En détail, 10 mg de PTX ont été dissous dans 1 ml d'éthanol et 2 mg de PLGA ont été dissous dans 1 ml de dichlorométhane. Après les avoir mélangés, lécithine/DSPE-PEG₂₀₀₀ Une solution aqueuse d'éthanol -FA (4:1) (4 % en poids) a été ajoutée goutte à goutte dans la solution de mélange pendant 4 h sous agitation douce à 25°C. Le mélange a été filtré et lavé trois fois avec de l'eau désionisée en utilisant un tube centrifuge d'ultrafiltration Millipore pour éliminer le médicament non encapsulé et le solvant organique. A titre de contrôle, des nanoparticules sans greffage de molécule FA ont été préparées par la même méthode, remplaçant le DSPE-PEG₂₀₀₀ -FA avec DSPE-PEG₂₀₀₀ -COOH. Les nanoparticules de FA-PLP purifiées ont été conservées à 4 °C jusqu'à utilisation ultérieure.

Préparation de ¹³¹ Nanoparticules FA-PLP labellisées I

FA-PLP radioactif (FA-PLP- ¹³¹ I) les nanoparticules ont été préparées par la méthode d'oxydation de la chloramine-T [24]. Un mélange de 1 mL FA-PLP (1 mg/mL), 500 μCi Na ¹³¹ I (qui est la radioactivité maximale pouvant être greffée sur FA-PLP), et 100 μL de 5 mg/mL de chloramine-T ont été mis à réagir dans un tampon phosphate pH 7,5 pendant 10 min à température ambiante. La réaction a ensuite été stoppée en ajoutant 200 μL de métabisulfite de sodium (5 mg/mL). ¹³¹ La PLP et la PTX marquées à l'I ont été préparées en suivant la même procédure. Ils ont été purifiés à l'aide d'un tube à centrifuger (Millipore) pour éliminer le Na ¹³¹ libre restant. I jusqu'à ce qu'aucune activité gamma ne soit détectable dans la solution de filtrat. Le rendement de radiomarquage et la pureté des nanoparticules marquées ont été analysés à l'aide d'un compteur gamma (LKB gamma 1261 ; LKB Instruments).

Caractérisation

Les spectres d'absorption UV-vis ont été enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre UV-vis (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine). Des images de microscopie électronique à transmission (MET) ont été recueillies sur un Zeiss LIBRA 120 TEM. La taille, le potentiel zêta et l'indice de polydispersité (PDI) des nanoparticules ont été détectés par une analyse de diffusion dynamique de la lumière (DLS) à l'aide d'un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Les photographies optiques ont été prises avec un appareil photo numérique Nikon D3200.

Culture cellulaire

La lignée cellulaire de mélanome de souris B16F10 a été obtenue auprès de la Cell Bank of the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Chine) et cultivée dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine dans un milieu humidifié. 5% de CO₂ atmosphère à 37 °C.

Dosages d'incorporation in vitro

Des tests d'incorporation in vitro dépendant du temps ont été effectués pour déterminer les temps d'efficacité de liaison cellulaire optimaux pour le ¹³¹ Composés marqués I [25]. Les cellules B16F10 ont été ensemencées dans des plaques 24 puits à 1 × 10 ⁵ cellules par puits et cultivées jusqu'à confluence. Échantillons radio-iodés ( ¹³¹ Moi, PL- ¹³¹ Moi, FA-PL- ¹³¹ Moi, PLP- ¹³¹ Moi, FA-PLP- ¹³¹ I) ont été préparés dans des milieux DMEM et ajoutés aux puits de culture cellulaire, séparément. Après 0,5, 1, 2, 4 et 6 h d'incubation, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et leur radioactivité mesurée avec un compteur gamma (Science and Technology Institute of China, Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Les valeurs d'incorporation (%) ont été calculées comme décrit dans la littérature précédente [25]. De plus, les nanoparticules ont été marquées avec le colorant fluorescent isothiocyanate de fluorescéine (FITC, Sigma) puis incubées avec des cellules B16F10. Les images de fluorescence des cellules ont été capturées à l'aide d'un microscope à balayage laser confocal commercial (FV1200, Olympus, Tokyo, Japon).

Dosage de cytotoxicité in vitro

Le test de viabilité cellulaire MTT a été utilisé pour étudier la cytotoxicité du PL- ¹³¹ I et FA-PL- ¹³¹ I, ainsi que celui de PTX libre, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I, contre les cellules B16F10. En bref, les cellules B16F10 ont été étalées dans des plaques à 96 puits pendant 24 h et exposées au PL- ¹³¹ I et FA-PL- ¹³¹ I (avec 0-100 μg/mL de PLGA-lipide), ou PTX libre, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I (à diverses concentrations de 0 à 40 μg/mL) pendant 24 h. L'expérience a été réalisée en triple. Toutes les données ont été exprimées en moyenne  ± SD.

Modèle animal

Des souris Balb/c âgées de trois à cinq semaines ont été achetées auprès de Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité sur le soin et l'utilisation des animaux de l'Université de Fudan, qui est conforme au Guide des instituts nationaux de la santé pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Cellules B16F10 (1 × 10 ⁶ ) dans du PBS ont été injectés par voie sous-cutanée dans le flanc droit des souris. Le volume de la tumeur en croissance a été mesuré à l'aide d'un pied à coulisse et le volume de la tumeur a été calculé à l'aide de la formule :volume =(longueur × largeur ² )/2. Lorsque le volume tumoral a atteint environ 80 mm ³ , les souris ont été randomisées dans les groupes expérimentaux.

Étude sur la circulation sanguine et la biodistribution

Des souris Balb/c saines ont reçu une injection intraveineuse de PTX- ¹³¹ I et FA-PLP- ¹³¹ I (100 μL de 10 μCi par souris, 5 mg/kg). La circulation sanguine a été mesurée en prélevant environ 10 μL de sang de la queue de souris. La radioactivité dans le sang a été mesurée à l'aide d'un compteur gamma. Afin de détecter la biodistribution des nanoparticules, des souris porteuses d'une tumeur B16F10 ont reçu une injection de PTX- ¹³¹ Moi, FA-PL- ¹³¹ Moi, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ J'ai à la même dose et sacrifié 24 h après l'injection. Les principaux organes ont été pesés et collectés pour le comptage gamma.

Chimiothérapie tumorale in vivo

Des souris Balb/c portant des tumeurs B16F10 ont reçu une injection de 150 μL de solution saline, PTX libre, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I (à la même concentration de PTX, 5 mg/kg). La taille de la tumeur et le poids corporel ont été mesurés par un pied à coulisse tous les 4 jours. Les volumes relatifs des tumeurs ont été calculés en tant que V /V ₀ (V ₀ était le volume tumoral au début du traitement). Après environ 40 jours de traitement, les souris ont été sacrifiées et les principaux organes prélevés, fixés dans du formol à 4 %, inclus dans de la paraffine et tranchés, colorés à l'hématoxyline et à l'éosine, et examinés au microscope numérique.

Résultats et discussion

Préparation et Caractérisation de ¹³¹ Nanoparticules FA-PLP labellisées I

Le schéma de synthèse de FA-PLP- ¹³¹ I nanoparticules est montré dans la Fig. 1. En bref, les nanoparticules FA-PLP ont été synthétisées par une méthode de nanoprécipitation d'auto-assemblage et de FA-PLP radioactif (FA-PLP- ¹³¹ I) a été préparé en utilisant la méthode d'oxydation à la chloramine-T [23, 24]. La PTX a été encapsulée par le composite PLGA-lipide, qui a ensuite été greffé avec du FA conjugué covalent à la surface de la coque via PEGylation. Enfin, ¹³¹ J'ai été greffé sur la surface externe des nanoparticules. Les images MET ont indiqué que le FA-PLP- ¹³¹ Les nanoparticules I avaient une morphologie sphérique de distribution de taille étroite (165,6 à 181,2 nm), ce qui a été confirmé par la diffusion dynamique de la lumière (Fig. 2a, b). Le potentiel zêta variait de −39,1 à −3,2 mV (Fig. 2c). Les spectres UV-vis du PTX libre et du FA-PLP- ¹³¹ I (avec la même concentration de PTX) a montré le même pic caractéristique à 233 nm (Fig. 2d), indiquant que la PTX avait été encapsulée dans FA-PLP- ¹³¹ I et cette encapsulation n'ont pas influencé l'intensité d'absorbance de la PTX. Après calcul, l'efficacité d'encapsulation du PTX dans FA-PLP- ¹³¹ On m'a montré que j'avais 56,35 ± 1,6%. Le rendement de radiomarquage du PTX- ¹³¹ Moi, PL- ¹³¹ Moi, FA-PL- ¹³¹ Moi, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ J'avais 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5 et 54,8 ± 2,7, respectivement.

Synthèse de FA-PLP- ¹³¹ I nanoparticules

un Image TEM de FA-PLP- ¹³¹ I. b Taille des particules et c potentiel zêta de FA-PLP- ¹³¹ J'ai analysé par diffusion dynamique de la lumière. d Spectres d'absorbance du PTX libre et du FA-PLP- ¹³¹ Je

La stabilité est essentielle à l'application biomédicale des nanoparticules [26]. Après 4 semaines de stockage, FA-PLP- ¹³¹ Je me suis dissous dans de l'eau, des milieux cellulaires, du sérum de veau fœtal et du PBS n'ont affiché aucun changement dans la taille moyenne, le potentiel zêta, l'indice PDI (Fig. 3a–c), indiquant une grande stabilité et dispersité. De plus, la stabilité du radiomarquage du FA-PLP- ¹³¹ J'ai été détecté dans le plasma de souris à 37 °C (Fig. 3d), montrant moins de 15 % de désiodation en 7 jours.

un , b Stabilité colloïdale et c Test PDI de FA-PLP- ¹³¹ I dans différents milieux, y compris l'eau, le DMEM, le PBS et le sérum bovin fœtal (FBS). d Courbe de stabilité du radiomarquage du FA-PLP- ¹³¹ I dans le plasma de souris à 37 °C dans les 2 semaines de stockage

Captation cellulaire in vitro

La figure 4 montre l'incorporation in vitro en fonction du temps de ¹³¹ Moi, PL- ¹³¹ Moi, FA-PL- ¹³¹ Moi, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I dans les cellules B16F10 mesurées par un compteur gamma. FA-PLP- ¹³¹ Moi, ainsi que FA-PL- ¹³¹ I, a montré des valeurs d'incorporation plus élevées que celles de tous les points temporels testés, augmentant avec le temps. Les valeurs d'incorporation de FA-PLP- ¹³¹ J'étais 3,12 et 23,4 fois plus élevé à 6 h que ceux de ¹³¹ I et PLP- ¹³¹ I, en accord avec les résultats des images de microscopie confocale à balayage laser de cellules B16F10 incubées avec FA-PLP- ¹³¹ marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine I et PLP- ¹³¹ I nanoparticules (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). Ces résultats démontrent la forte absorption cellulaire de FA-PLP- ¹³¹ I, probablement en raison de l'effet de ciblage induit par l'AF sur les cellules B16F10.

Incorporation en fonction du temps de ¹³¹ Moi, PL- ¹³¹ Moi, FA-PL- ¹³¹ Moi, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I sur les cellules B16F10

Cytotoxicité in vitro

La cytotoxicité des nanoporteurs témoins, PL- ¹³¹ Moi, et FA-PL- ¹³¹ J'ai été testé par le test MTT. Cellules traitées avec PL- ¹³¹ I et FA-PL- ¹³¹ I pendant 24 h avait une viabilité similaire au témoin (Fig. 5a), indiquant une bonne biocompatibilité. De plus, FA-PLP- ¹³¹ J'étais beaucoup plus efficace pour supprimer la prolifération des cellules B16F10 que le PTX libre et le PLP- ¹³¹ I à la même concentration de PTX (Fig. 5b), indiquant une excellente chimiothérapie ciblée sur les cellules. Les résultats démontrent que FA-PLP- ¹³¹ J'ai un effet chimiothérapeutique élevé sans radiotoxicité ni cytotoxicité.

un Viabilité cellulaire des cellules B16F10 après traitement au PL- ¹³¹ I et FA-PL- ¹³¹ J'ai pendant 24 h. b Viabilités cellulaires des cellules B16F10 après incubation avec différentes concentrations de PTX libre, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I pendant 24 h

Étude sur la circulation sanguine et la biodistribution

Il a été rapporté que le radiomarquage est plus fiable que l'imagerie par fluorescence pour le suivi in ​​vivo quantitatif et précis des nanoparticules [27, 28]. ¹³¹ Des nanoparticules FA-PLP marquées à l'I ont été préparées pour étudier leur comportement in vivo, y compris la circulation sanguine et la biodistribution, tels que mesurés par un compteur gamma. La demi-vie de circulation sanguine de la PTX libre (t _1/2 = 5,4 ± 0,23 h) a été prolongée à 18,5 ± 0,5 h par FA-PLP- ¹³¹ I (Fig. 6a) en raison de l'encapsulation de nanoparticules, qui était favorable à l'accumulation de ciblage tumoral [29,30,31]. Ensuite, la biodistribution du PTX- ¹³¹ libre Moi, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I chez des souris porteuses de tumeurs B16F10 1 jour après l'injection a été étudiée (Fig. 6b). FA-PLP- ¹³¹ Moi, ainsi que FA-PL- ¹³¹ I, présentait une amélioration évidente de l'absorption tumorale, qui était de 4,41 et 12,8 fois supérieure à celle du PLP- ¹³¹ I et PTX- ¹³¹ gratuit I, respectivement, probablement en raison de la circulation sanguine prolongée de FA-PLP- ¹³¹ Moi, FA-PL- ¹³¹ I, et son effet de ciblage FA. De plus, le foie et la rate présentaient également une absorption relativement élevée en raison de leur métabolisme des nanoparticules, qui étaient les organes métaboliques normaux [32, 33].

un La courbe de circulation sanguine de FA-PLP- ¹³¹ I après injection intraveineuse. b Biodistribution de PTX- ¹³¹ Moi, FA-PL- ¹³¹ Moi, FA-PLP- ¹³¹ Moi et PLP- ¹³¹ I chez des souris porteuses de tumeurs B16F10

Chimiothérapie tumorale in vivo

PTX-, PLP- ¹³¹ gratuits I-, et FA-PLP- ¹³¹ Les souris traitées par I ont présenté une inhibition de la croissance tumorale par rapport au groupe témoin salin (Fig. 7a). Dans l'ensemble, FA-PLP- ¹³¹ J'étais le plus efficace pour supprimer la croissance tumorale sans rechute par rapport à tous les groupes traités après environ 40 jours de traitement. Ces résultats sont comme prévu compte tenu de la circulation sanguine significativement prolongée de FA-PLP- ¹³¹ I et donc sa capacité à favoriser l'accumulation ciblée de tumeurs médiées par l'AF. En outre, l'accumulation ciblée sur la tumeur a également conduit à une réduction de l'exposition périphérique à la PTX, minimisant ainsi la toxicité systémique. Comme prévu, au cours du processus de traitement complet, il n'y a eu aucune perte notable de poids corporel (Fig. 7b), et les principaux organes, y compris le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins, n'ont montré aucune lésion histologique évidente dans aucun groupe ( Fig. 7c).

un Le volume relatif de la tumeur et b poids corporel de souris porteuses de tumeurs après injection dans la veine caudale avec une solution saline (témoin), PTX libre, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I. b Poids corporel de souris porteuses de tumeurs après injection dans la veine caudale avec une solution saline (témoin), PTX libre, PLP- ¹³¹ Moi, et FA-PLP- ¹³¹ I. c Les images représentatives de coloration à l'hématoxyline et à l'éosine des principaux organes, notamment le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins. Barre d'échelle = 100 μm

Conclusions

En résumé, nous avons synthétisé ¹³¹ Nanoparticules lipidiques PLGA marquées par I en tant que vecteurs d'administration de médicaments pour la chimiothérapie ciblant le mélanome. En mesurant la radioactivité du ¹³¹ I, les comportements in vitro et in vivo de FA-PLP- ¹³¹ J'ai étudié les nanoparticules. Le FA-PLP- ¹³¹ obtenu J'ai montré une grande dispersité et une stabilité colloïdale et radiomarquée. Les nanoporteurs témoins, PL- ¹³¹ Moi, et FA-PL- ¹³¹ J'ai également montré une bonne biocompatibilité. Après encapsulation de PTX, FA-PLP- ¹³¹ J'étais le plus efficace pour supprimer la prolifération des cellules B16F10 sans cytotoxicité, attribuée à l'effet de ciblage FA. De plus, FA-PLP- ¹³¹ Il a été démontré que je prolonge considérablement la circulation sanguine de la PTX et s'accumule efficacement dans la région tumorale ciblée. Ainsi, FA-PLP- ¹³¹ J'ai eu une excellente inhibition de la croissance tumorale et une grande biocompatibilité in vivo. Les résultats mettent en évidence le potentiel prometteur de ces polyvalents FA-PLP- ¹³¹ I nanocarriers en tant qu'agents fiables de suivi des médicaments ainsi que leur application dans la thérapie ciblée contre les tumeurs.