Nouvelle thérapie chimio-photothermale dans le cancer du sein utilisant des nanoparticules d'acide folique conjuguées Au@SiO2 chargées de méthotrexate

Introduction

Le cancer du sein (BC), en tant que femme la plus fréquente, affectant le cancer a récemment rapporté avec 1,7 million de nouveaux cas dans le monde [1]. En raison de son étiologie compliquée et de sa faible réponse au traitement, souvent connue pour être la cause centrale des décès de femmes associés au cancer dans le monde [2,3,4,5]. Aux États-Unis, environ 40 000 femmes mourraient de façon prévisible de la Colombie-Britannique en 2014 [2, 6, 7] « (www.cancer.org) ». Avec les 522 000 décès au total, il s'agit de la cinquième cause de décès par cancer avec environ 800 000 cas dans les régions moins développées et à peu près la même fréquence dans les régions développées [1]. Dans les pays asiatiques, l'âge de début le plus élevé se situe chez les adultes de 40 ou 50 ans en comparaison avec les pays occidentaux qui est fréquent chez les 60-70 ans [8]. Les principaux facteurs de risque de BC sont le sexe féminin, les antécédents familiaux, l'âge et des tendances génératives variables, telles que le premier accouchement à l'âge de plus de 30 ans, les premières règles et la ménopause plus tardive, et la nulliparité [9].

L'objectif principal de la lutte contre le cancer est de développer des plans thérapeutiques efficaces avec de faibles toxicités et des spécificités élevées pour éliminer les tumeurs, principalement leurs métastases, et favoriser leur prévention des récidives. Mais les approches de traitement du cancer actuellement utilisées, telles que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, ont montré divers effets secondaires [10,11,12] et toutes n'atteignent pas cet objectif [13, 14]

Les dernières décennies ont été marquées par des luttes majeures dans le traitement du cancer [15, 16]. Entre les approches thérapeutiques populaires actuelles, la thérapie thermale s'est développée en tant que méthode de traitement prospective [17]. Récemment, la thérapie photothermique (PTT), en tant que thérapie anticancéreuse potentiellement efficace et non invasive, a attiré une attention considérable [18, 19]. Le PTT basé sur des nanostructures photo-absorbantes est devenu une voie différente des méthodes générales [20, 21]. Dans un PTT typique, qui utilise des agents PTT pour détruire la tumeur en obtenant suffisamment d'hyperthermie (42 ° C) sous irradiation laser (lumière proche infrarouge (NIR) dans la plage de 700 à 1100 nm), a été étudiée comme un moyen très précis et méthode négligeablement invasive de traitement du cancer [22,23,24,25,26,27,28].

Un certain nombre de nanoparticules ont été largement étudiées en tant qu'agents de contraste d'imagerie, vecteurs d'administration de médicaments et transformateurs de modalités énergétiques telles que le laser, les ondes radio et les ultrasons, en phénomènes thermiques responsables d'effets thérapeutiques [29,30,31,32,33 ,34,35,36,37,38,39].

Les nanoparticules d'or ont attiré une grande attention au cours de la dernière décennie en raison de leur forte résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) et de leur conjugaison de surface facile avec des biomolécules [40]. Ils ont révélé une capacité de conversion photothermique haute performance dans la zone NIR [41,42,43] sans effets secondaires nocifs dans les systèmes biologiques [44].

Bien que les nanoparticules d'or aient été reconnues comme un photo-synthétiseur prometteur, mais en raison de leur faible stabilité photothermique lors d'une irradiation NIR répétitive, les nanoparticules d'or perdent progressivement leur capacité de conversion photothermique qui limitait leur utilisation en pratique clinique. De plus, les nanoparticules d'or ne sont pas non plus de bons vecteurs de médicaments en raison de leur faible capacité de charge médicamenteuse et de leur profil de libération contrôlée des médicaments [45, 46]. Alternativement, la nanoparticule de silice mésoporeuse (MSN) était connue pour être un vecteur approprié de médicament, d'ADN et de protéine en raison de sa capacité de chargement de médicament plus élevée et de l'absence de contenu toxique résultant de ses dégradations. Ils ont également une grande surface, une taille contrôlable, un volume de pores hautement disponible et les caractéristiques de surface souhaitées s'appliquent pour une modification [47].

Les nanoparticules après conjugaison à un agent chimiothérapeutique et à un ligand ciblant le cancer peuvent inhiber les inconvénients de la chimiothérapie de routine, tels que l'administration non spécifique, une faible solubilité dans l'eau et de faibles indices thérapeutiques [48, 49].

Les agents présentant des propriétés chimiothérapeutiques tels que la doxorubicine, le cyclophosphamide, le méthotrexate, le fluorouracile et le docétaxel sont utilisés seuls ou en combinaison comme principaux traitements de base, ou aidés avec d'autres traitements comme le PTT. La plupart des patients cancéreux subissent des effets indésirables des médicaments de chimiothérapie en raison de leur distribution non précise dans le corps du patient qui affecte tous les organes. Ces médicaments endommagent certaines des cellules normales à croissance rapide, par exemple les cellules sanguines, les cellules des muqueuses recouvrant les organes internes et les follicules pileux [50,51,52,53].

Le méthotrexate (MTX) a été le médicament le plus fréquemment utilisé pour la polyarthrite rhumatoïde et plusieurs types de tumeurs telles que la peau, les poumons, la tête et le cou et le sein [54, 55]. Il inhibe la dihydrofolate réductase (DHFR), l'enzyme contribuant à la production de tétrahydrofolate et de ses sous-produits qui sont nécessaires à la synthèse du thymidylate et de la purine et qui sont tous deux essentiels à la croissance et à la prolifération cellulaires. Par conséquent, le blocage du méthotrexate de DHFR empêche la synthèse de 4 macromolécules de base ADN, ARN, thymidylates et protéines [56].

Malheureusement, comme pour la plupart des agents PTT conventionnels, le principal défi est d'atteindre une accumulation sélective de GNP dans le tissu cible après injection systémique [57,58,59]. La thérapie ciblée contre le cancer permet l'administration d'un médicament chimiothérapeutique à des cellules cancéreuses spécifiques tout en diminuant l'exposition des cellules saines normales. Cela nous a conduit à administrer une plus grande dose de médicament aux cellules cancéreuses avec une toxicité systémique plus faible. Les nanoparticules ciblées par le ligand sont des marqueurs de cellules cancéreuses précisément identifiés, qui sont fortement exprimés à la surface des cellules cancéreuses [40].

L'acide folique (folate ou vitamine B9) est un matériau clé pour la croissance cellulaire et le métabolisme. En raison de la grande affinité du folate pour les protéines réceptrices du folate, il est utilisé comme élément pour le ciblage du cancer. Le récepteur du folate, en tant que biomarqueur tumoral, est surexprimé dans certaines cellules malignes comme le cancer du sein, de l'ovaire, du poumon, du rein, du cerveau et du côlon [60]. Les systèmes d'administration de médicaments conjugués au folate améliorent l'absorption cellulaire du médicament par endocytose [61].

Matériaux et méthode

Réactifs et matériels

Nous avons utilisé de l'eau bidistillée (Ghazi Company, Tabriz, Iran) et des réactifs chimiques de qualité analytique pour nos expériences. Un certain nombre de réactifs ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Company, notamment :l'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS, 98 %), le (3-mercaptopropyl) triméthoxysilane (MPTES, pureté de 95 %), l'acide folique et la rhodamine B. Un groupe de matériaux a été acheté auprès de Merck. Co :acide chlorhydrique (HCl, 37 %), solution d'ammoniac (25 %), toluène hydroxyde de sodium (NaOH, 98 %) et autres solvants. MTX a été acheté à Zahravi Farma Company, Tabriz, Iran.

Instrumentation

Dans cette étude, pour analyser la taille et la morphologie des particules, la microscopie électronique à transmission (MET) (LEO 906, Allemagne) a été utilisée. Nous avons préparé environ 100μL de nos nanoparticules en suspension dans une solution aqueuse à température ambiante. La solution a été transférée sur un film de carbone revêtu sur une grille de cuivre de TEM avec lyophilisation ultérieure et observée à 80KV. La détermination de la taille des particules a été effectuée par mesure DLS (diffusion dynamique de la lumière) à 25 °C en utilisant un Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni. Les mesures du potentiel Zeta pour les NP préparées ont été effectuées par spectroscopie de corrélation de photons (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, Royaume-Uni). Un spectrophotomètre UV-Vis à double faisceau (UV-1601 PC modèle SHIMADZU, Kyoto, Japon) a été utilisé pour mesurer l'absorbance par une cuvette en quartz de 700μL ayant une longueur de trajet de 10 mm. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) du spectromètre Bruker Tensor 27, Allemagne a été utilisée pour l'exécution de la méthode des pastilles de KBr. Les mesures de pH ont été effectuées avec un pH-mètre Metrohm 713 (Herisau, Suisse). L'agitateur mécanique Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Allemagne) a été utilisé pour les agitations. L'efficacité d'encapsulation du FA et du MTX a été calculée à l'aide du système HPLC constitué du module de séparation Waters 2690 équipé d'un détecteur UV-vis Waters 2500 Pump 1000 (Waters, Milford, MA). La séparation chromatographique a été réalisée à température ambiante en utilisant des colonnes de chromatographie Bondapak C18 m (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Irlande).

Préparation de Au@SiO₂ Nanoparticules

Le SiO₂ Les NP ont été synthétisées sur la base de la méthode sol-gel rapportée précédemment [62, 63]. Dans l'étape suivante, des nanoparticules recouvertes de silice à fonction thiol (TFSNP) ont été préparées selon la méthode mentionnée dans notre étude précédente [64]. Les nanoparticules d'Au ont été produites par une méthode de réduction au citrate (méthode de Turkevich) [65]. Enfin, la surface des TFSNPs a été couverte par des AuNPs. Au début, les TFSNP ont été dispersés dans l'eau à l'aide du sonicateur de bain pendant au moins une heure et ajoutés à la solution d'AuNPs et soniqués pendant 30 minutes supplémentaires. La réaction a été effectuée à l'obscurité pendant deux jours sous agitation dynamique à 25°C. L'Au@SiO₂ des nanoparticules d'aspect violet ont été collectées par centrifugation (10000 rpm, 10 min) et séchées dans une étuve à vide.

Chargement MTX et FA

MTX ainsi que FA ont été chargés dans le Au@SiO₂ nanosupport comme suit :du MTX (10 mg) a été ajouté à une suspension bien dispersée de 10 ml de nanosupport dans du PBS (5 mg/ml, pH 7,4) et agité modérément à température ambiante pendant un jour dans des conditions sombres. Le MTX a chargé Au@SiO₂ nanosupport a été recueilli par centrifugation. Le surnageant a été collecté pour la mesure du MTX non chargé. Puis MTX a chargé Au@SiO₂ le nanosupport a été dispersé dans du PBS (5 mg/ml, pH 7,4) et du FA (10 mg) ont été ajoutés à la solution et agités modérément à température ambiante pendant un autre jour dans des conditions d'obscurité. Le FA-MTX a chargé Au@SiO₂ nanocarrier a été recueilli par centrifugation et le surnageant a été séparé pour le calcul de FA non lié dans l'étape finale. Le FA-MTX a chargé Au@SiO₂ nanocarrier a été lyophilisé et stocké pour les prochaines expériences. Les quantités de MTX et de FA non liés ont été calculées en utilisant la méthode HPLC par protocole rapporté précédemment [66]. L'acide folique a été dissous dans de l'hydroxyde d'ammonium (10 %) et dilué avec la phase mobile. Le temps de rétention pour le MTX et l'acide folique était de 10,5 et 5,95 min, respectivement. Des échantillons en triple ont été appliqués. L'efficacité de chargement du médicament (DLE) a été calculée par les formules suivantes :

Sélection et culture des lignées cellulaires

Deux lignées cellulaires d'intérêt du cancer du sein avec des niveaux d'expression de surface rapportés pour le récepteur du folate (FR) [67], y compris MCF-7 et MDA-MB-231, ont été sélectionnées et achetées auprès de la Pasteur Cell Bank (Téhéran, Iran) pour les études de cytotoxicité. Les lignées cellulaires sélectionnées ont été cultivées dans un milieu complet contenant du RPMI1640 (thermoscientifique), 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de Penstrep (thermoscientifique) dans des conditions thermiques et atmosphériques de 37 °C, 5 % de CO_{2 , et 95% d'humidité.}

Test de cytotoxicité cellulaire

Des tests de viabilité cellulaire ont été effectués pour mesurer la prolifération cellulaire après différents traitements NPs sans irradiation laser. En bref :les cellules MCF-7 ou MDA-MB-231 ont été étalées dans 96 microplaques avec une densité cellulaire de 1,5×10 ⁴ pendant 24 h, puis les cellules ont été traitées avec du MTX, Au@SiO₂ et FA-MTX chargé Au@SiO₂ NPs. Les cellules sans traitement ont été considérées comme témoins. A l'étape suivante, le colorant tétrazolium MTT (Sigma) à des concentrations finales de 5 g/ml a été ajouté aux cellules et incubé à 37°C pendant 4 h. Ensuite, la solution de MTT a été retirée et les cristaux de Furmazan déposés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) (BioIdea, Iran) sous agitation douce pendant 10 min. Enfin, l'absorbance a été mesurée à 570 nm par un lecteur ELISA. La viabilité des cellules a été normalisée par rapport aux cellules de contrôle et le bruit de fond a été supprimé par soustraction des mesures à blanc.

Thérapie laser in vitro

Pour la thérapie laser de bas niveau (LLLT), un laser NIR à longueur d'onde de 810 nm (Laser à diode Mustang 2000, Russie) avec une dose de puissance de sortie de 185 mW a été utilisé pour la destruction des cellules cancéreuses. Au début des cellules MCF-7 et MDA-MB 231 avec une densité cellulaire de 1,5×10 ⁴ traité avec l'Au@SiO₂ et FA-MTX chargé Au@SiO₂ Les NP ont ensuite été exposées à une irradiation laser avec différentes doses laser (30, 60, 75, 90 et 105 J/cm ² ) et temps d'exposition fixe (139 sec). Les cellules exposées uniquement à une irradiation laser (sans NPs) et les cellules sans NPs et traitements laser considérés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. Après 24 h d'irradiation laser, la viabilité cellulaire a été mesurée par la méthode de dosage MTT [64].

Test d'absorption cellulaire de nanoparticules

Une vérification détaillée de l'internalisation des cellules NPs est essentielle afin de confirmer l'effet spécifique du nanocarrier modifié en surface pour chaque lignée cellulaire. Dans le présent travail, nous avons utilisé à la fois la cytométrie en flux comme la microscopie quantitative et à fluorescence pour le contrôle qualitatif de l'absorption des NP par les lignées cellulaires MCF-7 et MDA-MB-231.

Pour la suspension des NP, la solution de rhodamine B (RhoD) dans du PBS a été ajoutée sous agitation pendant 24 h à température ambiante et en chambre noire (évitant le blanchiment). Ensuite, les NP chargées de RhoD ont été séparées par un filtre Amicon avec une limite de poids moléculaire nominal (NMWL) de 30 kDa et centrifugées pendant 15 min à 5000 rpm et lavées avec du tampon PBS pour éliminer le RhoD non lié. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à la densité de 5×10 ⁵ par puits et laisser atteindre la confluence. Les cellules ont été traitées avec des NP chargées de Rhodamin B pendant 30, 90 et 180 minutes, les cellules non traitées servant de contrôle. Ensuite, les cellules ont été trypsinisées et lavées avec du PBS, puis la fluorescence a été quantifiée par analyse par cytométrie en flux (cytomètre en flux BD Biosciences FCASCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, USA). L'absorption intracellulaire de NP ou de NPD marqué à la rhodamine B a été confirmée par microscopie à fluorescence. Les cellules MCF-7 et MDA-MB-231 ont été cultivées sur des lamelles et après 24 h, les cellules ont été traitées avec Au@SiO₂ libre. NPs et MTX-FA chargés Au@SiO₂ NPs. Après incubation pendant 30, 90 et 180 minutes, les cellules ont été lavées avec du PBS et des absorptions de nanosupports marqués à la rhodamine B ont été observées à l'aide d'un microscope à fluorescence (Olympus microscope Bh2-FCA, Japon).

Etude d'apoptose par microscopie à fluorescence

Une méthode pour l'étude qualitative nucléaire de l'apoptose est un colorant fluorescent DAPI qui se lie à l'ADN et est détectable au microscope approprié. Nous avons utilisé un protocole comme précédemment rapporté pour la coloration DAPI [68], sous peu :les cellules MCF-7 ou MDA-MB-231 ont été étalées dans des récipients au format 6 puits à une densité de 5 × 10 ⁵ et laissez-les s'attacher et grandir pendant 24 heures. Après traitement au MTX, Au@SiO₂ NPs et MTX-FA chargés Au@SiO₂ NPs avec et sans traitement laser, les cellules ont été lavées avec du PBS (Sigma) puis soumises à une fixation par 10 % de formaldéhyde (Merck), ensuite :les cellules ont été perméabilisées avec du Triton X-100 (Sigma) pendant 15 minutes. Après des lavages appropriés, les cellules ont été colorées avec du DAPI (sigma) pendant 5 min. Enfin, les noyaux apoptotiques (fragmentés ou ridés) ont été visualisés par un Microscope à Fluorescence (Olympus). Les cellules sans aucun traitement ont été considérées comme contrôle négatif et les cellules n'ont reçu qu'une irradiation laser comme contrôle positif.

Enquêtes sur les perturbations du cycle cellulaire

Les distributions du cycle cellulaire MCF-7 et MDA-MB-231 ont été déterminées par analyse de cytométrie en flux. De cette façon, les cellules ont été ensemencées avec des populations de départ de 5 × 10 ⁵ et permis d'atteindre 80% de confluence. Par la suite, les cellules traitées au MTX, Au@SiO₂ NPs et MTX-FA chargés Au@SiO₂ Des NP avec et sans irradiation laser ont été réalisées. Les cellules sans aucun traitement ont été considérées comme contrôle négatif et les cellules n'ont reçu qu'une irradiation laser comme contrôle positif. Ensuite, les cellules ont été récoltées par trypsinisation suivie de lavages PBS appropriés. Ensuite, les cellules ont été fixées par l'éthanol (Merck) pendant 48 heures. À l'étape suivante, les cellules fixées ont été lavées, puis traitées avec de la ribonucléase A (Cinaclone), avec addition ultérieure d'iodure de propidium (PI) (Sigma) à l'obscurité. Les signaux de fluorescence ont été détectés par un ensemble FACS de Beckton Dicinson Company.

Statistiques de l'étude

Les expériences pour chaque étape ont été réalisées en trois répétitions et les résultats ont été rapportés en moyenne ± SD. L'ANOVA a été utilisée pour la comparaison de la signification entre les groupes. Les différences reflétaient les significations lorsque la valeur de probabilité était calculée <0,05 par le logiciel SPSS.

Résultats et discussion

Caractérisation des NPs synthétisés

L'Au@SiO₂ NPs a été produit en quatre étapes :1-synthèse de SiO₂ nanoparticules, 2-addition d'un linker contenant du thiol aux NPs SiO2, 3-synthèse de nanoparticules d'or et 4-fixation des nanoparticules d'or à la surface des complexes SiO2-linker (Fig. 1). La synthèse réussie de Au@SiO₂ a été confirmée par FTIR (Fig. 2a). Le pic Si-O-Si est apparu vers 1088 cm ^-1 . Un large pic à 3000-3700 et 803 cm ^-1 est attribué à l'étirement et à la flexion hors du plan des groupes O-H libres de silanol, respectivement. La vibration d'étirement C–H aliphatique a été montrée comme un pic fort à 2950 cm ^–1 . Le C–O de trois groupes méthoxy silane a été montré par un pic à 1191 cm ^–1 .

Le schéma de synthèse par étapes pour la préparation d'Au@SiO₂ biocompatible chargé en folate et en méthotrexate nanoparticules NPs

un ) Spectres FTIR de Au@SiO₂ nanoparticules, b ) distribution de taille de FA-MTX conjugué Au@SiO₂ NPs mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) c ) Le potentiel zêta de Au@SiO₂ et FA-MTX conjugué Au@SiO₂ NPs mesurées par diffusion dynamique de la lumière (DLS) à pH=7,4 et T=25 °C, d ) Chromatogramme de MTX et FA non chargés séparés de FA-MTX conjugué Au@SiO₂ NP mesuré simultanément par méthode HPLC

Les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont indiqué que FA-MTX conjugué Au@SiO₂ La taille des NP était de l'ordre du nanomètre (105 ± 2,3 nm) avec une distribution de taille étroite (Fig. 2b).

Le potentiel zêta est un paramètre physico-chimique important qui influence la stabilité des nanosuspensions. Des valeurs de potentiel zêta extrêmement positives ou négatives provoquent des forces de répulsion plus importantes. D'autre part, la charge élevée des particules, qu'elles soient positives ou négatives, entraîne l'absorption des NP par les phagocytes du foie et leur élimination par le corps. Dans le cas d'une stabilisation électrostatique et stérique combinée, un potentiel zêta minimum de ± 20 mV est souhaitable [69,70,71]. Les données de potentiel zêta des NP ont été comparées avant et après le chargement avec le MTX-FA à pH =7,4 et T =25 °C (Fig. 2c). Les potentiels zêta obtenus de Au@SiO₂ Les NP étaient de +13,3 mV qui, après une double charge de médicament, ont diminué à -19,7 mV, ce qui se situait dans la plage souhaitable. Le MTX et le FA avaient une charge nette négative à pH (7,4) au-dessus de son pka (3,8 et 4,8, 3,5 et 4,3), en raison de la déprotonation de deux groupes acide carboxylique dans sa structure ([72], https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). Par conséquent, après chargement simultané de MTX et FA sur Au@SiO₂ NPs, la charge nette est devenue négative.

L'analyse MET fournit la taille de particule individuelle définie. La nanoparticule d'Au a été vue sous forme de sphères sombres dispersées sur les NP de SiO2 sous la forme d'une couche grise. Les images MET ont confirmé que les nanoparticules Au@SiO2 ont été synthétisées avec une forme sphérique homogène dans laquelle la taille moyenne des particules était d'environ 25 nm (Fig. 3).

Image TEM de Au@SiO₂ nanoparticules

Chargement de médicaments

Ici, le folate médie l'augmentation de l'absorption des GNP dans certains types de cellules cancéreuses qui surexpriment le récepteur du folate par endocytose médiée par le récepteur pour dépasser la faible efficacité de l'internalisation des GNP, par conséquent le récepteur du folate connu comme marqueur tumoral et l'utilisation du folate de plus en plus pour la tumeur ciblage [67, 73].

Après conjugaison des molécules MTX et FA en Au@SiO₂ NPs, le potentiel zêta est passé de +13,3 à -19,7 mV. Les valeurs estimées de pKa des deux fractions acide carboxylique du MTX sont de 3,8, 4,8 et FA est de 3,5 et 4,3 [72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Par conséquent, en raison de la déprotonation de deux groupes acide carboxylique de MTX et FA à un pH de 7,4 qui est supérieur à leur pka, la charge nette est devenue négative et indique la conjugaison réussie de MTX et FA sur Au@SiO₂ NPs. De Ying Tian et al montre que les charges de MTX sur les nanoparticules d'Au de 18 et 30 mm de diamètre sont respectivement de 15 ± 0,4 % et 10 ± 1,0 % [74]. Dans cette étude, FA et MTX ont été chargés dans des NP Au@SiO2 avec une efficacité d'encapsulation de 22,6 et 77,5 %, respectivement. Le chromatogramme du pic d'évaluation simultané de MTX et de FA est illustré à la figure 2d.

Captation cellulaire

Étant donné que les agents photothermiques intracellulaires peuvent améliorer l'efficacité de la thérapie photothermique du cancer [75], on pense que l'internalisation cellulaire des matériaux photothermiques est nécessaire. In vitro Le test d'absorption cellulaire a été réalisé en utilisant des cellules MDA-MB-231 de cancer du sein humain, connues pour surexprimer fortement le récepteur du folate [40]. Etudier le rôle de l'AF en tant qu'agent de ciblage et l'efficacité du revêtement de surface sur l'absorption de l'Au@SiO₂ Les NP par les cellules cibles, les cellules MCF-7 et MDA-MB-231 ont été traitées avec des NP Au@SiO2 et des NPs Au@SiO2 chargées par MTX-FA. Les résultats d'intensité fluorescente moyenne de l'absorption cellulaire ont été présentés sur la figure 4. Les résultats ont montré que l'absorption des NPs Au@SiO2 dans MCF-7 et MDA-MB-231 a augmenté au cours du temps de culture cellulaire pour tous les échantillons (Figs. 4 et 5 ). En outre, après la décoration de la surface des NP Au@SiO2 avec MTX et FA, l'absorption des cellules a augmenté de manière significative à la fois sur MCF-7 et MDA-MB-231 en tant que cellules exprimant le récepteur du folate. L'absorption des NP Au@SiO2 chargées en MTX-FA dans les cellules MDA-MB-231 était supérieure à celle du MCF-7. Étant donné que les cellules MDA-MB-231 expriment des niveaux plus élevés de récepteurs folate de surface, une grande partie des NP ciblées par les récepteurs folate a été introduite via un mécanisme d'endocytose à médiation par le récepteur, ce qui a entraîné une absorption cellulaire plus élevée. Dans une autre étude, l'internalisation cellulaire accrue des NP conjuguées au folate se produit uniquement dans les cellules cancéreuses qui surexpriment l'aHFR et non dans les cellules saines qui ont moins d'expression à la surface cellulaire des aHFR [40]. La conjugaison des NP Au@SiO2 avec l'AF peut faciliter l'absorption cellulaire des NP et du méthotrexate, entraînant une toxicité accrue envers les cellules MDA-MB-231 [76].

Dosage quantitatif d'absorption cellulaire de Au@SiO₂ marqué à la rhodamine B nanoparticules (NP) ou MTX-FA marqué à la rhodamine B chargé Au@SiO₂ nanoparticules (NPD) dans MCF-7 (a ) et MDA-MB-231(b ) lignées cellulaires pour des durées d'exposition de 0,5h, 1,5h et 3h obtenues par cytométrie en flux. Des cellules non traitées des deux lignées cellulaires ont été utilisées comme contrôle négatif. c Comparaison de l'intensité de fluorescence moyenne de Au@SiO₂ marqué à la rhodamine B nanoparticules (NP) ou MTX-FA marqué à la rhodamine B chargé Au@SiO₂ nanoparticules (NPD) pour des durées d'exposition de 0,5h, 1,5h et 3h obtenues par cytométrie en flux

Un Dosage qualitatif d'absorption cellulaire utilisant Au@SiO₂ marqué à la Rhodamine B nanoparticules (NP) dans MCF7 avec des durées d'exposition de 30 (a ), 90 (b ) et 180 (c ) min ou MTX-FA marqué à la rhodamine B chargé Au@SiO₂ nanoparticules (NPD) avec des durées d'exposition de 30 (d ), 90 (e ) et 180 (f ) min et (B ) Dosage qualitatif d'absorption cellulaire à l'aide d'Au@SiO₂ marqué à la Rhodamine B nanoparticules (NP) dans MDA-MB-231 avec des durées d'exposition de 30 (a ), 90 (b ) et 180 (c ) min ou MTX-FA marqué à la rhodamine B chargé Au@SiO₂ nanoparticules (NPD) avec des durées d'exposition de 30 (d ), 90 (e ) et 180 (f ) min capturé par microscopie fluorescente

Test de cytotoxicité

Etudes de cytotoxicité cellulaire in vitro du MTX libre, blanc Au@SiO₂ NPs et MTX-FA conjugués Au@SiO₂ Les NP ont été évaluées par dosage MTT pendant 24, 48 et 72 h (Fig. 6). Les résultats du test MTT ont montré que Au@SiO₂ Les NP n'ont eu aucun effet cytotoxique sur les lignées cellulaires MCF-7 et MDA-MB-231. De plus, pour comparer les effets de cytotoxicité du MTX libre et du MTX-FA conjugué Au@SiO₂ NPs, la même concentration de MTX (25, 50, 100 et 200 g/mL) a été utilisée pour toutes les durées de traitement. Les résultats de cytotoxicité cellulaire indiquent que le MTX libre ou le MTX-FA conjugué Au@SiO₂ Les NP ont montré un taux de mortalité d'environ 10 à 25 % dans les deux lignées cellulaires après 24 heures de traitement. Des études antérieures ont rapporté l'effet prolifératif des nanoparticules d'or sur différentes lignées cellulaires comme les cellules ostéoblastiques murines MC3T3-E1 et les cellules souches du ligament parodontal humain dans des conditions in vitro. Nos résultats sont en accord avec ces études et les figures 6a et b ont montré l'effet prolifératif des nanoparticules libres Au@SiO2. Par conséquent, l'effet cytotoxique égal des nanoparticules de MTX et de FA-MTX chargées d'Au@SiO2 (NPD) peut être dû à ce phénomène [77, 78].

un MCF-7 et (b ) Taux d'inhibition de la croissance des cellules MDA-MB-231 après traitement avec différentes concentrations de NP, MTX et FA-MTX chargées Au@SiO₂ nanoparticules (NPD) après un temps d'exposition de 24, 48 et 72h

Irradiation laser

Dans cette étude, la viabilité cellulaire des cellules MCF-7 et MDA-MB 231 traitées avec Au@SiO₂ NPs et MTX-FA chargés Au@SiO₂ NPs après irradiation laser avec une dose comprise entre 30 et 105 J/cm ² a été étudiée par le test MTT. Le taux de mortalité des cellules MCF-7 et MDA-MB-231 traitées avec du MTX-FA chargé Au@SiO₂ NPs (la concentration en MTX était de 100 g/mL) après LLLT à la dose de 75 J/cm ² étaient respectivement d'environ 39 et 45,5%. Alors qu'au même état les cellules traitées avec Au@SiO₂ Les NP après irradiation laser ou laser seul n'ont pas montré de mort cellulaire évidente. Également en augmentant la dose laser à 105 J/cm ² le taux de mortalité des deux lignées cellulaires a augmenté à 60-75%, tandis que les deux lignées cellulaires ont été traitées avec Au@SiO₂ Les NPs + laser ou laser seul à la même dose d'irradiation n'ont montré aucun effet cytotoxique. La valeur IC50 pour les cellules MCF-7 et MDA-MB-231 après une thérapie combinée avec du MTX-FA chargé Au@SiO₂ Les NPs (dose MTX de 100 g/mL) et LLLT ont été obtenues à la dose de 90 et 75 J/cm ² , respectivement. D'autre part le taux de mortalité du MTX et du MTX-FA chargé Au@SiO₂ Les NP sans irradiation laser à une dose de MTX de 100 g/mL (dose sélectionnée pour l'étude de thérapie au laser) se situaient entre 15 et 25 % dans les deux lignées cellulaires. Ces résultats ont indiqué que la combinaison de MTX-FA a chargé Au@SiO₂ Les NP et la thérapie au laser ont montré un effet synergique dans les deux lignées cellulaires et ont considérablement diminué la viabilité cellulaire (p <0,001) par rapport aux cellules n'ayant reçu qu'une irradiation laser. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).

A comparison of cell growth inhibition rates exposed to different laser powers (30, 60, 75, 90 and 105 J/cm ² ) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h

Apoptosis study by DAPI

The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO₂ NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO₂ NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO₂ NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO₂ NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm ² , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO₂ NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.

Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )

Cell cycle

Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO₂ NPs and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs either in combination with LLLT (75 J/cm ² ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm ² laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.

Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cells. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution

Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.

Conclusions

In this study MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO₂ nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.

Disponibilité des données et des matériaux

Not applicable

Abréviations

Au@SiO₂ :

Silica coated gold

BC:

Breast cancer

DHFR:

Dihydrofolate reductase

DMSO :

Dimethyl Sulfoxide

FA :

Folate

LLLT:

Low level laser therapy

LSPR :

Résonance plasmonique de surface localisée

MSN:

Mesoporous silica nanoparticle

MTX:

Methotrexate

NIR :

Proche infrarouge

NP :

Nanoparticules

PTT :

Thérapie photothermique

RhoD:

rhodamine B

TFSNPs:

Thiol-functionalized silica-coated nanoparticles