Nanoparticules Au Nanocage@PEG hautement biocompatibles : un nouvel agent de contraste CT pour une imagerie in vivo améliorée

Résumé

Ces dernières années, les agents de contraste ont été largement utilisés en imagerie médicale pour améliorer la qualité des images. Les nanoparticules offrent une capacité de détection in vivo supérieure aux agents de contraste moléculaires conventionnels. Dans cette étude, un nouveau type de nanoparticules Au nanocages@PEG (AuNC@PEG) doté d'un fort coefficient d'absorption des rayons X a été synthétisé comme agent de contraste pour l'imagerie par tomodensitométrie (TDM). Les résultats montrent que les AuNC@PEG présentent une bonne dispersibilité aqueuse, une faible cytotoxicité et une forte capacité d'absorption des rayons X. De plus, les études in vivo révèlent que les AuNC@PEG synthétisés offrent une amélioration de contraste évidente, un long temps de circulation dans le sang et une toxicité négligeable in vivo. Par conséquent, les AuNC@PEG fonctionnalisés synthétisés dans cette étude présentent un grand potentiel d'application clinique en imagerie TDM.

Introduction

La tomodensitométrie (TDM) est devenue la technique d'imagerie diagnostique la plus couramment utilisée en milieu clinique, avec une large application dans l'étude de divers tissus humains. Grâce à son fort pouvoir de pénétration, son contraste élevé et son traitement d'image relativement simple, la TDM est considérée comme la technique d'imagerie diagnostique non invasive la plus puissante du système médical moderne [1, 2]. Cependant, lors de l'imagerie, il n'existe pas de contraste naturel entre la lésion et certaines structures environnantes. Un agent de contraste — substance à densité relativement plus élevée ou plus faible — doit donc être utilisé pour distinguer la structure, le tissu ou l'organe cible. Cette substance présente des capacités d'absorption variables selon les tissus et peut être observée par irradiation aux rayons X dans les tissus mous. L'utilisation de certaines molécules et de plusieurs agents de contraste microparticulaires en imagerie TDM a été évaluée [3-5].

Actuellement, l'agent de contraste le plus utilisé pour la TDM est une molécule organique contenant de l'iode. Les molécules iodées, telles que l'ion iodure ou les préparations non ioniques, sont largement employées comme agents de contraste en TDM en pratique clinique. Bien qu'elles offrent une bonne amélioration du contraste, elles présentent un taux de clairance rénale rapide, un temps de circulation court dans l'organisme et des propriétés allergéniques, ce qui limite considérablement leurs applications [6, 7]. En raison de l'élimination rapide de l'agent iodé, la fenêtre temporelle efficace pour l'imagerie du pool sanguin est sérieusement limitée, rendant difficile l'obtention d'images à haut contraste. De plus, l'élimination rapide d'une forte dose de médicament peut avoir des effets secondaires potentiels sur les reins [8, 9].

Au cours de la dernière décennie, l'application des nanoparticules en biomédecine, notamment en imagerie diagnostique, a suscité un intérêt considérable [10]. Comparées aux agents de contraste à base d'iode, les nanoparticules possèdent des charges de caractéristiques de contraste que les petites molécules n'ont pas, ainsi qu'une taille, une forme et une surface spécifiques [11, 12]. En général, les nanoparticules à numéro atomique élevé, comme l'or, l'argent et d'autres nanoparticules métalliques, ont un excellent coefficient d'absorption des rayons X, conférant une capacité d'amélioration de contraste remarquable [13, 14]. Parmi celles-ci, les nanoparticules d'or se sont rapidement développées en biomédecine et sont considérées comme des substituts aux agents d'imagerie à base d'iode en raison de leur inertie biologique significative et de leur facilité de synthèse et de modification de surface [15-17]. Les nanoparticules d'or offrent un temps de circulation sanguine plus long, un risque de néphrotoxicité plus faible et un coefficient d'absorption des rayons X plus fort que les composés d'iode. Par conséquent, une dose réduite peut être administrée, diminuant le risque d'effets secondaires [18]. Plusieurs nanoparticules d'or, notamment les nanosphères, nanobâtonnets et nanoétoiles, ont été largement utilisées comme agents de contraste pour l'imagerie TDM [19, 20] avec des résultats prometteurs. Parmi les diverses nanostructures d'or, les nanocages d'or (AuNC) possèdent une structure creuse interne et une paroi poreuse mince, leur conférant une surface spécifique plus élevée et une capacité d'imagerie TDM plus efficace que d'autres nanoparticules d'or de morphologies différentes [21, 22]. Ces dernières années, les AuNC ont été utilisés comme amplificateurs de contraste pour la tomographie par cohérence optique et la tomographie photoacoustique, démontrant de bonnes performances. En raison de leur grande surface d'absorption, ils sont également des transducteurs photothermiques efficaces [23, 24]. À notre connaissance, peu d'études ont évalué l'utilisation des AuNC comme agents de contraste pour la TDM. Sur la base de ces travaux, nous avons exploré davantage l'utilisation des AuNC comme agents de contraste TDM. L'application des nanoparticules en imagerie TDM nécessite des surfaces biocompatibles et biologiquement actives. Le polyéthylène glycol (PEG) est un polymère biodégradable et biocompatible, également utilisé comme matériau « furtif » pour prévenir la capture par le système réticulo-endothélial (RES) et améliorer la biocompatibilité, la capacité d'élimination rénale et le temps de circulation sanguine ; ainsi, les nanoparticules PEGylées peuvent être retenues dans le sang pendant une longue période [15, 25-28].

Dans cette étude, de nouveaux AuNC@PEG ont été préparés et caractérisés. La biocompatibilité in vitro des AuNC@PEG a été évaluée par colorimétrie MTT, méthode de fuite de lactate déshydrogénase (LDH), dosage des espèces réactives de l'oxygène (ROS) intracellulaires, coloration Calcein-AM/PI et d'autres techniques expérimentales. Par ailleurs, des analyses hématologiques et histologiques ont été réalisées pour déterminer la toxicité des AuNC@PEG in vivo. Les résultats montrent que les AuNC@PEG présentent une excellente biocompatibilité in vitro et in vivo. De plus, les AuNC@PEG démontrent une forte capacité d'imagerie TDM in vitro et in vivo. Ces résultats expérimentaux révèlent que les AuNC@PEG synthétisés présentent des avantages évidents : fort contraste, long temps de circulation sanguine et faible risque de néphrotoxicité. Par conséquent, les AuNC@PEG fonctionnalisés synthétisés dans cette étude ont un grand potentiel d'application clinique en imagerie TDM.

Matériaux et méthodes

Matériaux et instruments

Les kits de test LDH et ROS ont été achetés auprès de l'Institut de bio-ingénierie de Nanjing (Chine), et les kits de coloration Calcein-AM/PI auprès de Shanghai Dongren Chemical Technology Co., Ltd. (Chine). Les autres agents chimiques et solvants provenaient de Sigma-Aldrich. Toutes les coupes ont été observées au microscope à fluorescence (DMI4000B, Leica, Wetzlar, Allemagne). Les caractéristiques des nanoparticules synthétisées ont été évaluées par microscopie électronique à transmission (MET). Un scanner TDM spiralé 256 rangées / 512 slices (Philips, Allemagne) a été utilisé, avec les paramètres suivants : épaisseur de coupe 0,625 mm ; tension du tube 100 kVp ; courant du tube 100 mA.

Synthèse des AuNC@PEG

Les nanocages d'or ont été préparés par une simple réaction de remplacement galvanique entre des nanocubes d'argent et une solution de HAuCl₄, selon une étude antérieure [29, 30]. Typiquement, des nanocubes d'Ag de 25 nm préparés dans le glycol éthylène ont servi de modèles pour la synthèse de nanocages d'Au de 30 nm. Ensuite, du SH-PEG (PM ≈ 2000, 10 mg dissous dans 5 mL de tampon phosphate salin (PBS)) a été ajouté à la solution d'AuNC (pH 8,0, 6,55 nM, 6 mL) et agité toute la nuit dans l'obscurité sous protection d'azote. Après trois lavages supplémentaires, les AuNC@PEG ont été dispersés en solution aqueuse.

Évaluation de la toxicité in vitro

La colorimétrie MTT, la méthode de fuite de LDH, le dosage de la concentration en ROS intracellulaires et la coloration Calcein-AM/PI ont été utilisés pour détecter la toxicité des AuNC@PEG synthétisés in vitro. Des cellules HUVEC ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 10⁴ cellules/puits. Le milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin, pénicilline (100 μg/mL) et streptomycine a été utilisé. Les cellules ont été cultivées à 37 °C sous 5 % de CO₂ pendant 12 h. Ensuite, le milieu contenant les AuNC@PEG à différentes concentrations (10, 20, 50, 100, 200, 500 et 1000 μg/mL) a été ajouté pour une culture supplémentaire. Après 24 h, le test MTT a été réalisé. Le milieu de culture sans nanoparticules a servi de témoin pour chaque groupe.

La teneur en lactate déshydrogénase (LDH) libérée par les cellules HUVEC traitées avec les AuNC@PEG à différentes concentrations a été déterminée pour évaluer la toxicité in vitro. Les cellules ont été ensemencées de manière similaire au test MTT, puis traitées avec les AuNC@PEG aux mêmes concentrations pendant 24 h. Le surnageant a été séparé, centrifugé et transféré dans une plaque à 96 puits propre. L'activité de la LDH dans le milieu de culture a été évaluée selon les instructions du fabricant, et l'absorbance a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.

Basé sur le principe de mesure de la concentration intracellulaire en ROS à l'aide du kit ROS, le DCFH a été oxydé en dichlorofluorescéine (DCF), une substance fortement fluorescente verte, en présence de 2',7'-dichlorofluorescéine diacétate (DCFH-DA). Les cellules HUVEC ont été cultivées dans des plaques à 24 puits pendant 12 h, traitées avec les AuNC@PEG à différentes concentrations (50, 100, 200 et 500 μg/mL) pendant 24 h, puis incubées avec DCFH-DA à 37 °C pendant 40 min. Les cellules traitées avec du peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) ont servi de contrôle positif. L'intensité de fluorescence des cellules a été observée au microscope à fluorescence (λex 485 nm ; λem 525 nm). Avant l'évaluation, les cellules ont été lavées trois fois avec un milieu sans sérum et sans glace.

Pour la coloration vivant/mort, les cellules HUVEC ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et cultivées pendant 12 h. Elles ont ensuite été traitées avec les AuNC@PEG à différentes concentrations (10, 20, 50, 100, 200, 500 et 1000 μg/mL) pendant 24 h. Après digestion trypsine-EDTA par centrifugation, les cellules ont été lavées au PBS (pH 7,4) ; la suspension cellulaire obtenue a été mélangée au réactif Calcein-AM/PI préconfiguré et incubée à 37 °C pendant 15 min. La toxicité des AuNC@PEG a été évaluée en comptant les cellules mortes par microscopie à fluorescence.

Modèle animal

Toutes les procédures d'expérimentation animale ont été réalisées selon les critères du Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université médicale de Jinzhou. Après l'expérience, les animaux ont été euthanasiés selon des principes humanitaires. Des rats Sprague-Dawley adultes pesant 250-300 g (achetés au Centre animalier de l'Université médicale de Jinzhou) ont été utilisés. Tous les animaux ont été répartis aléatoirement en groupes. Une solution d'hydrate de chloral (10 % p/p) a été administrée par voie intrapéritonéale ; ensuite, tous les matériaux ont été injectés par la veine caudale.

Imagerie TDM in vitro et in vivo et détermination de la valeur CT

Pour l'imagerie TDM in vitro, les AuNC@PEG à différentes concentrations et les solutions d'iode ont été placés dans des tubes Eppendorf et disposés dans l'ordre approprié, puis une TDM a été réalisée de l'avant vers l'arrière. Pour l'imagerie TDM in vivo, après anesthésie, les animaux ont été scannés de la tête à la queue, en utilisant le centre de la cavité abdominale comme repère. La position des animaux n'a pas changé entre les acquisitions. Toutes les données brutes (images 0,625 mm) ont été transmises à la station de travail Philips pour analyse par TDM.

Évaluation de la toxicité in vivo

L'analyse hématologique a été réalisée selon la technique standard de prélèvement sanguin veineux saphène. Les tissus du cœur, foie, rate, poumon et rein des rats ont été fixés dans du formol à 4 % pendant 48 h et inclus dans la paraffine après déshydratation. Les coupes de paraffine de 5 μm d'épaisseur ont été montées sur lames de verre. Une coloration hématoxyline-éosine (H&E) a été réalisée, suivie d'une analyse au microscope.

Analyse statistique

Les données ont été analysées par analyse de variance à un facteur, la valeur P servant d'indicateur. Une valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative, exprimée par la valeur moyenne ± écart-type.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des AuNC@PEG

La fonctionnalisation de surface et le contrôle de la taille sont deux facteurs clés pour le développement d'agents de contraste nano performants [15]. La structure et les caractéristiques des AuNC@PEG ont été déterminées par MET et diffusion dynamique de la lumière (DDL). La figure 1a montre que la taille des AuNC@PEG est d'environ 40 nm avec une grande uniformité ; le rayon d'hydratation (figure 1b) est d'environ 50 nm, indiquant une grande stabilité sans agrégation. Les AuNC@PEG présentent une taille réduite et une bonne inertie biologique, favorables aux applications en nanomédecine. De plus, la structure creuse en cage indique de grandes surfaces spécifiques internes et externes et une meilleure capacité d'imagerie TDM, tandis que les parois métalliques environnantes offrent une protection supplémentaire pour les charges utiles pendant le traitement, le transport et le stockage. Avec sa structure cœur-coquille évidente, l'extérieur est recouvert de PEG biologiquement applicable, ce qui améliore efficacement la biocompatibilité et permet d'échapper à la capture macrophagique.

Sécurité et stabilité des AuNC@PEG in vitro

Avant d'utiliser les AuNC@PEG pour l'imagerie in vivo, nous avons évalué leur sécurité et leur stabilité. L'effet des AuNC@PEG sur la viabilité des cellules HUVEC a été détecté par le test MTT (figure 2a). Les cellules ont été traitées avec les AuNC@PEG à différentes concentrations (10, 20, 50, 100, 200, 500 et 1000 μg/mL) pendant 24 h. Les résultats montrent que le taux de survie cellulaire avec les AuNC@PEG était similaire au groupe témoin, avec une biocompatibilité favorable jusqu'à 200 μg/mL. À 1000 μg/mL, le taux de survie restait > 75 %.

Le test LDH a également été utilisé pour évaluer la biocompatibilité in vitro. Dans des cellules normales, la LDH ne traverse pas la membrane cellulaire. Lorsque celle-ci est endommagée, la LDH est libérée [31]. Nous avons évalué la sécurité des AuNC@PEG en mesurant la LDH dans le surnageant cellulaire (figure 2b) après traitement pendant 24 h. Les résultats montrent que le taux de LDH libérée augmente légèrement par rapport aux cellules témoins non exposées lorsque la concentration d'AuNC@PEG est < 200 μg/mL, et reste significativement plus bas que le groupe contrôle positif (H₂O₂), cohérent avec les résultats MTT. Une concentration de 200 μg/mL d'AuNC@PEG s'est révélée optimale pour une bonne cytocompatibilité.

Des tests de stress oxydatif et une évaluation de la coloration vivant/mort par immunofluorescence (Calcein-AM/PI) ont été effectués pour détecter la toxicité in vitro. Le stress oxydatif est nocif pour tous les systèmes vivants, et un excès de ROS peut le provoquer [32, 33]. Nous avons mesuré le niveau de ROS dans les cellules. Après 24 h d'induction par les AuNC@PEG à différentes concentrations, l'intensité de fluorescence verte des cellules induites à 50-200 μg/mL ne différait pas significativement du groupe témoin, et était significativement plus faible que le groupe contrôle positif (figure 2c). L'intensité de fluorescence est proportionnelle au niveau de ROS. Comme le montre la figure 3, le taux de survie des cellules HUVEC à 0-200 μg/mL était > 90 % (figure 3a-f). Ces résultats valident que les AuNC@PEG à 200 μg/mL sont stables et présentent une bonne compatibilité cellulaire, en faisant des agents de contraste cliniques prometteurs.

Imagerie TDM in vitro et détermination de la valeur CT

Pour évaluer la faisabilité des AuNC@PEG en imagerie TDM, nous avons comparé les améliorations de contraste de différentes concentrations molaires (AuNC@PEG) avec l'agent de contraste clinique (iode). Des images TDM ont été obtenues et les valeurs CT mesurées. Les AuNC@PEG ont été comparés aux agents iodés à concentrations similaires (50, 100, 200, 500 et 1000 μg/mL). Les résultats montrent que la valeur CT augmente avec la concentration (figure 4a), et l'analyse des valeurs CT (figure 4b) révèle que le coefficient d'absorption des AuNC@PEG est supérieur à celui des agents iodés à concentrations similaires, indiquant une meilleure performance pour l'imagerie TDM.

Imagerie TDM in vivo

En raison de la forte capacité de contraste des AuNC@PEG, nous avons comparé la qualité d'imagerie des AuNC@PEG avec celle des agents iodés in vivo. 200 μL d'AuNC@PEG (200 μg/mL) ont été injectés par la veine caudale des rats. Le temps d'angiographie du pool sanguin a été évalué par pré-injection (0 min) et scan continu post-injection (10, 20, 30, 40, 60 et 90 min). Le groupe témoin a reçu un agent de contraste iodé à concentration appropriée, avec dose d'injection et temps de scan identiques. Après injection, nous avons observé simultanément l'amélioration du contraste du rein (figure 5) et le remplissage de la vessie (figure supplémentaire 1). Les résultats montrent que le rein du groupe AuNC@PEG atteignait le pic à 30 min et était complètement excrété à 90 min, tandis que le groupe iodé atteignait le pic à 20 min et était excrété à 60 min. La vessie se remplissait progressivement de l'agent de contraste au fil du temps. Cela démontre que le temps d'angiographie du pool sanguin des AuNC@PEG est supérieur à celui de l'agent iodé. La circulation sanguine plus longue des AuNC@PEG permet un meilleur diagnostic et de meilleures perspectives de développement.

Sécurité des AuNC@PEG in vivo

La figure 6a montre les paramètres standards d'hématologie et de fonction hépatique/rénale : taux d'hémoglobine, concentration moyenne d'hémoglobine corpusculaire, volume corpusculaire moyen, numération plaquettaire, globules rouges, globules blancs, albumine, alanine aminotransférase, aspartate aminotransférase, créatinine. L'analyse statistique n'a révélé aucune différence significative entre les groupes AuNC@PEG, agent iodé et témoin (P > 0,05). De plus, les organes (cœur, foie, rate, poumon, rein) ont été analysés histologiquement (figure 6b), 24 h après injection d'AuNC@PEG (200 μg/mL), coupés et colorés (H&E). Comparé au groupe témoin (non injecté), aucun changement morphologique évident ni lésion n'a été observé au microscope. Ces résultats confirment la sécurité et la fiabilité des AuNC@PEG in vivo.

Conclusion

Nous avons développé les AuNC@PEG, un nouvel agent de contraste TDM, caractérisé par une petite taille, un fort contraste, un long temps de rétention sanguine et un faible risque de toxicité. Les évaluations de toxicité in vitro et in vivo montrent une bonne biocompatibilité et un faible risque d'effets secondaires. Les performances d'imagerie TDM in vitro et in vivo démontrent que les AuNC@PEG ont un coefficient d'absorption des rayons X plus élevé et un temps d'angiographie du pool sanguin plus long que les agents iodés traditionnels. De plus, les AuNC@PEG sont supérieurs aux agents iodés et leur utilisation est pratique. Tous ces résultats confirment que les AuNC@PEG ont un coefficient d'absorption des rayons X plus élevé que les agents de contraste iodés traditionnels et que leur performance d'imagerie est supérieure. Par conséquent, les AuNC@PEG fonctionnalisés synthétisés dans cette étude ont un grand potentiel d'application clinique en imagerie TDM.

Disponibilité des données et matériaux

Les données brutes/traitées nécessaires pour reproduire ces résultats ne peuvent pas être partagées pour le moment car elles font partie d'une recherche et développement en cours.

Abréviations

TDM :

Tomodensitométrie

DCF :

Dichlorofluorescéine

DCFH :

Dichlorofluorescine

H₂O₂ :

Peroxyde d'hydrogène

LDH :

Lactate déshydrogénase

MTT :

3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide

PBS :

Tampon phosphate salin

PEG :

Polyéthylène glycol

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

MET :

Microscopie électronique à transmission