Révélation de macromolécules spécifiques au génotype d'E. coli par cartographie nanomécanique AFM

Résumé

La catégorisation des souches microbiennes est conventionnellement basée sur les méthodes moléculaires, et les caractéristiques morphologiques des souches bactériennes sont rarement étudiées. Dans cette recherche, nous avons révélé les structures macromoléculaires de la surface bactérienne via la cartographie mécanique AFM, dont la résolution n'était pas seulement déterminée par la taille nanométrique de la pointe mais aussi par les propriétés mécaniques de l'échantillon. Cette technique a permis l'étude nanométrique des structures membranaires des souches microbiennes avec une préparation d'échantillon simple et des environnements de travail flexibles, surmontant les multiples restrictions de la microscopie électronique et des méthodes analytiques biochimiques nécessitant un marquage. Les macromolécules caractéristiques situées sur la surface cellulaire ont été considérées comme des protéines de couche de surface (S-layer) et se sont avérées spécifiques aux génotypes d'Escherichia coli, avec des tailles moléculaires moyennes caractérisées par des diamètres allant de 38 à 66 nm, et des formes réniformes ou rondes. En conclusion, les structures macromoléculaires de surface ont des caractéristiques uniques liées au génotype d'E. coli, ce qui suggère que les effets génomiques sur les morphologies cellulaires peuvent être rapidement identifiés par cartographie nanomécanique AFM.

Contexte

En raison de la résolution inférieure de la microscopie optique et de l'environnement de travail restreint de la microscopie électronique, les chercheurs du domaine microbien envisagent rarement d'utiliser l'apparence des cellules bactériennes mais adoptent plutôt des méthodes analytiques moléculaires ou chimiques pour l'identification de fragments génomiques, l'expression de protéines, etc. Il n'est pas surprenant que ces méthodes présentent un certain nombre d'inconvénients, notamment être laborieuses et chronophages, et donc des approches plus directes, efficaces et flexibles sont nécessaires. Inventé en 1982 par Binnig et al., le microscope à force atomique (AFM) est conçu pour utiliser une sonde nanométrique surveillée par un faisceau laser pour l'observation de la surface d'un échantillon avec une résolution nanométrique, voire atomique [1]. L'imagerie de la morphologie via une pointe de sonde physique, cette technique surmonte la limite de résolution et les restrictions environnementales de la microscopie optique et électronique et présente un certain nombre d'avantages, tels qu'une préparation d'échantillon simple et des environnements de travail flexibles dans l'air ambiant ou en conditions fluides [2, 3]. Néanmoins, en ce qui concerne les études microbiennes, les applications actuelles de l'AFM impliquent principalement l'imagerie qualitative des morphologies statiques ou dynamiques des cellules bactériennes ou l'expression de flagelles et pili [4-6], tandis que peu d'études se sont concentrées sur l'ultrastructure de surface des cellules microbiennes et l'analyse quantitative des propriétés cellulaires.

Dans cette recherche, l'AFM a été sélectionné pour l'étude de surface de cellules d'Escherichia coli (E. coli), et les formes et dimensions des bactéries individuelles ont été observées par les images de topographie et de phase AFM. De plus, la cartographie mécanique simultanée a révélé des informations biomécaniques supplémentaires sur les composants de surface, où de petites différences dans les caractéristiques adhésives entre les macromolécules et la matrice environnante pouvaient être détectées lors de chaque contact physique entre la pointe et l'échantillon. En appliquant de telles techniques avancées aux domaines microbiens, nous avons examiné trois génotypes d'E. coli contenant une souche de laboratoire et deux souches pathogènes humaines pour l'identification des macromolécules de surface. Les résultats ont montré que la technique pouvait offrir une résolution d'image dépassant l'échelle de la pointe AFM en détectant la distribution mécanique de l'échantillon. En conclusion, nous suggérons qu'un tel développement en science des surfaces fournirait non seulement aux chercheurs travaillant dans les domaines microbiens des détails sur l'apparence cellulaire, mais contribuerait également à notre connaissance des caractéristiques de surface d'autres systèmes bio- ou nanomateriaux.

Méthodes

Échantillons microbiens

Les trois souches d'E. coli testées dans cette recherche ont été isolées cliniquement et fournies par le laboratoire du Prof. Ching-Hao Teng à l'Institut de Médecine Moléculaire, Université Nationale Cheng Kung. MG1655 est la souche intestinale et de laboratoire de type sauvage d'E. coli K-12, et les deux autres souches sont des pathogènes humains — CFT073, la principale cause d'infections urinaires, et RS218, associée à la méningite néonatale chez les nourrissons [7].

Substrat fonctionnalisé

Deux étapes de modifications de surface ont été appliquées pour la liaison covalente entre la surface solide et les cellules microbiennes. Premièrement, une solution de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES, Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) a été utilisée pour former une couche initiale fonctionnalisée NH₂ sur la surface, où le revêtement APTES stable était contribué par les liaisons Si-O stables — Si fourni par APTES et O de la surface oxydée. Possédant deux fonctions COOH, le glutaraldéhyde se combine à la fonction NH₂ de l'APTES avec un COOH et travaille avec le NH₂ sur la surface bactérienne avec l'autre COOH.

Les substrats propres ont été immergés dans une solution d'APTES, avec un mélange de 5 % APTES dans l'éthanol, pendant une heure et rincés à l'éthanol et à l'eau ddH₂O. Les lames ont été séchées à l'aide d'un flux d'azote puis placées dans une solution de glutaraldéhyde, 2 % dans PBS, pendant la nuit, et lavées au PBS.

Préparation de l'échantillon

Des colonies uniques des souches d'E. coli ont été sélectionnées sur des plaques d'agar bouillon lysogène (LB) et incubées dans du bouillon LB. Après des temps de culture de 12 h, la solution bactérienne a été diluée 1:100 dans du bouillon LB frais pré-équilibré. Après 12 h supplémentaires pour la culture microbienne, la solution bactérienne a été soumise à une centrifugation à 1500×g (4000 tr/min) pendant 3 min et resuspendue dans du bouillon LB, ce processus étant répété deux fois. Deux cents microlitres de la solution bactérienne ont été déposés sur le substrat fonctionnalisé et laissés au repos pendant 30 min. L'échantillon a ensuite été submergé dans de l'eau distillée deux fois pour éliminer les cellules non attachées et immédiatement imagé sous AFM dans l'air ambiant.

Caractérisation AFM

Un instrument AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) et une sonde en nitrure de silicium avec une constante de ressort calibrée de 0,7 N/m et un rayon de pointe de 10 nm ont été sélectionnés pour l'examen de surface des spécimens microbiens. Le taux de balayage AFM et les pixels de ligne étaient de 0,5 Hz et 256 lignes respectivement, pour une taille de balayage de 10 µm pour la première détection de topographie, et les paramètres ont ensuite été réglés à 0,3 Hz et 512 lignes pour une taille de balayage de 2 µm pour l'observation détaillée. Le mode PeakForce quantitative nanomechanical (QNM) a été utilisé pour la cartographie nanomécanique, où les propriétés adhésives de la surface étaient calculées à partir de la force attractive maximale parmi les courbes force-distance de retrait.

Notre étude précédente sur Streptococcus mutans a montré l'évolution mécanique sur la surface bactérienne pendant 2 h, surveillée par cartographie mécanique AFM continue, et les échantillons microbiques ont été vérifiés pour rester vivants pendant une telle durée [8-10]. Pour assurer la viabilité des échantillons d'E. coli utilisés dans ce travail, des pré-études sur les échantillons bactériens ont été menées, et le changement continu de l'adhésion de surface pendant 4 h impliquait que les cellules restent vivantes pendant au moins 4 h après la préparation de l'échantillon (montré dans le fichier supplémentaire 1). Par conséquent, les échantillons microbiens testés dans ce travail ont été mesurés par AFM dans les 2 h après la préparation de l'échantillon. Tous les génotypes d'E. coli ont été cultivés individuellement et à des moments différents, et les mesures AFM ont été effectuées immédiatement après la préparation de l'échantillon. En d'autres termes, les échantillons bactériens n'étaient pas alignés en attente d'examen, donc les effets du temps d'attente sur les différences entre les souches d'E. coli étaient minimisés. Les données quantitatives pour chaque souche d'E. coli ont été collectées à partir des mesures effectuées dans les 2 h dans cette étude.

Analyse statistique

Prism (GraphPad Software, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique dans ce travail. Les longueurs cellulaires et les tailles macromoléculaires ont été présentées comme valeurs moyennes avec l'erreur standard de la moyenne (SEM). Les comparaisons multiples entre les génotypes d'E. coli ont été traitées en utilisant une analyse de variance (ANOVA) à un sens ordinaire. Le niveau de confiance de 95 % (p < 0,05) a été sélectionné, et les astérisques indiquent le degré de différence significative trouvée. Le nombre d'échantillons n de chaque souche était > 40.

Résultats et discussion

Ultrastructure de surface par cartographies multiples

Lors du balayage AFM à une échelle d'observation de 10 µm sur un échantillon bactérien, plusieurs cellules individuelles d'E. coli MG1655 pouvaient être vues, et la forme cellulaire en trois dimensions pouvait être observée à partir de l'image topographique (Fig. 1a) ; les contours nets des cellules montrés en deux dimensions étaient obtenus par l'image d'erreur de déviation (Fig. 1b), et plusieurs tubules à côté des cellules bactériennes pouvaient être trouvés. Les filaments ondulés (Fig. 1c) étaient cohérents avec l'apparence de flagelles microbiens rapportée dans un autre travail, ce qui confirmait cette découverte comme flagelles, et les pili plus courts et semblables à des cheveux pouvaient aussi être vus [11]. En diminuant la zone d'observation de la sonde pour l'étude détaillée de cellules microbiennes uniques, la topographie montrait une légère différence dans la direction verticale parmi les surfaces cellulaires, comme montré Fig. 1d, et l'image d'erreur de déviation semblait fournir plus d'informations morphologiques tandis que le bruit environnemental collecté était trop important pour étudier l'ultrastructure de la surface cellulaire (Fig. 1e). Lorsque les propriétés biomécaniques simultanées de l'échantillon étaient mesurées pendant le contact entre la pointe et l'objet testé, il a été trouvé que la surface bactérienne était en fait composée d'une énorme quantité de macromolécules avec forme et taille spécifiques, comme révélé par la cartographie de force adhésive (Fig. 1f) ; ainsi, la résolution morphologique dans les images topographiques et d'erreur de déviation étaient encore améliorées avec l'information biomécanique.

Dans la Fig. 2a, l'expression de flagelles par E. coli MG1655 pouvait être évidente, où la taille des filaments était similaire à celles de la Fig. 1b, avec des propriétés d'adhésion relativement plus faibles que le substrat. En outre, la surface bactérienne a été trouvée composée de composants circulaires qui étaient caractérisés comme moins adhésifs comparés à la matrice environnante. Cette observation est similaire à nos découvertes précédentes sur les couches de tissu de peau de souris, et les grains récurrents et comparables étaient considérés comme des macromolécules, dont la structure est plus dense et cohérente que celles vues dans la région intermoléculaire de sorte que les différences de performance d'adhésion pouvaient être facilement détectées [12]. La couche la plus externe de l'enveloppe cellulaire des bactéries Gram-négatives est une couche de protéines d'auto-assemblage, comme illustré Fig. 2b, connue sous le nom de protéine de couche de surface (S-layer) [13]. Les structures de S-layer étaient traditionnellement mesurées par microscopie électronique tandis que les exigences d'environnements sous vide et de revêtement conducteur perdaient l'information native et en temps réel sur les protéines. Bien que certaines recherches aient extrait les protéines S-layer et les réassemblées sur un substrat de mica pour le balayage AFM, les résultats manquaient de la performance in situ et en temps réel de la structure S-layer [14, 15]. Basé sur l'architecture cellulaire et certaines images précédentes de surface microbienne par microscopie électronique, nous avons considéré les macromolécules observées comme des protéines S-layer [16].

En comparant les mesures AFM et microscopie électronique à transmission (MET), la première présente plusieurs avantages sur la seconde, tels qu'une préparation d'échantillon plus simple, des exigences expérimentales moins restrictives, et des applications d'imagerie plus respectueuses du biologique. La sélection de la MET dans le domaine biologique est généralement choisie en raison de sa capacité à voir les organites intracellulaires et l'imagerie ultra-résolution (typiquement nanométrique ou sous-nanométrique) qui peut être obtenue. La cartographie d'adhésion AFM dans le travail actuel a amélioré la résolution des caractéristiques et présenté les arrangements de macromolécules de surface d'une manière qui ne dépendait pas de la taille de la pointe, mais plutôt de la structure intrinsèque de l'échantillon lui-même. De plus, cette approche permet une résolution nanométrique de la surface microbienne sur une gamme de dizaines de micromètres carrés.

Différences de caractéristiques morphologiques manipulées par le génome

Après avoir observé l'ultrastructure de surface des cellules d'E. coli MG1655, une question d'intérêt est de savoir comment les macromolécules sont arrangées dans d'autres souches. Les pathogènes humains E. coli CFT073 et RS218 ont ainsi été examinés par AFM avec les mêmes paramètres expérimentaux, et il n'y avait pas de différences significatives dans les formes et dimensions cellulaires entre ces trois génotypes à la taille de caractéristique de 10 µm, vu Fig. 3a-c. La cartographie de force adhésive a été utilisée pour identifier les protéines S-layer, et des structures dissemblables avec diverses formes et tailles ont été détectées parmi les différentes souches d'E. coli, comme montré Fig. 3d-f. Pour faciliter la comparaison, les images détaillées de cartographie d'adhésion des souches d'E. coli ont été affichées Fig. 3g-i. Les macromolécules de surface ont été caractérisées comme ayant une forme ronde dans les cellules MG1655 et RS218, bien que avec des diamètres moléculaires différents, qui étaient de 38 ± 1,1 nm (n = 80) pour MG1655 et 58 ± 2,7 nm (n = 46) pour RS218. D'autre part, les cellules CFT073 possédaient une forme unique de protéines S-layer, qui étaient réniformes avec la différence de longueur entre les deux extrémités de 66 ± 3,2 nm (n = 44). Après analyse des tailles des protéines S-layer de ces trois génotypes pour comparaisons multiples, les résultats ont démontré les différences significatives entre ces souches (Fig. 4).

Les S-layers microbiens sont rapportés jouer des rôles importants dans de nombreuses fonctions, qui contiennent la protection des cellules contre les environnements sévères, les attaques de phagocytose, et les bactéries prédatrices. En outre, les S-layers servent aussi d'adhésines qui permettent une colonisation efficace [17]. Les structures de S-layer ont été bien étudiées par MET et catégorisées en divers types de réseau avec l'espace entre centre-à-centre dans la gamme de 4-35 nm [16]. La variation entre nos résultats AFM et les rapports MET de la littérature était pensée comme due aux différentes méthodologies d'imagerie, où la MET donne la morphologie 2D de la structure S-layer et l'AFM capture la topographie 3D qui inclut les influences multiples contribuées par le rayon cellulaire et la rugosité et la géométrie de la sonde AFM.

Différents types de structures S-layer étaient originellement pensés possibles pour utiliser leurs diverses caractéristiques taxonomiques pour distinguer parmi les espèces bactériennes, bien qu'il ait été trouvé ensuite que même pour une seule espèce, les souches microbiennes pouvaient posséder différents réseaux de protéines [13, 16, 18, 19]. Bien que certaines études aient investigué le rôle du S-layer dans la formation de filaments, les types de protéines sur les membranes cellulaires et les diversités génomiques en taille parmi les génotypes d'E. coli, les différences dans les protéines S-layer ont rarement été notées [20-22]. Les résultats de l'étude actuelle ont révélé les différences de caractéristiques morphologiques parmi E. coli MG1655, CFT073, et RS218 et suggèrent que les apparences des macromolécules de surface étaient probablement spécifiques à chaque génotype d'E. coli.

Conclusions

Dans ce travail, des informations nanostructurales spécifiques au génome sur la surface bactérienne ont été détectées par cartographie mécanique AFM, qui a distingué les différences adhésives entre les macromolécules et la matrice environnante. Les macromolécules de surface des cellules microbiennes ont été considérées comme les protéines de couche de surface, selon l'architecture moléculaire des microbes Gram-négatifs. Les arrangements et tailles de ces macromolécules ont été trouvés spécifiques aux génotypes d'E. coli testés avec des formes et tailles distinctes, ces différences étant montrées significatives par analyse statistique. En conclusion, nous considérons que la structure de S-layer bactérienne est dépendante du génome et peut être la méthode potentielle pour le diagnostic rapide de maladies associées aux microbes ou de souches microbiennes. Pour implémenter l'application pratique de la caractéristique de S-layer, l'examen sur plus de génotypes bactériens est requis pour le catalogue complet. Nous établissons actuellement la base de données reliant les caractéristiques morphologiques bactériennes et les performances physiologiques/pathologiques et croyons que ce sera un progrès prometteur pour l'application pratique de l'examen AFM.

Abréviations

AFM :

Microscope à force atomique

ANOVA :

Analyse de variance à un facteur

APTES :

3-Aminopropyltriéthoxysilane

LB :

Bouillon lysogène

QNM :

Nanomécanique quantitative

S-layer :

Couche de surface

MET :

Microscopie électronique à transmission