Le microARN exosomal dérivé de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse retient la fibrose myocardique et la transition épithéliale-mésenchymateuse chez les rats atteints de myocardite virale en supprimant MAML1

Introduction

La myocardite est considérée comme une maladie inflammatoire des cellules du muscle cardiaque [1]. La myocardite est évidemment plus familière chez l'homme que chez la femme [2]. La myocardite virale (VMC) est un facteur principal conduisant à la cardiomyopathie dilatée (DCM) et à la mort subite chez les jeunes [3]. Les performances cliniques de la myocardite sont diverses, allant d'états asymptomatiques avec des signes et symptômes ambigus à une destruction myocardique grave par des virus et des cellules immunitaires souffrant de choc cardiogénique et d'arythmies [1]. La myocardite peut être induite par une variété d'éléments infectieux, comprenant des virus, des bactéries, des chlamydia, des rickettsies, des champignons et des protozoaires, ainsi que des inducteurs non infectieux. Parmi lesquelles, l'infection virale a été la cause la plus fréquente, en particulier chez les enfants [4]. Le virus Coxsackie B3 (CVB3), en tant que virus le plus crucial qui conduit à la myocardite, peut entraîner une réponse au stress oxydatif et une apoptose dans la pathogenèse de la VMC, mais un traitement spécial de la VMC n'a pas encore été signalé [5]. De plus, la pathogenèse de la VMC n'est pas bien documentée et un traitement clinique précis fait également défaut [3]. Par conséquent, de nouvelles cibles sont nécessaires de toute urgence pour améliorer le pronostic de la maladie.

Les microARN (miARN) sont des ARN endogènes non codants qui peuvent réguler l'expression de gènes codant pour des protéines [6]. MiR-133a, en tant que l'un des miARN spécifiques au cœur, est impliqué dans le développement cardiaque et certaines maladies cardiovasculaires, notamment l'infarctus du myocarde (IM) [7]. De plus, miR-133a est celui qui est exprimé de manière aberrante dans la cardiomyopathie chronique de la maladie de Chagas [8]. De plus, le niveau de miR-133a dans le myocarde est lié à l'inflammation, à la fonction ventriculaire gauche et aux résultats cliniques de la cardiomyopathie inflammatoire [9]. Des miARN ont été trouvés dans des exosomes dérivés de mastocytes murins et humains [10]. Les exosomes, des vésicules nanométriques libérées par la plupart des types de cellules, se trouvent dans différents fluides biologiques [11]. Les exosomes peuvent transférer leur cargaison aux cellules réceptrices, ce qui s'est avéré modifier la composition biochimique et les voies de signalisation des cellules réceptrices [12, 13]. Des preuves ont montré que les miARN exosomal modifiés sont liés à la pathogenèse de la myocardite induite par CVB3 [14]. Il a été démontré que le miR-125b-5p exosomal des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse conditionnées par l'hypoxie réduit l'apoptose des cardiomyocytes et améliore la réparation cardiaque ischémique [15]. De plus, le miR-25-3p exosomal des CSM atténue l'IM en réduisant l'apoptose des cardiomyocytes et la réponse inflammatoire [16]. Il est intéressant de noter que le miR-133a exprimé par le cœur exosomal est connecté à la troponine-I troponincardiaque cardiaque [17]. Mastermind-like 1 (MAML1) était un gène en aval de miR-133a à sélection croisée dans notre étude qui a été signalé comme impliqué dans les lésions d'ischémie/reperfusion myocardique (I/R) [18]. De plus, une étude récente a mentionné que le knockdown de MAML1 possède la fonction anti-fibrosante dans la fibrose hépatique [19].

Éclairé par des études antérieures, on se demande si le miR-133a exosomal dérivé des BMSC pourrait médier la myocardite. Par conséquent, cette étude a été lancée avec l'hypothèse que miR-133 transporté par l'exosome dérivé du BMSC (BMSC-Exo) améliore la fibrose myocardique et la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) chez les rats VMC grâce à la régulation de MAML1.

Matériaux et méthodes

Approbation éthique

L'étude a été autorisée par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du quatrième hôpital affilié de la faculté de médecine de l'université du Zhejiang. Les animaux ont été traités sans cruauté.

Isolement des BMSC

Les animaux expérimentaux étaient des rats mâles Sprague-Dawley (SD) matures exempts d'agents pathogènes spécifiques (SPF) (Experimental Animal Center of Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang, Chine). Les rats ont été euthanasiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique et stérilisés avec de l'alcool à 75 %. Le fémur et le tibia ont été retirés sur une table ultra-propre, les muscles et les tissus conjonctifs ont été retirés et la cavité médullaire a été rincée à plusieurs reprises avec du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à faible teneur en glucose. Le liquide a été centrifugé pour recueillir les précipités qui ont été remis en suspension et incubés pendant 24 h (le milieu a été changé tous les 2-3 jours). Lors de la croissance jusqu'à la phase logarithmique, les BMSC ont été détachées avec 0,25% de trypsine (Gibco, Carlsbad, Californie, USA), centrifugées et remises en suspension dans une solution de culture MSC (Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, Chine). La suspension a été passée à un rapport de 1:2. L'opération ci-dessus a été répétée et les BMSC du 4e passage ont été utilisés pour les expériences suivantes.

Identification des BMSC

Les antigènes de surface des BMSC de 4e passage en croissance logarithmique ont été identifiés par cytométrie en flux. Les BMSC ont été détachées avec 0,25% de trypsine (1 ml) contenant de l'acide éthylène diamine tétraacétique, centrifugées, remises en suspension avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) appropriée et centrifugées à 151 g. Les BMSC ont ensuite été remis en suspension avec du PBS contenant 2 % de sérum bovin fœtal frais (FBS) (Gibco) pour préparer une suspension unicellulaire. Les anticorps monoclonaux FITC-CD34, PE-CD29 et PE-CD44 (5 L chacun, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ont été incubés avec la suspension cellulaire (100 L), centrifugés à 151 g, remis en suspension avec 500 L. L de PBS contenant 1% de paraformaldéhyde et fixé pendant 30 min. Les marqueurs de fond ont été identifiés en utilisant des anticorps monoclonaux du contrôle homotypique.

Cytométrie en flux :la suspension unicellulaire a été fixée et centrifugée à 151 g. Ensuite, les BMSC ont été remis en suspension avec du PBS contenant 1% de paraformaldéhyde, testés sur le cytomètre en flux MACS Quart et analysés par le logiciel correspondant.

Induction de l'ostéogenèse et de l'adipogenèse des BMSC

Les BMSC du 4e passage ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits avec 200 cellules/mL. La solution d'induction ostéoblastique et la solution d'induction adipogène (Cyagen Biosciences Inc.) ont été ajoutées dans des BMSC de 60 à 70 % de confluence. Les BMSC dans les deux autres puits n'ont pas été ajoutés avec des liquides d'induction comme témoins. Les BMSC ont été induites pendant 14 jours et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, les ostéoblastes et adipocytes différenciés ont été mis en œuvre avec une coloration au rouge alizarine et une coloration au rouge huile O (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Wuhan, Chine), et observés au microscope.

Isolement et identification des exosomes

Les BMSC du 4ème passage ont été cultivées pendant 48 h pour récolter le surnageant qui a ensuite été centrifugé (800 g et 2000 g), filtré avec des membranes filtrantes 0,22 m et 100 000 MW, et centrifugé (100 000 g) pour collecter les précipités. Ensuite, les précipités ont été remis en suspension avec du PBS, centrifugés à nouveau à 100,00 g pour obtenir une précipitation des exosomes. La suspension BMSC-Exo dans du PBS a été soumise à une détection de concentration par acide bicinchoninique (BCA) et à une détection de protéine productrice d'exosomes (CD63, CD81 et CD9) par analyse western blot (Proteintech, Chicago, IL, USA).

L'infection à adénovirus recombinant médie la modification du gène miR-133a des BMSC

Les BMSC ont été repiqués pendant la nuit. Le contrôle normal (quantité égale de PBS), le contrôle négatif miR-133a (NC), la surexpression miR-133a (Ad-miR-133a) et miR-133a à faible expression (Adas-miR-133a) ( Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Chine) ont été transfectées avec des BMSC conformément à 100 multiplicité d'infection (MOI). Les BMSCs ont été cultivés, et les exosomes correspondants (NC ^Exo , NC ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , et Adas-miR-133a ^Exo ) ont été obtenus par ultracentrifugation [20].

Établissement d'un modèle VMC chez le rat et regroupement d'animaux expérimentaux

Des rats mâles matures SD de qualité SPF ont été divisés en 10 groupes, avec huit rats chacun. Coxsackievirus B3 (CVB3) a été fourni par l'Institut de biotechnologie médicale, Académie chinoise des sciences médicales (Pékin, Chine).

Le CVB3 (10 mg/kg) a été injecté par voie intrapéritonéale à des rats tandis que du PBS ou du BMSC-Exo (100 g) a été injecté par la veine caudale. Des rats normaux pour les contrôles ont reçu une injection de solution de culture CVB3 et de PBS. Les rats ayant reçu une injection de 10 mg/kg de CVB3 ont en outre reçu une injection de PBS, MSC ^exo , NC ^Exo , Adas-miR-133a ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , si-NC ou si-MAML1 (RIBOBIO, Guangzhou, Chine).

Les rats ont reçu une injection continue pendant 7 jours et le sang du globe oculaire a été obtenu. Le sang a été centrifugé et le sérum a été collecté, sous-emballé et stocké à - 20 °C. Après que les rats aient été euthanasiés, les échantillons de cœur ont été prélevés, fixés avec du formaldéhyde à 10 %, déshydratés avec de l'alcool à gradient, nettoyés avec du xylène et inclus dans de la paraffine, sectionnés pour observation histologique. Une partie des coupes a été placée à − 80 °C en tant que matériaux d'expérimentation de biologie moléculaire.

Échocardiographie

Le 7ème jour après l'injection du virus, les rats ont reçu une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 25 mg/kg. Après anesthésie complète, la dérivation du membre de l'électrocardiogramme relié à l'aiguille de l'électrode a été insérée par voie sous-cutanée aux extrémités des membres des rats, et l'électrocardiogramme de la dérivation du membre a été enregistré. Ensuite, les rats ont été fixés en décubitus dorsal légèrement vers la gauche, la poitrine a été épilée et l'électrocardiogramme de dérivation II a été connecté pour obtenir le spectre Doppler du pouls du flux sanguin de l'aorte dans la section cardiaque parasternale à quatre chambres. Les indicateurs comprenaient l'épaisseur de la paroi postérieure du ventricule gauche (LVPW), le diamètre télésystolique du ventricule gauche (LVID), la fraction de raccourcissement ventriculaire gauche (FS) et la fraction d'éjection ventriculaire gauche (FEVG).

Coloration à l'hématoxyline-éosine (HE)

Les tissus ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, déshydratés, nettoyés et inclus dans de la paraffine. Ensuite, les coupes de 4 µm ont été déparaffinées, colorées à l'hématoxyline (Servicebio, Wuhan, Chine), différenciées avec de l'alcool chlorhydrique à 1%, redevenues bleues et colorées à l'éosine, déshydratées, éclaircies au xylène, scellées avec de la gomme neutre, et observé au microscope optique (Olympus, Tokyo, Japon).

Coloration au collagène de Masson

Les coupes de paraffine ont été déparaffinées, colorées à l'hématoxyline en moins de 2 min, colorées avec une solution de Lichun magenta et rincées rapidement avec une solution d'acide acétique glacial à 0,5 %. Ensuite, les sections ont été colorées avec une solution aqueuse de phosphate d'aluminium à 1 %, colorées du rouge foncé au rouge vif au rose, et observées au microscope. Ensuite, les coupes ont été colorées au bleu d'aniline (Pulande), déshydratées de manière conventionnelle au xylène et scellées. Le logiciel d'analyse d'images médicales Image-Proplus 6.0 a été utilisé pour mesurer la zone de coloration positive des fibres de collagène et la fraction volumique de collagène (CVF) =  zone de collagène/zone de champ totale. L'emplacement de coloration et la couleur des fibres de collagène ont été distingués (les cardiomyocytes étaient rouges et les fibres de collagène étaient des bandes bleues ou des structures homogènes dans l'espace intercellulaire).

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL) Coloration

Les coupes de paraffine ont été déparaffinées, placées dans le tampon citrate et cuites à 350 W pendant 10 min. Les coupes ont été additionnées de 50 L de solution TUNEL, jointes à 50 L d'agent de conversion-peroxydase, développées avec du DAB et observées au microscope. Les coupes ont été placées dans de l'hématoxyline, trempées dans de l'éthanol à 95 % I-II, jointes à de l'éthanol anhydre I-II, du xylène I-II et scellées. Les résultats ont été analysés au microscope optique.

Essai immuno-enzymatique (ELISA)

Le facteur de nécrose tumorale (TNF-α), l'interleukine (IL)-1β et l'IL-6 ont été détectés par des kits ELISA (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Chine). Le sang du globe oculaire a été centrifugé à 604 g pour recueillir le sérum supérieur. Le surnageant obtenu par centrifugation à partir du milieu de culture cellulaire a été détecté dans l'expérience cellulaire. Il y avait sept gradients de concentration dans l'étalon de dilution des échantillons. Le puits blanc a été joint au diluant d'échantillon, et un autre puits a été ajouté avec de la tétraméthylbenzidine (TMB), deux puits en double ont été placés pour chaque concentration. Les puits d'échantillons ont été joints avec 50 L de diluant d'échantillon et les échantillons à leur tour. Chaque puits a été mis à réagir avec 100 L d'anticorps primaire (sauf puits TMB) pendant 1 h, ainsi qu'avec 300 L de solution saline tris-tamponnée (TBS) 0,01 M et 100 L de solution de travail du complexe Avidine-Biotine-Peroxydase (sauf puits TMB ). Ensuite, chaque puits a été additionné de 300 L de TBS 0,01 M et incubé avec 100 L de TMB. La valeur de la densité optique (DO) et la concentration de chaque puits ont été immédiatement mesurées et la courbe standard a été tracée.

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)

MiR-133a, collagène Ι, collagène III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-cadhérine et FSP-1 dans les tissus myocardiques et les cardiomyocytes ont été détectés par RT-qPCR. L'ARN total a été extrait des cardiomyocytes ou des tissus myocardiques et transcrit de manière inverse en ADNc via un kit d'extraction d'ARN (Takara, Dalian, Chine), et des amorces RT-PCR ont été synthétisées via Invitrogen (Guangzhou, Chine), les séquences sont présentées dans le tableau 1. L'expression génique quantitative relative a été analysée en utilisant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ou U6 comme gènes de contrôle de charge selon 2 ^−△△Ct méthode.

Analyse Western Blot

Les rats ont été euthanasiés sous anesthésie. Les tissus myocardiques ont été congelés et broyés dans de l'azote liquide. Ensuite, une solution mère d'inhibiteurs de protéase de fluorure de phénylméthanesulfonyle a été mélangée avec un tampon de lyse cellulaire dans un rapport de 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Chine). Les échantillons ont été lysés avec une solution mixte et les protéines des cellules ont été extraites. La concentration totale en protéines a été détectée avec le kit BCA. Les échantillons ont été mélangés avec du tampon de chargement 5 x  à 4:1, mis en œuvre avec un bain d'eau bouillante pendant 10 min, baignés de glace et centrifugés. Une séparation par électrophorèse a été effectuée et les protéines ont été transférées sur une membrane en fluorure de polyvinylidène (Servicebio) avec une solution de transfert électrique. Ensuite, la membrane a été bloquée avec du lait écrémé en poudre à 5% et jointe aux anticorps primaires CD63, CD81 et CD9 (anticorps polyclonaux anti-rat de lapin de Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, USA, 1:1000) et GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA, 1:1000). Ensuite, la membrane a été égouttée avec l'anticorps secondaire, l'IgG marquée à la peroxydase de raifort (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, 1:1000) et immergée dans une solution de réaction de chimiluminescence améliorée (Pierce, Rockford, IL, USA). Avec GAPDH comme contrôle de chargement, les images d'empreintes de protéines ont été analysées avec le logiciel ImageJ2x.

Culture et passage des cardiomyocytes

Des rats SD âgés de 3 à 5 jours (Experimental Animal Center of Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang, Chine) ont été prélevés. La partie ventriculaire a été rincée avec une solution saline équilibrée de Hank prérefroidie, coupée en petits morceaux et détachée avec 0,25% de trypsine. Les morceaux ont été ajoutés avec une quantité appropriée de milieu complet à 10 % pour terminer le détachement et centrifugés à 151 g. Du DMEM contenant 20 % de FBS a été appliqué pour la remise en suspension des cellules. Les cardiomyocytes ont été purifiés par la méthode différentielle adhérente, et le taux de survie a été observé par coloration au bleu trypan, les cardiomyocytes survivants ont été cultivés. Après 24 h, les cardiomyocytes ont adhéré à la paroi et ont commencé à pulser. Après 72 h, les pseudopodes se sont élargis.

Construction du modèle VMC de cardiomyocyte

Les cardiomyocytes du 4ème passage en phase de croissance logarithmique ont été sélectionnés et infectés avec MSC ^Exo , NC ^Exo , Adas-miR-133a ^Exo , et Ad-miR-133a ^Exo . La solution de virus 100 Tcid50 CVB3 (100 L) a été ajoutée dans les cellules pour induire un modèle cellulaire VMC. Dans le même temps, une quantité égale de solution d'entretien a été ajoutée aux cellules pour un contrôle, et les exosomes correspondants ont été joints aux cardiomyocytes après 1 h d'infection pour 47 h de culture.

Kit de comptage cellulaire (CCK)-8 Dosage

Le kit de détection de cellules CCK-8 (Beyotime) a été appliqué pour détecter le taux de survie des cardiomyocytes. Lors de la croissance jusqu'à la phase logarithmique, les cellules ont été détachées avec 0,25% de trypsine et ensemencées dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits à 2,5 × 10 ⁴ cellules/par puits. Jointes à la solution de CCK-8 (10 L/puits), les cellules ont été cultivées en continu pendant 1 à 4 h et la DO_{450 nm} valeur a été mesurée via un lecteur de microplaques.

Cytométrie en flux

La méthode de double coloration AnnexinV-APC/iodure de propidium (PI) a été appliquée pour détecter l'apoptose cellulaire. Les cellules ont été centrifugées, remises en suspension avec 250 L de tampon de liaison (4 ml de tampon de liaison  +  12 ml d'eau désionisée) et ajustées à 1 × 10 ⁶ cellules/mL. La suspension cellulaire de 100 L a été ajoutée avec 5 L d'Annexine V-APC (BD Biosciences) et 5 L de solution PI (BD Biosciences), chargée sur le cytomètre en flux et analysée automatiquement par un ordinateur.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

La séquence de type sauvage (wt) ou de type mutant (mut) de MAML1 3-région non traduite (UTR) a été clonée dans le vecteur pGL3-M (Promega, WI, USA), puis MAML1-3-UTR-wt ou MAML1- 3-UTR-mut ont été générés. Les vecteurs, ainsi que miR-133a mimic ou NC, ont été co-transfectés dans des cardiomyocytes via Lipofectamine 2000. L'activité luciférase a été testée 48 h plus tard par le système de gène rapporteur double luciférase (Promega) [21]

Test d'immunoprécipitation d'ARN (RIP)

Le kit RIP (Millipore, USA) a été utilisé pour détecter la liaison de MAML1 et miR-133a. Les cellules ont été lysées par un tampon de dosage de radio-immunoprécipitation (P0013B, Beyotime, Shanghai, Chine), centrifugées à 1400 g et incubées avec des anticorps pour co-précipiter. Les billes magnétiques (50 L) ont été remises en suspension dans 100 L de tampon de lavage RIP et incubées avec 5 g d'anticorps anti-MAML1 (1 g/mL, ab155786) ou IgG (1:100, ab172730). Le complexe billes magnétiques-anticorps a été remis en suspension dans 900 L de tampon de lavage RIP, a interagi avec 100 L d'extrait cellulaire, digéré par la protéinase K et détecté par RT-qPCR [22].

Analyse statistique

Le logiciel statistique SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) a été utilisé pour l'analyse des données. Les données de mesure ont été exprimées en moyenne ± écart type. Le test t a été appliqué aux comparaisons entre deux groupes. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour la comparaison entre les groupes, et le test post hoc de Tukey pour les comparaisons par paires. Les prédicteurs ont été conservés s'ils étaient significatifs à un P valeur de 0,05 ou moins.

Résultats

Identification des BMSC et BMSC-Exo

Au microscope, les BMSC étaient fusiformes et arrondies, et adhéraient à la paroi selon un vortex ou un motif radial (Fig. 1A). Après coloration au rouge huile O de l'induction de l'adipogenèse, les gouttelettes lipidiques des 4e BMSC étaient rouges et il y avait des gouttelettes lipidiques rondes de différentes tailles (Fig. 1B). Après induction de l'ostéogenèse, les cellules exprimant les nodules calcifiés ont montré du rouge après coloration au rouge alizarine, et une distribution inégale des nodules calcifiés et des cellules chevauchantes (Fig. 1C). La cytométrie en flux a montré que les marqueurs MSC CD29 et CD44 (> 95 %) étaient exprimés, mais que l'antigène de surface des cellules souches hématopoïétiques CD34 (<95 %) n'était pas exprimé (Fig. 1D). Ces résultats ont montré que les BMSC étaient d'une grande pureté et conformes aux normes MSC de l'International Society of Cell Therapy.

Observation du phénotype BMSC et identification BMSC-Exo. Un Observation morphologique des BMSCs au 4ème passage; B Les résultats de la coloration à l'huile rouge O des adipocytes ; C Les résultats de la coloration rouge alizarine des ostéoblastes ; D Le phénotype de BMSC détecté par cytométrie en flux. E Observation au microscope électronique de BMSC-Exo; F Bandes protéiques de CD9, CD63 et CD81

Le microscope électronique à transmission a observé que les BMSC-Exos étaient des vésicules ovales avec une structure membraneuse périphérique claire, différentes tailles et un diamètre de 40 à 100 nm (Fig. 1E). L'analyse par transfert Western a démontré que les produits extraits exprimaient l'exosome provenaient des protéines caractéristiques de CD9, CD63 et CD81 (Fig. 1F).

Le miR-133a exosomal élevé améliore les symptômes de la myocardite

La transfection des BMSC avec l'adénovirus recombinant miR-133a a été observée (Fig. 2A). Un grand nombre d'expressions de fluorescence verte de NC, Ad-miR-133a et Adas-miR-133a ont été observées au microscope à fluorescence inversé, indiquant que le vecteur adénoviral recombinant pourrait transfecter efficacement les BMSC. Pour tester l'efficacité de la transfection de miR-133a, l'expression de miR-133a dans les BMSC et leurs exosomes a été mesurée par RT-qPCR. Il a été découvert que la régulation à la hausse de miR-133a augmentait l'expression de miR-133a tandis que la régulation à la baisse de miR-133a diminuait l'expression de miR-133a (Fig. 2B). Par la suite, nous avons injecté des exosomes contenant du miR-133a chez des rats. Sous le microscope à fluorescence inversé, une expression de fluorescence verte a été observée chez des rats VMC après traitement de NC ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , ou Adas-miR-133a ^Exo , indiquant que le vecteur adénoviral recombinant a infecté des tissus myocardiques de rats (Fig. 2C). L'expérience de RT-qPCR a également révélé que l'expression de miR-133a chez les rats VMC était apparemment diminuée; L'expression de miR-133a était manifestement élevée chez les rats VMC injectés avec Ad-miR-133a ^Exo mais diminué chez les rats VMC injectés avec Adas-miR-133a ^Exo (Fig. 2D). En ce qui concerne les conditions générales des rats, il a été observé que les conditions générales des rats témoins normaux étaient normales, et les caractéristiques des VMC étaient apparemment exprimées chez les rats VMC et les rats VMC injectés avec Adas-miR-133a ^Exo , comme les cheveux rêches et en désordre, la dyspnée et une alimentation réduite. Chez les rats VMC traités avec MSC ^Exo , NC ^Exo , et Ad-miR-133a ^Exo , ces signes se sont améliorés à des degrés divers. Le poids des rats VMC a été continuellement diminué à partir de 1 jour après l'infection et l'injection de MSC ^Exo , NC ^Exo , ou Ad-miR-133a ^Exo augmenté le poids des rats. Le poids des rats VMC traités avec Ad-miR-133a ^Exo a été augmenté évidemment et le poids des rats VMC injectés avec Adas-miR-133a ^Exo était nettement diminué (Fig. 2E).

Le miR-133a exosomal régulé à la hausse soulage la myocardite. Un transfection par BMSC de l'adénovirus recombinant miR-133a ; B Détection par RT-qPCR de l'expression de miR-133a dans les BMSC et leurs exosomes après régulation de miR-133a ; C efficacité de transfection miR-133a testée via un microscope à fluorescence inversée ; D L'expression relative de miR-133a dans les tissus myocardiques testés par RT-qPCR ; E Changement de poids des rats dans chaque groupe ; F Détermination de LVPW, LVID, FS et LVEF chez les rats de chaque groupe. *P < 0,05 ; **P < 0.001

L'observation de la fonction myocardique a suggéré que (Fig. 2F), les rats VMC avaient augmenté LVPW et LVID, et diminué FS et LVEF. Après l'injection d'exosomes, des LVPW et des LVID ont diminué, et une FS et une LVEF manifestement élevées ont été observées chez les rats VMC. Adas-miR-133a ^Exo traitement altéré pendant Ad-miR-133a ^Exo amélioration de la fonction myocardique chez les rats VMC.

Le miR-133a exosomal régulé à la hausse inhibe l'inflammation dans les tissus myocardiques des rats VMC

La coloration HE a montré que les fibres myocardiques des rats témoins normaux étaient étroitement disposées et qu'il n'y avait pas d'infiltration de cellules inflammatoires dans le mésenchyme. Les cardiomyocytes des rats VMC étaient désorganisés et le mésenchyme était infiltré par un grand nombre de cellules inflammatoires. Les cardiomyocytes chez les rats VMC injectés avec MSC ^Exo ou NC ^Exo étaient disposés de manière ordonnée, avec une petite quantité de cellules inflammatoires s'infiltrant dans le mésenchyme. Les cardiomyocytes chez les rats VMC après Adas-miR-133a ^Exo le traitement était désordonné et les cellules inflammatoires du mésenchyme étaient infiltrées. Les cardiomyocytes chez les rats VMC traités avec Ad-miR-133a ^Exo étaient disposés de manière ordonnée sans infiltration évidente de cellules inflammatoires (Fig. 3A).

L'augmentation du miR-133a exosomal retient l'inflammation dans les tissus myocardiques avec la VMC. Un coloration HE du tissu myocardique de rat dans chaque groupe ; B L'expression de l'IL-6 dans le sérum testée par ELISA ; C L'expression du TNF-α et de l'IL-1β dans le sérum testée par ELISA. *P < 0,05 ; **P < 0.001

ELISA a indiqué que (Fig. 3B, C) les facteurs inflammatoires (TNF-α, IL-1β et IL-6) étaient manifestement augmentés chez les rats VMC. Les rats VMC injectés avec Ad-miR-133a ^Exo avaient des niveaux réduits de facteurs inflammatoires. Adas-miR-133a ^Exo le traitement a causé des facteurs inflammatoires élevés chez les rats VMC.

Le miR-133a exosomal élevé diminue la CVF dans les tissus myocardiques de rats atteints de VMC

La coloration de Masson a révélé que les fibres myocardiques des rats normaux étaient étroitement arrangées, avec presque pas de fibres collagènes bleues. Après injection de CVB3, les cardiomyocytes étaient hypertrophiques, avec une hyperplasie du tissu conjonctif et un grand nombre de fibres collagènes bleues, et la CVF était manifestement élevée. Traités avec des exosomes, les cardiomyocytes étaient disposés de manière ordonnée, l'hyperplasie du tissu conjonctif intercellulaire était diminuée, les fibres de collagène bleu et le CVF étaient clairement diminués. L'espace intercellulaire myocardique de rats VMC injectés avec Adas-miR-133a ^Exo était élargie, les cellules étaient manifestement agrandies, les fibres de collagène bleu et le CVF étaient nettement augmentés ; l'espace intercellulaire était diminué, la distribution des fibres de collagène bleu et le CVF étaient diminués chez les rats VMC avec Ad-miR-133a ^Exo traitement (Fig. 4A, B).

Le miR-133a exosomal régulé à la hausse diminue la CVF dans les tissus myocardiques des rats atteints de VMC. Un Coloration de Masson des tissus myocardiques chez le rat ; B Fraction volumique de collagène de rats dans chaque groupe. **P < 0.001

L'augmentation du miR-133a exosomal réduit l'expression du collagène I, du collagène III, du TGF-β1 et du CTGF dans les tissus myocardiques de rats atteints de VMC

Le collagène I et le collagène III sont les principaux composants du collagène, qui sont principalement distribués dans les jonctions cellulaires et les membranes cellulaires, la substance intercellulaire et le cytoplasme. Le TGF-β1 et le CTGF sont les protéines caractéristiques de la fibrose. Les résultats de la RT-qPCR ont démontré que les niveaux d'expression de l'ARNm du collagène I, du collagène III, du TGF-β1 et du CTGF étaient augmentés chez les rats VMC, mais diminuaient après le traitement des exosomes. Les rats VMC traités avec Ad-miR-133a ^Exo avaient une diminution des niveaux d'expression de l'ARNm du collagène I, du collagène III, du TGF-β1 et du CTGF tandis que les rats VMC après Adas-miR-133a ^Exo le traitement a montré la situation inverse (Fig. 5A-C).

Elevated exosomal miR-133a reduces the mRNA expression of collagen I, collagen III, TGF-β1 and CTGF in myocardial tissues of rats with VMC. Un Collagen I mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; B Collagen III mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; C TGF-β1 and CTGF mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR. *P < 0,05 ; **P < 0.001

Up-regulated Exosomal miR-133a Inhibits the Cardiomyocyte Apoptosis in Myocardial Tissues of Rats with VMC

TUNEL staining showed that the apoptotic cardiomyocytes were brownish black or brownish yellow with nuclear condensation. The number of apoptotic cells was increased in VMC rats which would be attenuated by exosome treatment. The VMC rats injected with Ad-miR-133a ^Exo had reduced number of apoptotic cells and those injected with Adas-miR-133a ^Exo had increased number of apoptotic cells (Fig. 6A, B).

Increased exosomal miR-133a inhibits the cardiomyocyte apoptosis in myocardial tissues of rats with VMC. Un TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group; B The number of TUNEL positive cells in each group. **P < 0.001

Elevated Exosomal miR-133a Depresses EMT in Myocardial Tissues of Rats with VMC

E-cadherin, α-SMA, and FSP-1 are key indicators of EMT. Results of RT-qPCR demonstrated that α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were elevated and E-cadherin mRNA expression level was decreased in VMC rats. In addition, α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were reduced and E-cadherin mRNA expression level was increased in VMC rats after exosome treatment. α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were elevated and E-cadherin mRNA expression level was decreased in VMC rats treated with Adas-miR-133a ^Exo , while the expression of these indicators was opposite in VMC rats injected with Ad-miR-133a ^Exo (Fig. 7A, B).

Up-regulated exosomal miR-133a represses EMT in myocardial tissues of rats with VMC. Un The mRNA expression of α-SMA in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR; B The mRNA expression of FSP-1 and E-cadherin in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR. *P < 0,05 ; **P < 0.001

Up-regulated Exosomal miR-133a Depresses Inflammation of Cardiomyocytes in VMC

As a result, fluorescence microscopy captured green fluorescent expression in VMC rats treated with NC ^Exo , Ad-miR-133a ^Exo , or Adas-miR-133a ^Exo , indicating that the recombinant adenovirus vector infected cardiomyocytes of rats (Fig. 8A). RT-qPCR and ELISA discovered that (Fig. 8B, D) miR-133a expression was reduced and inflammatory factors (TNF-α, IL-1β, and IL-6) were increased in VMC rats, which would be reversed by exosome treatment. The VMC rats treated with Ad-miR-133a ^Exo had up-regulated miR-133a and decreased inflammatory factors in VMC rats, while those treated with Adas-miR-133a ^Exo presented decreased miR-133a and increased levels of inflammatory factors in VMC rats.

Elevated exosomal miR-133a restrains inflammation of cardiomyocytes in VMC. Un miR-133a transfection efficiency tested via inverted fluorescence microscope; B The relative expression of miR-133a in cardiomyocytes of rats in each group; C IL-6 expression in culture supernatant of cardiomyocytes in each group; D TNF-α and IL-1β expression in culture supernatant of cardiomyocytes in each group. *P < 0,05 ; **P < 0.001

Elevated Exosomal miR-133a Promotes Cell Viability, and Represses Apoptosis of Cardiomyocytes in VMC

The apoptosis and the cell viability were detected via AnnexinV-APC/PI double staining and CCK-8 assay. The results revealed that there was an obvious increase in apoptosis rate, a decrease in cell viability of cardiomyocytes in VMC rats. Exosome treatment reduced apoptosis rate and enhanced the viability of cardiomyocytes. Adas-miR-133a ^Exo enhanced the apoptosis rate and disrupted the viability of cardiomyocytes in VMC rats. Ad-miR-133a ^Exo treatment functioned the opposite effects on cardiomyocytes of VMC rats (Fig. 9A–C).

Increased exosomal miR-133a promotes viability and represses apoptosis in cardiomyocytes in VMC. Un The cardiomyocytes apoptosis detected via flow cytometry; B Quantification results of A; C The cell viability detected via CCK-8 assay. *P < 0,05 ; **P < 0.001

miR-133a Targets MAML1

It has been reported that up-regulated miRNA-193b reduces myocardial I/R damage by targeting MAML1 [18]. Based on that, we cross-screened downstream genes of miR-133a through bioinformatics websites PITA, miRanda, PicTar, microT and miRmap, and selected MAML1 as a target of miR-133a (Fig. 10A). We constructed MAML1-wt or MAML1-mut, and co-transfected cardiomyocytes with miR-133a mimic or NC. The results showed that miR-133a mimic reduced the luciferase activity of MAML1-wt (Fig. 10B). The RIP experiment further verified the targeting relationship between miR-133a and MAML1 (Fig. 10C). RT-qPCR and Western blot detection of MAML1 expression showed that MAML1 expression was decreased in cardiomyocytes transfected with miR-133a mimic (Fig. 10D, E).

miR-133a targets MAML1. Un miR-133a’s targets predicted on bioinformatics websites; B The targeting relationship between miR-133a and MAML1 verified by dual luciferase reporter gene experiment; C The targeting relationship between miR-133a and MAML1 verified by RIP experiment; D /E MAML1 expression changes after up-regulation of miR-133a detected by RT-qPCR and Western blot. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0.001

Inhibition of MAML1 has a Protective Effect on Rats with Myocarditis and Reverses the Effect of miR-133a-Inhibited Exosomes on Rats with VMC

To further study the effect of miR-133a-regulated MAML1 on rats with VMC, we injected si-MAML1 or si-NC adenovirus into VMC rats or VMC rats that had been treated with miR-133a-silenced exosomes. The injection success was validated by RT-qPCR and Western blot (Fig. 11A, B). The results manifested that injection of si-MAML1, the weight of VMC rats was increased (Fig. 11C), cardiac function was improved (Fig. 11D–G), myocardial tissue pathology and fibrosis were attenuated (Fig. 12A–C), serum inflammation (Fig. 12D, E) and cardiomyocyte apoptosis (Fig. 13A–G) were inhibited. Also, the deleterious effects of miR-133a-silenced exosomes in VMC rats were reversed after injection of si-MAML1.

Inhibition of MAML1 has a protective effect on myocarditis rats and can reverse the effect of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. Un /B MAML1 expression in myocardial tissue of rats detected by RT-qPCR and Western blot; C. Weight change of rats; D –G Determination of LVPW, LVIDs, FS and LVEF in rats; **P < 0,01 ; ***P < 0.001; ****P < 0,0001

Inhibition of MAML1 can reverse the effect of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. Un HE staining of rat myocardial tissue; B Masson staining of myocardial tissues in rats; C CVF of rats; D The expression of IL-6 in serum tested via ELISA; E The expression of TNF-α and IL-1β in serum tested via ELISA.****P < 0,0001

Inhibition of MAML1 can reverse the effect of miR-133a-inhibiting exosomes on rats with VMC. Un Collagen I mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; B Collagen III mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; C TGF-β1 and CTGF mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; D TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group; E The number of TUNEL positive cells in each group. F The mRNA expression of α-SMA in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR; G The mRNA expression of FSP-1 and E-cadherin in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ****P < 0,0001

Discussion

Myocarditis is an inflammatory heart illness resulting in DCM and heart failure and is most frequently induced by viral infections such as CVB3 [2]. A study has revealed that miR-133 relieves cardiomyocyte apoptosis and electrical remodeling in mice with VMC [23]. Additionally, changed exosomal miRNAs are also found to be linked with the pathogenesis of CVB3-induced myocarditis [14]. Exosomes derived from cardiac progenitor cells ease CVB3-induced apoptosis via restraining the proliferation of CVB3 in VMC [24]. This study explored the regulatory mechanism of BMSC-derived exosomal miR-133 on myocardial fibrosis and EMT in VMC rats (Additional file 1:Fig. 1).

The study found that the expression of miR-133a was decreased in VMC. As demonstrated before, miR-133a expression is decreased in MI [7]. A study has also suggested that the relative expression of miR-133 in mouse hearts of the VMC is obviously decreased with contrast to the controls [23]. There are some connections of miRNAs with exosomes. The differential expression of exosomes and of exosomal miRNAs in illness has been regarded as biomarkers of disease with performance of noninvasive clinical diagnosis together with their therapeutic potentials [25]. Lin et al. have found that miR-133 is specially sorted into hypoxia/reoxygenation (H/R)-caused human endothelial progenitor cells-derived exosomes to increase fibroblast angiogenesis and EMT [26]. Another study has revealed that MSCs exhibits a communication with brain parenchymal cells and may modulate neurite outgrowth by transfer of miR-133b to neural cells via exosomes [27].

The major finding of this work manifested that up-regulated exosomal miR-133a promoted cell viability, inhibited inflammation, apoptosis, EMT, and fibrosis in rats with VMC. They suits well with a former research that miR-133a silence reverses the Astragalus polysaccharides treatment-induced osteosarcoma MG63 cell proliferation inhibition, together with cell apoptosis promotion [28]. Another study has revealed that overexpressed miR-133a suppresses angiogenesis, apoptosis, fibrosis, and inflammation, while accelerating therapeutic cardiac remodeling in ischemic myocardial illnesses [29]. Similar to our study, Li et al. have stated that miR-133 inhibits cardiomyocyte apoptosis by regulating the expression of apoptosis-related genes in the hearts of VMC mice [23]. The over-expressed miR-133a has been reported to depress hypoxia-induced apoptosis and strengthen cardiomyocyte survival [30]. Meanwhile, the up-regulated serum exosomal miR-30a and miR-181d may have the potentials to be applied as biomarkers for VMC diagnosis [14].

Another finding in our study was that up-regulated exosomal miR-133a decreased CVF, reduced the expression of collagen I and collagen III in rats with VMC. A article has elucidated that released fibroblast growth factor-18 from a collagen membrane causes osteoblastic activity participating in down-regulated miR-133a [31]. In vitro excessive expression of miR-133a depresses cardiomyocyte hypertrophy and reduces collagen expression [32], as evidenced in another study. CVF equals the ratio of collagen area to the sum of myocardial area and collagen area, and the mean value shows the CVF of the section [33]. This finding is also reported by Wang et al. that VMC mice model is successfully constructed by CVB3 infection, manifesting apparent higher CVF expression in contrast with the control group [34]. Moreover, the finding is consistent with that of Ferreira et al. who demonstrates that miR-133a may take on a major role in the modulation of gene expression in chronic Chagas disease cardiomyopathy pathogenesis, with potential link as diagnostic and prognostic tools [8]. Furthermore, evidence has shown that knocking down MAML1 can reduce the hypertrophy of pre-treated cardiomyocytes [35]. In our study, we found that MAML1 was the target gene of miR-133a and inhibition of MAML1 reversed the effects of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. In myocardial ischemia–reperfusion injury, miR-193b-mediated down-regulation of MAML1 could in part reduce infarction and myocardial enzymes, as well as attenuate apoptosis of cardiomyocytes [18]. Also, there is a report suggesting that deficiency of MAML1 could relieve hepatic fibrogenesis [19].

Conclusion

In conclusion, this present study offers evidence that miR-133a is down-regulated in rats with VMC, and elevated exosomal miR-133a improves cardiac function and restrains myocardial fibrosis and EMT in rats with VMC, as well as enhances viability and represses apoptosis of cardiomyocytes in VMC through targeting MAML1. Our study also suggests that inhibition of MAML1 has a protective effect on rats with myocarditis and reverses the effect of miR-133a-inhibited exosomes on rats with VMC. The identification of the exosomal miR-133a in myocardial fibrosis and EMT of myocarditis may potentially widen our understanding of mechanisms underpinning myocarditis and also bear clinical value as a novel molecular target. More researches should be undertaken for making inroads into the treatment of this disease.

Abréviations

miR-133:

MicroRNA-133

BMSC-Exo:

Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosome

EMT:

Epithelial–mesenchymal transition

VMC:

Viral myocarditis

CVF:

Collagen volume fraction

DCM :

Dilated cardiomyopathy

CVB3:

Coxsackie B3 virus

miRNAs:

MicroRNAs

MI :

Myocardial infarction

SPF:

Specific pathogen-free

SD :

Sprague–Dawley

DMEM :

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

FBS :

Sérum fœtal bovin

NC :

Contrôle négatif

MOI:

Multiplicity of infection

LVPW:

Left ventricular posterior wall thickness

LVIDs:

Left ventricular end-systolic diameter

LVEF:

Left ventricular ejection fraction

HE:

Hematoxylin–eosin

TUNEL:

Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end-labelin

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

TMB:

Tetramethylbenzidine

TBS:

Tris-buffered saline

ABC:

Avidin–Biotin-Peroxidase Complex

OD :

Densité optique

RT-qPCR :

Réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcription inverse

GAPDH:

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

CTGF:

Connective tissue growth factor

CCK:

Cell counting kit

IP :

Propidium iodide

ANOVA :

Analysis of variance