Oxyde de graphène fonctionnalisé au chitosane assisté par micro-ondes en tant que nanosystème d'administration intracellulaire contrôlée de médicaments pour une activité antitumorale synergique

Introduction

Le récepteur HER2 est un membre de la famille des récepteurs EGFR qui médie la croissance et la différenciation des cellules cancéreuses et est fortement surexprimé dans 20 à 30% des cancers du sein humains, conduisant à un phénotype tumoral métastatique et à un mauvais pronostic [1]. HER2 est également surexprimé dans environ 20 % des cancers gastriques humains [2]. Le trastuzumab, un anticorps thérapeutique monoclonal humanisé, présente des avantages thérapeutiques prometteurs en tant que traitement de première intention chez les patientes atteintes d'un cancer du sein surexprimant HER2 [3]. Cependant, le taux de réponse global au trastuzumab reste modeste :15 à 30 % en monothérapie et 50 à 75 % en association avec des chimiothérapies [4]. Parmi les patients qui répondent au trastuzumab, la majorité d'entre eux progressent finalement après la réponse initiale et acquièrent une résistance au fil du temps après un traitement continu [5]. Ainsi, il est essentiel et nécessaire de développer de nouvelles thérapies supplémentaires pour les patients surexprimant HER2 afin d'améliorer les taux de survie globale.

Les anthracyclines constituent toujours l'épine dorsale du traitement du cancer. Pour les agents anthracyclines, l'adriamycine, inhibiteur de la topoisomérase II, a été largement utilisé pour traiter de nombreux cancers, tels que les cancers du sein, du poumon et lymphoïdes [6]. L'adriamycine a une efficacité efficace dans le traitement des patientes atteintes d'un cancer du sein surexprimant HER2, en raison de la proximité entre le gène HER2 et le gène de la topoisomérase II [7]. Malgré le bénéfice clinique observé avec les thérapies à base d'anthracyclines dans le cancer du sein, la dysfonction cardiaque a restreint des applications thérapeutiques plus étendues. Dans l'essai clinique, le trastuzumab en association avec l'adriamycine a démontré une efficacité significative, tandis que la cardiotoxicité fortement dose-dépendante était un problème qui doit être résolu [8]. La libération prolongée d'agents de chimiothérapie au niveau du tissu cible du cancer est reconnue comme une bonne solution pour réduire les doses nécessaires à l'efficacité thérapeutique et améliorer les profils de sécurité [9]. Pour obtenir une meilleure efficacité antitumorale mais moins d'effets secondaires, il est urgent d'améliorer l'efficacité d'administration des médicaments anticancéreux en ciblant les cellules cancéreuses.

Les nanomatériaux à base d'oxyde de graphène (GO) se sont révélés très prometteurs dans l'administration contrôlée d'agents de chimiothérapie [10]. De nombreuses études ont montré que la toxicité de la GO est associée à sa fonctionnalisation de surface [11]. Récemment, des agents respectueux de l'environnement, tels que le chitosane et le PEG, ont été rapportés comme fonctionnalisant le GO avec un groupe fonctionnel de surface moins toxique [12, 13]. La stabilité colloïdale des nanoparticules dans les milieux biologiques est cruciale pour le développement d'un système d'administration de médicaments efficace et sûr à usage clinique [14]. Les nanofeuilles GO fonctionnalisées ont suscité une grande attention dans les applications biomédicales en raison de leurs propriétés telles que la biocompatibilité et la stabilité. En tant qu'excellent candidat pour les biomatériaux à base de graphène, la stabilité colloïdale de GO ou rGO est importante pour contrôler les performances des transporteurs de médicaments. Le GO fonctionnalisé au poly (éthylène glycol) présentait une propriété colloïdale améliorée dans les milieux de culture cellulaire [15]. P. Khanra a rapporté une nouvelle méthode pour la réduction et la bio-fonctionnalisation simultanées de GO en utilisant des cellules de levure comme biocatalyseur réducteur [16, 17]. Avinav G a présenté une biosynthèse en un seul pot de GO en utilisant un extrait de levure au cours d'un processus d'autoclave [18]. Le traitement par sonication de feuilles de GO de taille micrométrique pendant des heures a donné des nanofeuilles de GO, qui ont montré une stabilité colloïdale plus élevée que les GO de taille micrométrique ordinaires [19]. Bien que les études précédentes aient démontré le potentiel élevé du GO pour les biomatériaux, les nanofeuillets de GO bio-fonctionnalisés avec du chitosane par réduction assistée par micro-ondes à l'aide d'extrait de levure acellulaire n'ont pas été étudiés jusqu'à présent. À cette fin, une nouvelle structure d'oxyde de graphène fonctionnalisé au chitosane (ChrGO) a été construite par un système de synthèse par micro-ondes facile qui utilise un extrait de levure comme réducteur. De plus, la fonctionnalisation efficace de GO avec du chitosane biocompatible fournit une plate-forme potentielle pour le chargement et l'administration efficaces de médicaments. Des études de chargement et de libération de médicaments ont démontré que l'adriamycine était efficacement chargée et libérée des nanofeuillets ChrGO. Les composites ChrGO/adriamycine ont montré une activité antitumorale significative d'une manière dépendante de la concentration. En particulier, le traitement combiné avec ChrGO/adriamycine et trastuzumab a entraîné un effet d'inhibition de la croissance accru dans les cellules BT-474 par rapport à la monothérapie. L'efficacité antitumorale synergique de ces agents s'est révélée être médiée par l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose, qui ont finalement conduit à la mort des cellules cancéreuses. Ce travail a signalé une voie prometteuse pour la production rapide et rentable de composites ChrGO, qui délivrent des agents de chimiothérapie d'une manière contrôlée dans l'espace et dans le temps pour un traitement efficace du cancer (Schéma 1).

Biofonctionnalisation assistée par micro-ondes et réduction de l'oxyde de graphite en tant que nanosystème d'administration contrôlée de médicaments pour une thérapie à double cible dans les cellules BT-474 surexprimant HER2

Matériaux et méthodes

Matériaux

La poudre de graphite a été obtenue auprès de Qingdao Huatai Tech (Qingdao, Chine). Le chitosan et l'adriamycine ont été achetés auprès d'Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Le trastuzumab a été acheté auprès de Hoffmann-La Roche Ltd (Bâle, Suisse). Le Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été achetés auprès d'Invitrogen Corporation (Camarillo, États-Unis). Amicon ^® Les filtres ultracentrifuges ont été achetés auprès de Merck Millipore. CellTiter 96 ^® kit de test de prolifération cellulaire en solution aqueuse et Caspase-Glo ^® Le kit de système d'essai 3/7 a été obtenu auprès de Promega Corporation (Madison, USA). La levure de boulangerie sèche a été obtenue auprès de AB/Mauri Co., Ltd. Les lignées cellulaires BT-474 et Cos-7 ont été obtenues auprès de la Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Chine). Le milieu Luria-Bertani a été acheté auprès de Sangon Biotech Co., Ltd. Tous les produits chimiques étaient de qualité analytique et disponibles dans le commerce sans autre purification.

Réduction assistée par micro-ondes de la GO fonctionnelle au chitosan

L'oxyde de graphite (GO) a été préparé à partir de paillettes de graphite natif en utilisant une méthode de Hummer modifiée [14]. Pour obtenir une seule couche de GO de taille nanométrique, la GO a été exfoliée avec une sonde à ultrasons (Scientz, Chine) fonctionnant à 800 W pendant 8 h. Enfin, le GO exfolié a été dispersé dans de l'eau désionisée pour une utilisation ultérieure. Les nanofeuillets de chitosane-GO partiellement réduits (ChrGO) ont été synthétisés par réduction assistée par micro-ondes de GO avec une solution aqueuse de chitosane à l'aide d'un système de synthèse par micro-ondes. L'extrait de levure acellulaire a été utilisé pour la biosynthèse de ChrGO via une réduction assistée par micro-ondes. Tout d'abord, les cellules de levure stockées ont été activées par inoculation dans du milieu Luria-Bertani et agitation à 135 tr/min pendant 18 h à 25 °C. Les cellules de levure activées ont été transférées dans une solution de saccharose à 2 % sous agitation à 135 tr/min pendant 6 h supplémentaires à 25°C. Ensuite, 6 ml d'extrait de levure acellulaire ont été obtenus par séparation centrifuge à 2000 tr/min pendant 5 minutes. Ensuite, 50 mg de chitosane ont été dissous dans 25 mL d'une solution d'acide acétique à 2 % (v/v) et mélangés avec de l'extrait de levure [20]. Une solution de GO à 5 mg a été ajoutée sous agitation magnétique vigoureuse. Enfin, la solution telle que préparée a été transférée dans un équipement de synthèse par micro-ondes NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, Chine) pour la réaction par micro-ondes. Le schéma de chauffage du système à micro-ondes impliquait de chauffer à 80 °C pendant 5 min et de maintenir la température pendant 5 min supplémentaires. Le ChrGO obtenu a été purifié avec un filtre MWCO de 100 kDa (Millipore, États-Unis) et lyophilisé pour une utilisation ultérieure.

Caractérisations

Des images de microscopie électronique à transmission (MET) de GO nanométriques ont été obtenues sur un microscope électronique à transmission JEM-2100 avec une tension d'accélération de 200 kV (JEOL, Japon). Les spectres ultraviolet-visible (UV-Vis) ont été obtenus à l'aide d'un spectrophotomètre UV/Vis/NIR Lambda 950 (Perkin-Elmer, USA). Les spectres infrarouges à transformée de Fourier (FTIR) ont été collectés à l'aide d'un spectromètre FTIR Vertex 70 balayant de 4000 à 400 cm ⁻¹ avec des échantillons préparés sous forme de pastilles de KBr (Bruker, Allemagne). Les spectres Raman ont été enregistrés à l'aide d'un microscope Raman Senterra R200-L avec une longueur d'onde d'excitation de 532 nm (Bruker Optics, Allemagne). Les diagrammes de diffraction des rayons X (XRD) ont été examinés par un diffractomètre Bruker D8 Advance (Bruker, Allemagne). Les éléments de surface ont été enregistrés à l'aide de la spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD avec un rayonnement monochromatique Al Ka ​​(1486,6 eV) (Shimadzu, Japon). L'analyse thermogravimétrique (TGA) a été réalisée sur un PerkinElmer Pyris 1 TGA à une vitesse de chauffe de 5 °C/min de 30 à 800 °C dans une atmosphère d'azote (PerkinElmer, USA). La charge de surface des composites a été mesurée par un instrument Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, Royaume-Uni).

Chargement et libération de drogue

Quatre milligrammes de nanoparticules de ChrGO ont été mis en suspension dans 20 mL de solution aqueuse d'adriamycine (0,4 mg/mL). Après sonication pendant 0,5 h, l'agitation a été effectuée dans l'obscurité pendant 24 h, en évitant la lumière. L'adriamycine déchargée a été éliminée par centrifugation à travers des filtres 50 kDa MWCO Amicon (Millipore, USA) et lavée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 8,0) jusqu'à ce que le surnageant devienne incolore. La concentration d'adriamycine a été déterminée à l'aide d'une courbe de concentration d'adriamycine standard par spectrométrie UV-Vis à 490 nm avec un SpectraMax ^® Lecteur de microplaques M5 (Molecular Devices, USA). La quantité d'adriamycine chargée sur ChrGO a été déterminée avec une absorbance UV-Vis en mesurant la concentration de la perte d'adriamycine dans le surnageant d'Amicon ^® Filtre centrifuge Ultra-15 mL.

Les caractéristiques de libération d'adriamycine de ChrGO ont été étudiées. Le ChrGO chargé d'adriamycine a été immergé dans 10 mL de solution tampon PBS. À des intervalles spécifiés, 2 ml de solution d'adriamycine libérée détachée de ChrGO ont été collectés par centrifugation et filtration à travers des filtres Amicon MWCO de 50 kDa (Millipore, États-Unis). Le volume de solution de ChrGO/adriamycine a été maintenu constant en ajoutant 2 mL de solution tampon PBS fraîche après chaque prélèvement. La quantité d'adriamycine libérée par ChrGO a été mesurée par une absorbance UV-Vis à 490 nm par un SpectraMax ^® Lecteur de microplaques M5 (Molecular Devices, USA). Les études de libération ont été étudiées dans différentes solutions de pH (valeurs de pH 5 et 7,4).

Analyse de biocompatibilité et test d'efficacité thérapeutique

Les cellules BT-474 et Cos-7 ont été maintenues dans du RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS ou de DMEM additionné de 10 % de FBS, respectivement, et cultivées dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ à 37 °C. Le test de biocompatibilité de GO et ChrGO a été réalisé sur des cellules BT-474 ou Cos-7 via un test de cytotoxicité cellulaire. Les cellules ont été étalées dans des plaques plates à 96 puits à une densité de 3 × 10 ⁴ cellules par puits et pré-incubées pendant 18 h avant le traitement avec GO et ChrGO. Ensuite, les dilutions des agents testés ont été ajoutées aux cellules et incubées pendant encore 24 h. La viabilité des cellules a été déterminée par CellTiter 96 ^® une solution aqueuse. L'absorbance a été mesurée à 490 nm par un SpectraMax ^® Lecteur de microplaques M5 (Molecular Devices, USA).

L'efficacité des complexes ChrGO/adriamycine seuls ou en association avec le trastuzumab sur la prolifération dans les cellules BT-474 a été étudiée par un test d'inhibition de la prolifération [16]. Les cellules BT-474 ont été étalées dans des plaques plates à 96 puits à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules par puits et incubées pendant 24 h. Ensuite, des complexes ChrGO/adriamycine seuls ou en traitement combiné avec le trastuzumab ont été introduits dans les cellules BT-474 dans le milieu de culture. Après 96h d'incubation, les cellules viables ont été déterminées par CellTiter 96 ^® une solution aqueuse. L'absorbance a été mesurée avec un SpectraMax ^® Lecteur de microplaques M5 à 490 nm (Molecular Devices, USA). Les données ont été analysées par ANOVA à un facteur. p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Analyse du cycle cellulaire et dosage de l'apoptose

Pour l'analyse du cycle cellulaire, les cellules BT-474 ont été étalées dans des plaques à six puits à une densité de 5 × 10 ⁵ cellules par puits et laissé adhérer pendant 16 h. Les cellules ont été traitées avec des complexes ChrGO/adriamycine seuls ou en association avec le trastuzumab pendant 24 h. Les cellules BT-474 ont été récoltées et fixées avec de l'éthanol à 70 % (v/v) à 4 °C pendant 24 h. Les cellules BT-474 fixées ont été colorées avec une solution d'iodure de propidium (15 μg/mL) contenant de la ribonucléase A (10 μg/mL) à 25°C pendant une heure. Ensuite, les cellules ont été analysées avec un cytomètre en flux (BD Biosciences, USA). Pour le test d'apoptose, les cellules BT-474 ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à parois blanches à une densité de 2 × 10 ⁴ cellules par puits et laissé adhérer pendant 18 h. Les cellules ont été traitées avec des complexes ChrGO/adriamycine, trastuzumab seul ou en association pendant 24 h. Ensuite, le milieu de culture a été jeté, et 100 µL de Caspase-Glo ^® 3/7 réactifs ont été ajoutés à chaque puits et incubés à température ambiante pendant 2 h. La luminescence a été mesurée par un SpectraMax ^® Lecteur de microplaques M5 (Molecular Devices, USA). Les résultats ont été analysés par ANOVA à un facteur. p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Toutes les études ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation

La morphologie des feuilles GO telles que synthétisées a été caractérisée par microscopie électronique à transmission (MET). La figure 1a révèle la distribution uniforme de la taille des nanofeuillets GO en dessous de 100 nm, avec une taille moyenne d'environ 45 nm. La densité électronique élevée du GO présentait un meilleur contraste par rapport au chitosane, qui est à peine visible en raison de sa faible densité électronique et de sa nature hydratée [21]. En raison de la surface plus élevée, les feuilles de GO nanométrique ou de GO réduite ont été largement utilisées comme supports de médicaments [22]. Le diagramme de diffraction électronique à zone sélectionnée (SAED) de la figure 1c affiche les anneaux concentriques, ce qui démontre la présence d'une nature polycristalline correspondant à l'oxyde de graphène [23].

un Image MET à faible grossissement de nanofeuillets GO, b image MET haute résolution de nanofeuillets et c un modèle SAED typique de nanofeuillets GO

Pour stabiliser les nanofeuillets GO en solution physiologique, des nanofeuillets GO fonctionnalisés au chitosane ont été préparés par réduction assistée par micro-ondes à l'aide d'un système à micro-ondes [24]. Le GO-chitosan réduit résultant (ChrGO) a été analysé par spectrométrie UV-Vis. La figure 2a montre les spectres UV-Vis de GO et ChrGO. GO présentait un pic d'absorption net à 230 nm et un épaulement à 300 nm, qui est attribué au π –π * transition des liaisons aromatiques C=C et n –π * transition des liaisons C=O, respectivement [25, 26]. Après le greffage du chitosane sur GO, le pic à 230 nm s'est déplacé vers le rouge à 270 nm pour ChrGO, et l'épaule à 300 nm a manifestement disparu, ce qui a été attribué à la restauration partielle de la conjugaison électronique parmi les atomes de carbone aromatiques [27]. Une solution noire de ChrGO synthétisée est montrée sur la figure 2b, ce qui indique la formation d'oxyde de graphène partiellement réduit (p-rGO). Les nanofeuillets GO et ChrGO étaient bien dispersés dans H₂ désionisé O. La stabilité colloïdale des GO ou des dérivés GO en solution aqueuse est très importante pour leur application biomédicale. Les résultats suggèrent que le chitosane a été conjugué avec GO après la réduction.

un Spectre UV-Vis des nanofeuillets GO et ChrGO en solution aqueuse, b photographies de nanofeuillets GO et ChrGO synthétisé

Une spectroscopie FTIR a été réalisée pour caractériser la structure de GO, chitosan et ChrGO (Fig. 3a). Les pics caractéristiques de GO se situaient à 3440 cm ⁻¹ et 1376 cm ⁻¹ , correspondant respectivement aux liaisons O-H et C-OH. Le pic à 1072 cm ⁻¹ a été attribué à la vibration d'étirement de C–N–C. Notamment, les pics de molécules de chitosane à 2912 cm ⁻¹ et 2848 cm ⁻¹ ont été attribuées aux vibrations d'étirement du CH₃ – et –CH₂ – [28, 29]. Le p-rGO fonctionnalisé avec du chitosane a entraîné de nouvelles liaisons, ce qui a conduit à de nouveaux pics dans les spectres ChrGO. Il y a une diminution significative des intensités de la bande C=O à 1636 cm ⁻¹ dans ChrGO par rapport à celui de GO, ce qui suggère que le processus de réduction a éliminé les groupes contenant de l'oxygène de GO [30]. Le spectre FTIR de ChrGO a confirmé la conjugaison réussie du chitosane sur GO. De plus, la spectroscopie Raman a été utilisée pour caractériser les propriétés électroniques et la structure du graphène. La bande G est attribuée au E _2g phonons de sp ² domaines du carbone, tandis que la bande D est attribuée à la vibration de sp ³ domaines d'atomes de carbone et atomes de carbone désordonnés. L'intensité de la bande D indique les caractéristiques des désordres et des défauts des feuilles de carbone [31]. La réduction des nanofeuillets GO a également été analysée dans le rapport signal de la bande D versus G [32]. Le spectre Raman représentatif de GO montre deux pics caractéristiques de la bande D (1341 cm ⁻¹ ) et la bande G (1591 cm ⁻¹ ) dans la figure 3b. Modification de l'intensité relative de I_D /I_G valeur illustre le changement de l'état de conjugaison électronique du GO dans le processus de réduction [33]. Le décalage de la bande D montre une fonctionnalisation réussie du GO réduit. La valeur de I _D /Je _G passe de 0,99 (GO) à 1,12 (ChrGO), ce qui est attribué à l'introduction de sp3 défauts après fonctionnalisation et récupération incomplète de la structure caractéristique du graphène [34]. Cette observation est en bon accord avec le rapport précédent et suggère la formation de graphène fonctionnalisé par le chitosane [16].

un Spectres FTIR de GO, ChrGO et chitosan, b Spectres Raman de GO et ChrGO

La composition de surface de ChrGO a été confirmée par XPS. L'analyse complète du spectre XPS de ChrGO montre trois pics à 284, 399 et 533 eV, qui sont attribués respectivement aux C1, N1 et O1 (Fig. 4a). L'analyse élémentaire relative a montré une augmentation des niveaux d'oxygène et d'azote de ChrGO, avec une diminution associée de la teneur en carbone par rapport à GO. Les spectres C1s haute résolution de ChrGO illustrés à la figure 4b présentent quatre pics séparés, correspondant à C–C ou C=C (sp ² , 284,7 eV), C-O (époxy/hydroxyles, 286,4 eV), C=O (sp ³ , 288,2 eV) et des liaisons O=C–O (carboxylates, 289,1 eV). L'apparition d'un pic amide dans ChrGO apporte la preuve de la fonctionnalisation du chitosane sur GO [35]. Les groupes fonctionnels hydrophiles abondants à la surface ont rendu ChrGO hautement soluble dans une solution aqueuse, ce qui est cohérent avec les résultats du FTIR. Les biomolécules telles que les acides aminés réducteurs et l'acide alpha-linolénique dans l'extrait de levure peuvent avoir un rôle important dans la fabrication assistée par micro-ondes de ChrGO [20].

un Enquête sur les spectres XPS de GO et ChrGO, b spectres haute résolution des C1

Le diagramme de diffraction des rayons X (XRD) de GO et ChrGO est présenté sur la figure 5a. Dans les spectres GO XRD, le pic majeur à 11,0° et le pic faible à 20,7° présentent clairement la structure du graphite. Le pic de diffraction caractéristique à 11,0° correspond au plan (001) de GO, qui montre la synthèse réussie de GO [36]. La petite bosse entre 20° et 24° montre les fragments graphitiques, qui sont attribués au graphite vierge non oxydé [37]. Avec la fonctionnalisation du chitosane, le pic (001) de GO disparaît, tandis que le large pic de diffraction à 21,4° devient proéminent. Ce changement peut être attribué à la réduction du GO, où la réduction rend le pack rGO plus serré que le GO. La réflexion (002) de l'échantillon ChrGO est très large, suggérant que l'échantillon est très mal ordonné le long de la direction d'empilement, ce qui peut être attribué à la réduction incomplète de GO [33]. Les comportements de décomposition de GO, chitosan et ChrGO ont été étudiés par analyse de gravité thermique (TGA) [38]. Les courbes TGA de ChrGO, GO et de chitosane sont présentées sur la figure 5b, qui ont été mesurées dans une atmosphère d'azote. GO a commencé à perdre du poids en dessous de 100 °C, ce qui a été attribué à l'élimination de l'eau libre adsorbée dans la structure empilée [39]. Le GO a perdu 42 % de son poids dans la plage de 191 à 231 °C, ce qui était lié à la décomposition des groupes labiles contenant de l'oxygène. Le taux de perte de poids de ChrGO à 100–250 °C est significativement inférieur à celui de GO, et il est évident que ChrGO a montré un schéma de décomposition différent de celui de GO. L'élimination thermique de ChrGO et de chitosane pur a eu lieu de 250 à 440 °C, ce qui est lié à la dépolymérisation et à la pyrolyse de groupes fonctionnels plus stables, tels que les unités glycosidiques du chitosane et les groupes carboxyle [40]. Par rapport à GO, ChrGO était thermiquement stable et a donné une perte de poids importante de 36% dans la première étape de décomposition à 250-440 °C, alors que peu de perte de poids est affichée pour le GO. La perte de poids significative dans la région à haute température de 450 à 800 °C était due à la dégradation thermique du squelette carboné, qui pourrait être attribuée aux résidus de chitosane et aux biomolécules d'extrait de levure tels que les acides aminés [41].

un Modèles XRD de GO et ChrGO, b Courbes TGA de GO, chitosan et ChrGO

La charge de surface de GO et ChrGO a été mesurée par un instrument Malvern Zeta Nano ZS-90, qui est un paramètre important de la stabilité colloïdale. La densité de charge de surface plus élevée sur les nanofeuillets GO crée une dispersion colloïdale plus stable [42]. Comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Fig. S1, le potentiel zêta de GO a diminué de manière monotone de  − 10,7 mV à pH 3 à  − 35,5 mV à pH 11, ce qui a confirmé la charge négative à la surface des nanofeuillets GO. La valeur du potentiel zêta pour ChrGO était comparativement inférieure au potentiel de GO à n'importe quel pH allant de 3 à 11. Les nanofeuillets de ChrGO ont affiché une stabilité sur toute la plage de valeurs de pH, tandis que les colloïdes GO réduits étaient moins stables dans l'eau déminéralisée en raison de augmenté π –π empilement dans les surfaces désoxygénées [43]. Bien que certains groupes amine libres soient présents à la surface du chitosane [44], un potentiel zêta plus élevé de ChrGO n'a pas été atteint. La valeur de potentiel zêta inférieure de ChrGO pourrait être attribuée aux molécules d'acides aminés négatives abondantes de l'extrait de levure, qui ont amélioré la stabilité colloïdale dans la solution physiologique [20]. La surface chargée négativement de ChrGO les rend potentiellement applicables pour le chargement et l'administration du médicament.

Biocompatibilité de ChrGO tel que synthétisé

La biocompatibilité de ChrGO telle que synthétisée est importante pour ses applications dans l'administration de médicaments. La cytotoxicité cellulaire de ChrGO et GO a été étudiée par un test de cytotoxicité. Les cellules Cos-7 et les cellules BT-474 ont été incubées en présence de ChrGO ou de GO pendant 24 h. Les résultats de la cytotoxicité cellulaire sont présentés sur la figure 6. On pourrait conclure que ChrGO n'a montré aucune cytotoxicité cellulaire évidente pour les cellules Cos-7 et BT-474. Même à une concentration de 100 μg/mL, la viabilité cellulaire était supérieure à 90 %. Cependant, GO présentait une cytotoxicité cellulaire significative d'une manière dose-dépendante, avec seulement 73,0 ± 0,5% et 71,0 ± 0,5% de survie cellulaire pour les cellules Cos-7 et BT-474 à une concentration de 100 μg/mL, respectivement. Les résultats ont démontré que le chitosane fonctionnalisé à la surface de GO présentait une cytotoxicité très faible et une biocompatibilité améliorée. Il a été rapporté que la fonctionnalisation de surface de GO avec des macromolécules atténue remarquablement ses effets cytotoxiques [45]. Hu et al. ont rapporté que le sérum bovin fœtal dans un milieu cellulaire diminuait de façon marquée la cytotoxicité cellulaire de GO dans les cellules A549 du cancer du poumon non à petites cellules [46].

Biocompatibilité de GO et ChrGO. Des concentrations variables de nanoparticules ont été cultivées avec a Cellules Cos-7 et b cellules BT-474, et leur effet sur la viabilité cellulaire a été déterminé

Chargement et libération du médicament

L'application biomédicale potentielle de ChrGO en tant que vecteur de médicament est mesurée par le comportement de chargement et de libération du médicament. Les caractéristiques structurelles des dérivés de graphène sont très efficaces pour l'administration de médicaments aromatiques en raison de leur très grande surface spécifique. L'adriamycine est l'une des chimiothérapies tumorales primaires contre une variété de malignités hématologiques et de tumeurs solides et est fréquemment utilisée comme médicament modèle pour évaluer les systèmes d'administration de médicaments dérivés du graphène [47]. La capacité de chargement de l'adriamycine sur les nanofeuillets ChrGO a été vérifiée par le pic caractéristique d'absorbance UV-Vis de l'adriamycine à 490 nm. Comme prévu, l'efficacité de chargement maximale de l'adriamycine liée aux nanofeuillets ChrGO atteignait 169,8%, ce qui était partiellement attribué à la grande surface des nanofeuillets ChrGO. Les nanocomposites ChrGO/adriamycine chargés d'adriamycine ont été facilement dispersés dans un tampon physiologique, affichant une solution transparente avec une couleur légèrement rougeâtre.

Pour explorer le profil de libération de l'adriamycine à partir des complexes ChrGO/adriamycine, les différentes valeurs de pH du PBS ont été introduites pour imiter les environnements des cellules tumorales. Fichier supplémentaire 1 :La figure S2 montre les profils de libération cumulée d'adriamycine à partir de ChrGO/adriamycine à pH 5 et 7,4. L'adriamycine libérée de ChrGO/adriamycine était caractérisée par une libération initiale rapide puis une étape de libération plus lente dans une solution de PBS à pH 5,0. La libération cumulée d'adriamycine était de 6,5% au cours des 3 premières heures, puis a affiché une lente augmentation jusqu'à 26,7% en 96 heures à pH 5,0. En revanche, le pourcentage d'adriamycine de ChrGO/adriamycine a augmenté plus lentement et était plus faible à pH 7,4, affichant un pourcentage de libération d'adriamycine de 2,5 % au cours des 3 h précédentes à 7,4 % en 96 h. Des études antérieures ont montré les profils de libération de médicaments à partir de GO fonctionnalisée très lentement dans un milieu à pH 7,4 [48]. La protonation des groupes carboxyle sur ChrGO diminue l'empilement π–π, la liaison H et les interactions électrostatiques entre l'adriamycine et ChrGO, facilitant la libération d'adriamycine dans le milieu acétique [49]. La sensibilité au pH donne à ChrGO/adriamycine un potentiel pour l'administration de médicaments spécifiques au site, ce qui augmente par la suite la cytotoxicité dans les cellules tumorales.

Efficacité thérapeutique des complexes ChrGO/Adriamycine

L'efficacité thérapeutique des complexes ChrGO/adriamycine dans les cellules cancéreuses BT-474 surexprimant HER2 a été étudiée par le test d'inhibition de la prolifération. La surexpression du récepteur HER2 a un rôle clé dans la transformation des cellules cancéreuses du sein BT-474. Le traitement par le trastuzumab seul, un anticorps monoclonal anti-HER2, entraîne une inhibition significative de la croissance des cellules BT-474 [50]. As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.

un In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p < 0,01, ****p < 0.001

To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis

To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].

un Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p < 0,01, ****p < 0.001

To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.

Conclusions

In the present work, the chitosan-functionalized graphene oxide nanosheets were structured with microwave-assisted reduction, which demonstrated biocompatibility and good dispersion stability. The as-prepared nanocomposites showed high efficiency of drug encapsulation and delivery. The ChrGO/adriamycin nanosheets displayed significant growth inhibition of BT-474 in a dose-dependent manner. The combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in superior therapeutic efficacy in BT-474 cells compared to that with each agent alone. The results are favourable for the development of intracellular nanocarriers to deliver drugs in a controlled manner, which is expected to improve the therapeutic effect on HER2-overexpressing cancer therapies.

Disponibilité des données et des matériaux

Les ensembles de données soutenant les conclusions de cette étude actuelle sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Abréviations

ChrGO:

Chitosan-functionalized graphene oxide

EGFR:

Epidermal growth factor receptor

HER2:

Human epidermal growth factor receptor-2

GO :

Oxyde de graphène

DMEM :

Dulbecco's modified Eagle medium

FBS :

Sérum fœtal bovin

TEM :

Microscopie électronique à transmission

UV–Vis:

Ultraviolet-visible

FTIR :

Transformée de Fourier infrarouge

XRD :

Diffraction des rayons X

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

TGA :

Analyse thermogravimétrique

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

SAED :

Diffraction électronique à zone sélectionnée

TGA :

Gravimetric analysis