hGC33-Modified and Sorafenib-Loaded Nanoparticles ont un effet anti-hépatome synergique en inhibant la voie de signalisation Wnt

Introduction

Le Glypican3 (GPC3) est un protéoglycane d'héparane sulfate exprimé à la surface des cellules par un mécanisme impliquant des ancres glycérophosphatidylinositol [1]. Bien que GPC3 soit exprimé dans une variété de tissus au cours du développement, son expression est au moins partiellement inhibée dans la plupart des tissus adultes par la méthylation de l'ADN dans la région promotrice [2]. Cependant, la protéine GPC3 est surexprimée chez environ 70% des patients atteints de carcinome hépatocellulaire (CHC) [3, 4] et stimule la transduction du signal Wnt classique [5] par interaction avec le ligand Wnt, qui favorise la liaison Wnt/frizzled pour favoriser la croissance du HCC [6] . L'activation de la voie de signalisation Wnt classique est l'un des événements les plus fréquents associés à la transformation maligne du CHC [7, 8]. Sur la base de la capacité de GPC3 à augmenter la signalisation Wnt, nous avons émis l'hypothèse que la surexpression de GPC3 favorise la croissance du CHC en stimulant la voie Wnt classique.

Anticorps monoclonal thérapeutique qui reconnaît un épitope dans la partie C-terminale de GPC3 (524-563) (hGC33), qui reconnaît l'épitope C-terminal de GPC3 (524-563), inhibe la croissance tumorale dans les xénogreffes sous-cutanées de HepG2 et Huh- 7 chez la souris [9, 10]. hGC33 a été humanisé par transplantation complémentaire de la région de décision, et son effet anticancéreux est aussi efficace que hGC33 pour la xénotransplantation HepG2, et hGC33 a été utilisé dans des essais cliniques [11]. Ces résultats suggèrent que hGC33 a une activité antitumorale importante, et le traitement anti-GPC3 inhibera directement la prolifération et/ou la survie des cellules HCC en bloquant Wnt et/ou d'autres voies de signalisation.

Cependant, en raison de la pathogenèse complexe du CHC, l'efficacité du blocage de GPC3 seul est limitée [12]. Par conséquent, l'exploration du mécanisme détaillé de la pathogenèse du CHC et l'identification de biomarqueurs prometteurs pour le diagnostic et le pronostic du CHC peuvent aider à fournir des cibles thérapeutiques efficaces et à améliorer le pronostic des patients. Des anticorps anti-GPC3 ont été proposés pour augmenter la sensibilité du CHC aux agents chimiothérapeutiques [13]. L'activité anti-tumorale de hGC33 en association avec des médicaments de chimiothérapie standard a été évaluée récemment [14]. Le sorafénib est un nouveau médicament oral contre le CHC qui peut inhiber directement la prolifération des cellules tumorales en bloquant la voie de signalisation cellulaire médiée par RAF/MEK/ERK pour freiner la croissance tumorale [15, 16]. Cependant, la distribution non ciblée du sorafénib in vivo et les signaux Wnt anormalement activés dans le CHC limitent l'efficacité du médicament et augmentent ses effets secondaires [14,15,16]. Wnt se lie aux récepteurs de la famille Frizzled pour activer la transduction du signal intracellulaire qui régule la prolifération cellulaire, l'apoptose et la migration cellulaire, et provoque une résistance aux médicaments dans de nombreuses tumeurs, telles que le CHC [17,18,19].

Dans les modèles de xénotransplantation HepG2, la combinaison de hGC33 et de sorafénib est plus efficace pour inhiber la croissance tumorale que le sorafénib seul [15], et l'administration de médicaments avec des nanosupports polymères a reçu beaucoup d'attention dans le traitement du cancer. Les nanosupports chargés de médicaments anticancéreux peuvent empêcher la distribution non spécifique et la dégradation non spécifique in vivo, améliorer la biodisponibilité des médicaments et le ciblage anti-tumoral, et simplifier l'évaluation de la pharmacocinétique et du traitement [15, 16]. Dans une variété de nanoparticules à base de polymère, les formulations à base de poly (acide lactique et glycolique) (PLGA) sont considérées comme des vecteurs de médicaments idéaux et sûrs [17, 18]. À cet égard, le poly(éthylène glycol)-b -poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PEG-b -PLGA) sont à base de polyéthylène glycol et de copolymères PLGA, qui sont sûrs et non toxiques après hydrolyse, et ont été approuvés par la Food and Drug Administration des États-Unis [19,20,21,22]. Par conséquent, injection intraveineuse avec nanocarrier de PEG-b -Le copolymère PLGA est une stratégie prometteuse pour obtenir une livraison ciblée et améliorer l'efficacité. De plus, l'application de l'anticorps spécifique hGC33 contre les molécules GPC3 sur la membrane cellulaire du CHC peut non seulement améliorer la délivrance du ciblage des nanomédicaments in vitro et in vivo [18, 19], mais également bloquer Wnt et/ou d'autres voies de signalisation liées à GPC3, inhiber la prolifération et/ou la survie des cellules cancéreuses, et peut réaliser une activité antitumorale synergique.

Dans cette étude, nous avons exploré si le copolymère modifié par anticorps hGC33 PEG-b -Les nanoparticules PLGA peuvent faciliter l'administration de sorafenib (hGC33-SFB-NP) au CHC in vivo et in vitro, et améliorer l'efficacité du traitement du CHC grâce au ciblage actif du CHC pour modifier la pharmacocinétique du médicament. Selon la taille des particules, le potentiel zêta, la morphologie des particules, l'efficacité de piégeage du médicament, la capacité de chargement du médicament et la libération du médicament in vitro, le NP ciblé a été caractérisé de manière exhaustive. La capacité de ciblage in vitro est caractérisée par l'absorption cellulaire des cellules d'hépatome HepG2. La biodistribution et l'effet thérapeutique synergique de hGC33-SFB-NP sur le CHC ont été évalués en comparant le sorafenib et le SFB-NP. Nos résultats ont démontré que hGC33-SFB-NP peut cibler GPC3 ⁺ HCC. Il peut inhiber la progression du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et l'invasion tumorale en inhibant les voies de signalisation Wnt et Ras/Raf/MAPK et en inhibant de manière synergique la progression du cancer du foie.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'anticorps hGC33, bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), 4′,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI), 5,5′,6 L'iodure de ,6'-tétrachloro-1,1',3,3'-tétraéthyl-benzimidazolylcarbocyanine (JC-1) et le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). Chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl-carbodiimide et N -hydroxysuccinimide ont été obtenus auprès de Qiyun Biotech (Guangzhou, Chine). Le kit de quantification des protéines de l'acide bicinchoninique (BCA), la coumarine-6 ​​et le kit de détection de l'apoptose Annexin V-FITC/PI ont été achetés auprès de Beyotime Biotechnology (Shanghai, Chine). PEG-b -Copolymère dibloc PLGA-maléimide (mal-PEG-b -PLGA ; 25 000-30 000 Da, PLGA, LA:GA, w/w ; PEG, 13-15 %) a été acheté auprès de Polyscitech (West Lafayette, IN, USA). Kit d'anticorps PI3K (9655#), kit d'anticorps p-Akt (9916#), kit d'anticorps mTOR (9964#), kit d'anticorps de la famille Bcl-2 (9942#), kit d'anticorps d'apoptose (9915#) et anti-chèvre secondaire les anticorps de lapin et anti-souris ont été achetés auprès de Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA); la cycline Bl et la kinase dépendante de la cycline ont été achetées auprès d'Abcam Biological Technology (USA). Les anticorps contre le phospho-Rb, la cycline D1, la kinase du point de contrôle 1 (CHK1), P53, le gène de susceptibilité au cancer du sein phosphorylé 1 (p-BRCA1), RAD51, le cytochrome C et la métalloprotéinase matricielle (MMP2 et MMP9) ont été achetés auprès d'Abcam (États-Unis) . Tous les autres produits chimiques, réactifs et solvants de qualité analytique sont obtenus auprès de fournisseurs standard et ont été utilisés sans autre purification.

Cellules et animaux

La lignée cellulaire HCC HepG2 (obtenue de la collection de culture de type américain (Manassas, VA, USA) a été cultivée dans le milieu DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) additionné de 10 % de FBS (HyClone, Logan, UT, USA) et 80 U/ml de pénicilline et 80 μg/ml de streptomycine dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ à 37 °C. Des souris nudes BALB/C pesant 20 à 22 g (5 à 6 semaines) ont été fournies par Nanjing Junke Biotechnology Co., Ltd. (Chine). Des souris nude BALB/C ont été élevées dans une salle SPF. Tous les soins et traitements des animaux ont été effectués conformément aux exigences de soins des animaux de l'Université des sciences et de la technologie d'Anhui. Tous les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université des sciences et technologies d'Anhui (N° d'approbation :2019dw013).

Préparation des NP

Pour préparer les NP, mal-PEG-b -PLGA et SFB ou coumarine-6 ​​ont été pesés et dissous dans la phase organique (3:2 v/v dichlorométhane/acétone). La solution a été ajoutée goutte à goutte à une solution d'alcool polyvinylique (PVA) (5 % p/v) avec un vortex continu. Le mélange a été soniqué par intermittence avec un sonicateur à sonde (puissance de sortie de 550 W, 8 fois) sur de la glace pour créer une émulsion huile-eau. L'émulsion a été ajoutée à une solution de PVA (1% p/v) sous agitation magnétique. Les NP de SFB et de coumarine-6 ​​ont été collectées par centrifugation à 8000 tr/min pendant 30 min et lavées trois fois dans de l'eau Milli-Q.

Pour générer hGC33-NP par des liaisons thioéther formées par la réaction du maléimide avec des résidus sulfhydryle libres dans l'anticorps hGC33, l'anticorps hGC33 a été mélangé avec des NP fonctionnalisées par maléimide dans un rapport molaire de 5:1 (hGC33 :mal-PEG-b -PLGA) et incubé à 4 °C pendant 16 h sous agitation continue. hGC33 a été conjugué aux NP par la réaction de groupes sulfhydryle sur l'anticorps hGC33 avec les groupes maléimide des chaînes PEG. Les anticorps non conjugués ont été éliminés par passage sur des colonnes Sepharose CL-4B. La conjugaison efficace des protéines a été confirmée avec un kit BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Caractérisation des nanoparticules (NP)

Morphologie, taille des particules, efficacité d'encapsulation (EE) et stabilité des NP

La morphologie des NPs a été évaluée par microscopie électronique à transmission (MET, H-600; Hitachi, Tokyo, Japon). Les hGC33-NP sans médicament et les NP sans médicament ont été enregistrées par spectrophotomètre FTIR (Thermo Nicolet, Madison, WI, États-Unis) en utilisant du bromure de potassium. La taille moyenne des particules et le potentiel zêta des NP ont été caractérisés avec un Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) à 20 °C. L'efficacité d'encapsulation du médicament (EE) et l'efficacité du contenu de chargement du médicament (LC) ont été évaluées par ultrafiltration. Les échantillons ont été chargés dans un dispositif d'ultrafiltration (100 kMWCO; Sartorius, Göettingen, Allemagne) et centrifugés à 8000 tr/min pendant 25 min à 4 °C pour éliminer le médicament libre. Le même volume de chaque échantillon a été dissous dans de l'acétonitrile pour confirmer la quantité totale de médicament. La concentration a été mesurée par chromatographie liquide à haute performance. La longueur d'onde d'absorption était de 266 nm. La formule suivante a été utilisée pour calculer l'EE du médicament (%) des NP :(poids du médicament piégé/poids total du médicament)   × 100 %. La CL (%) a été calculée comme suit (poids du médicament encapsulé/poids des NP) x 100 %. Pour comprendre la stabilité des NP à température ambiante, le changement de taille des NP a été évalué par diffusion dynamique de la lumière (DLS) à des moments prédéterminés (0,5, 1, 2, 4, 8, 12 h, 16 h, 20 h et 24 h) à 25 °C.

Drogue de libération in vitro du dosage de drogue et d'absorption cellulaire

Le médicament des NP a été étudié à l'aide de sacs de dialyse avec un seuil de poids moléculaire de 10 kDa. Brièvement, 1 mL de NP a été chargé dans une poche de dialyse (MWCO 8 000 à 10 000 Da ; Spectrum Labs Inc., CA, USA). Les sacs de dialyse ont été immergés dans du PBS et agités avec un agitateur magnétique à 25°C. Les profils de libération de médicament des NP ont été mesurés dans 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate 0,2 M (PBS ; pH = 7,4) pendant 7 jours. La concentration de médicament dans les échantillons a été mesurée par chromatographie liquide à haute performance. Dans des études ultérieures, hGC33-coumarine 6-NP ayant la même taille de particule que hGC33-SFB-NP a été utilisé pour évaluer le ciblage de hGC33-SFB-NP. HepG2 (GPC3 ⁺ ) et Li-7 (GPC3 ⁻ ) ont été incubés avec hGC33-coumarine 6-NP pendant 0,5, 2 ou 4 h à 37 °C dans 5 % de CO_2, respectivement. Les cellules co-cultivées ont été lavées et fixées avec du formaldéhyde à 4 % pendant 10 min ; les noyaux cellulaires ont été colorés avec 5 μg/mL Hoechst 33,342 pendant 15 min pour localiser les NP intracellulaires. La microscopie confocale pour analyser les images de nanoparticules intracellulaires a été analysée par microscopie confocale (Olympus FV1000 ; Olympus Corporation, Tokyo, Japon).

Effet cellulaire in vitro

La cytotoxicité de hGC33(Ab) libre, de SFB libre, de hGC33-null-NP ou de hGC33-SFB-NP a été déterminée à l'aide d'un test MTT. HepG2(GPC3 ⁺ ) et Li-7 (GPC3 ⁻ ) les cellules en phase logarithmique ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits à une densité de 4000 cellules par puits suivie d'une incubation pendant 48 h à 37 °C dans 5% de CO₂ . Les cellules ont été traitées avec hGC33, SFB libre, hGC33-null-NP ou hGC33-SFB-NP pendant 48 h à 37 °C dans 5% de CO₂ . Après co-culture pendant un temps défini, l'activité anti-prolifération cellulaire a été déterminée par dosage MTT comme décrit [20]. L'absorbance de chaque puits a été mesurée à 490 nm et calculée à la moitié de la valeur de concentration inhibitrice maximale (IC 50) avec SPSS 17.0.

Mesure de la capacité d'invasion cellulaire

Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été ensemencées sur des plaques 6 puits à une densité de 5 × 10 ⁴ cellules/puits, gratté avec une tête d'aspiration et remplacé par un milieu de culture sans sérum. La cicatrisation des plaies a été enregistrée à 0 h, 24 h et 48 h dans le groupe témoin et le groupe expérimental. Dans le même temps, le même nombre de cellules a été inoculé dans des chambres Transwell et traité avec du hGC33 libre, du SFB libre, du hGC33-null-NP ou du hGC33-SFB-NP. Cinq cents microlitres de milieu FBS à 10 % ont été ajoutés dans la chambre inférieure. Après incubation pendant 24 h, la chambre Transwell a été retirée et les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % et colorées avec du violet de cristal à 0,1 %. La taille de la cicatrisation et le nombre de cellules de migration ont été calculés pour évaluer la capacité de migration.

Détermination du cycle cellulaire

Après incubation pendant une nuit dans des plaques à 6 puits, les cellules ont été traitées avec du hGC33 (Ab) libre, du SFB libre, du hGC33-null-NP ou du hGC33-SFB-NP pendant 24 h, puis collectées et fixées avec de l'éthanol. Après coloration à l'iodure de propidium, une cytométrie en flux a été réalisée et le cycle cellulaire a été analysé avec modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME).

Western Blot

Pour évaluer l'état d'activation de la voie du signal et l'expression des molécules cibles, les cellules ont été incubées pendant la nuit dans des plaques à 6 puits, et des hGC33 libres, des SFB libres, des hGC33-null-NP ou des hGC33-SFB-NP ont été appliqués pendant 24 h. . Les cellules de chaque groupe de traitement ont été recueillies et les protéines ont été extraites et mesurées. La concentration en protéines a été mesurée et calibrée avec le kit de protéines BCA (Biosharp, Hefei, Chine). Les protéines des échantillons ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à douze sulfates d'alkyle, transférées sur une membrane PVDF et scellées avec du lait écrémé. Le premier anticorps (dilué à 1:1000) a été incubé pendant une nuit à 4°C, et les seconds anticorps (1:2000) ont été incubés pendant 1 h à température ambiante. Les bandes ont été visualisées avec des substrats ECL (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, États-Unis), et les images ont été affichées par un système d'analyse d'images sur gel, et la -actine a été utilisée comme contrôle.

Activité anti-tumorale in vivo

L'inhibition de hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, SFB-NP et hGC33-SFB-NP sur la croissance de HCC in vivo a été déterminée. Conformément aux règlements et directives sur la santé animale du comité d'éthique de l'Université de technologie d'Anhui, toutes les expériences ont été menées sur des souris BALB/c en cage dans une salle à température contrôlée (23 ± 2 °C) avec 12 h/12 h de lumière/ cycle sombre. Une suspension de 50μl contenant 5 × 10 ⁶ des cellules HepG2 vivantes ont été injectées par voie sous-cutanée dans l'abdomen droit de souris BALB/c femelles âgées de 5 semaines (20 à 22 g). Lorsque le volume tumoral atteint environ 50 mm ³ , les souris ont été réparties au hasard en 6 groupes (10 souris dans chaque groupe). Contrôle salin normal NS (200 mg/kg null NP dans 200 L PBS), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP dans 200 μL PBS, équivalent à hgc33 = 100 μg/kg/time), hGC33 libre (hGC33 in 200 μL de PBS, 100 μg/kg/heure), SFB libre (dose SFB :8 mg/kg/heure), SFB-NP (dose SFB :8 mg/kg/heure) et hGC33-SFB-NP (équivalent à SFB = 8 mg/kg/time, hGC33 = 100 μg/kg/time) ont été injectés par la veine caudale tous les 2 jours pendant 10 fois. Le poids et la taille de la tumeur des souris ont été mesurés tous les quatre jours. La formule de calcul du volume tumoral était le volume = 0,5 × L × W ² , où L et W représentent respectivement la longueur et la largeur de la tumeur. Quatre semaines après l'administration, les animaux ont été anesthésiés avec de l'éther diéthylique, et la taille et le poids de la tumeur ont été mesurés. De plus, la tumeur, le cœur, le foie, les reins, les poumons et la rate ont été prélevés, fixés avec une solution de paraformaldéhyde à 4 %, inclus dans de la paraffine, sectionnés et colorés à l'hématoxyline et à l'éosine pour évaluer les changements histologiques par microscopie numérique.

Analyse statistique

Les données sont présentées comme la moyenne ± ± écart type (SD) et ont été évaluées par analyse de variance avec SPSS 18.0. Des comparaisons statistiques par paires ont été effectuées à l'aide d'un test t de Student bilatéral. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives pour P < 0,05.

Résultats

Caractérisation des IP et libération des médicaments In Vitro

Étant donné que le diamètre et les propriétés de surface des NP affectent l'absorption cellulaire, la libération de médicaments et la distribution des NP in vivo, nous avons caractérisé le NP préparé avec les paramètres correspondants. La morphologie, la taille des particules et la distribution de la taille des particules des polymères SFB-NP, hGC33-null-NP et hGC33-SFB-NP sont résumées dans la Fig. 1. La morphologie de hGC33-SFB-NP observée au microscope électronique à transmission (Fig. . 1a) montre des noyaux rigides avec des bords flous, ce qui indique que hGC33 est présent à la surface des NP. Les tailles de particules de SFB NP, hGC33-null-NP et hGC33-SFB-NP allaient de 100 à 150 nm et présentaient une distribution granulométrique unimodale typique. Le diamètre moyen de hGC33-SFB-NP (120,2 ± 10,2 nm) était légèrement plus grand que celui de hGC33-null-NP, SFB-NP et null NP (Fig. 1a, Tableau 1). Des films minces sphériques peu clairs avec une seule surface étaient présents à la surface de hGC33-SFB-NP et hGC33-null-NP, ce qui indiquait que l'anticorps hGC33 était présent à la surface des NP. La taille accrue pour hGC33-SFB-NP et hGC33-null-NP a confirmé l'existence du film hGC33. La synthèse de hGC33-SFB-NP a été confirmée avec ¹ H-RMN (Fig. 1b) avant préparation des NP. Les pics à 5,2 ppm et 1,58 ppm ont été attribués aux protons -CH3 de l'acide lactique ; le pic à 4,8 ppm a été attribué à -OCH2- de l'acide glycolique ; et le pic à 3,6-3,8 ppm a été attribué aux protons -CH2CH2O- des unités de répétition PEG. Chimie de surface du PEG-b -PLGA et Ab-PEG-b -Les NPs PLGA ont également été étudiées par spectroscopie FTIR (Fig. 2c). Dans le spectre du PEG-b -Polymère PLGA, une bande solide à environ 1750 cm ⁻¹ proviennent de l'étirement des groupes carbonyle (C = O) dans la chaîne PLGA. Une bande à 2880 cm ⁻¹ était due à l'étirement d'un groupe a-CH dans la chaîne PEG. Au même moment, un pic est apparu à 2520 cm ⁻¹ que nous avons attribué au pic d'étirement -SH de l'anticorps hGC33. Le  ¹ Les résultats de la RMN H et du FTIR ont indiqué que l'anticorps était greffé sur le squelette du PEG-b -Polymères PLGA.

Caractérisation des NP. un Caractérisation MET des NP, la barre d'échelle indique 100 nM ; b le  ¹ Spectres RMN H de hGC33-PLGA-b synthétique -PEG dans CDC13; c Spectres FTIR de hGC33-PEG-b -PLGA et PEG-b - PLGA ; d profils de libération cumulés de SFB-NP et hGC33-SFB-NP dans du PBS (pH = 7,4) à 37 °C ; e changements de taille des NP incubées dans un milieu DMEM contenant 10 % de FBS pendant 14 jours ; f changements de taille des NP incubées dans du PBS pendant 14 jours. SFB, sorafénib; MET, microscopie électronique à transmission; NPs, nanoparticules; ¹ RMN H, ¹ Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire H ; FTIR, Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

Expression de GPC3 et absorption de hGC33-coumarin6-NP dans les cellules Li-7 et HepG2. Les cellules, inoculées dans la plaque de culture, ont été lavées avec du PBS et incubées avec 100 μg/ml de hGC33-coumarin6-NP dans du DMEM pendant 2, 4 et 8 h. Les noyaux ont été colorés au DAPI et les cellules ont été fixées et détectées par microscopie confocale à balayage laser. GPC3 n'a pas été détecté dans les cellules Li-7, mais était fortement exprimé dans les cellules HepG2 comme détecté par immunocytochimie. La barre d'échelle indique 50 μM

Fait intéressant, les nanoparticules hGC33-SFB-NP et SFB-NP dans un milieu DMEM contenant 10 % de FBS (pH = 7,4) ont eu une libération rapide du médicament jusqu'à environ 4 jours, puis une libération relativement lente et stable du médicament ; la libération cumulative de SFB de hGC33-SFB-NP et SFB-NP sur 20 jours était d'environ 77 % et 65 %, respectivement (Fig. 1d). La différence peut être due à la molécule hydrophile à la surface du PEG-b -Matrice PLGA, qui peut accélérer la dégradation des nanoparticules en augmentant l'hydratation et en favorisant ainsi l'hydrolyse. Pour déterminer la stabilité des NP préparées, les hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP et SFB-NP ont été placés dans du milieu DMEM contenant 10 % de FBS (pH = 7,4) et dans du PBS (pH = 7,4 ). Les tailles des différentes NP sont restées stables pendant plus de 2 semaines. Le SFB a été libéré de hGC33-SFB-NP de manière soutenue et stable pendant 14 jours, mais il y a eu un changement modeste de la taille des particules dans le milieu DMEM par rapport à celle dans 10 % de FBS (Fig. 1e, f). La stabilité de hGC33-SFB-NP serait appropriée pour SFB ayant un rôle biologique soutenu.

Un potentiel zêta élevé peut provoquer une forte interaction électrostatique répulsive entre les NP et maintenir la stabilité du système de dispersion des NP [23, 24]. Comme le montre le tableau 1, les potentiels zêta de hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP et SFB-NP sont respectivement  − 18,2 ± 2,2 mv, − 18,5 ± 1,8 mv et  − 15,9 ± 2,1 mv, ce qui peut être causée par les charges négatives générées par le groupe aldéhyde, le groupe carboxyle et le groupe phosphate dans la glycoprotéine hGC33 de l'anticorps. Les NP chargées négativement peuvent conduire à la haute stabilité de la suspension de NP. De plus, comme la surface des cellules est chargée négativement dans les environnements physiologiques normaux, les NP préparées repoussent les cellules à faible charge et sont moins toxiques pour les tissus et les cellules. De plus, la distribution de taille de null-NP et SFB-NP (indice de polydispersité [PDI] 0,18 et 0,19, respectivement) était légèrement mais pas significativement plus petite que celle de hGC33-null-NP (PDI = 0,21) et hGC33-SFB- NP (PDI = 0.23). Ainsi, la taille des nanoparticules présente une bonne uniformité. La taille des particules, la distribution de la taille des particules et le potentiel zêta de NP sont présentés dans le tableau 1 en fonction des résultats de l'efficacité d'encapsulation SFB et du contenu de charge. L'anticorps GPC3 non conjugué hGC33 a été éliminé par ultracentrifugation et l'efficacité de liaison de l'anticorps hGC33 aux NP a été évaluée. L'analyse des protéines BCA a montré que l'efficacité de liaison de l'anticorps hGC33 aux NP était de 79,5%  ±  2,9%.

hGC33-Coumarin 6-NP cible efficacement GPC3 ⁺ Cellules HepG2 de la lignée cellulaire HCC

Pour savoir si l'anticorps hGC33 des nanoparticules a encore la capacité de cibler spécifiquement GPC3, nous avons utilisé GPC3 ⁺ HepG2 et GPC3 ⁻ Cellules Li-7 en tant que cellules cibles et hGC33-coumarine 6-NP en tant que nanoparticules traceuses, et ont incubé les différentes cellules pendant 2 h, 4 h et 8 h. Les cellules ont été lavées avec du PBS 3 fois et mises à réagir avec du DAPI pour colorer le noyau. Les cellules ont été fixées et photographiées au microscope à fluorescence Leica (DMi8, Allemagne). Il a été constaté que la fluorescence verte dans les cellules HepG2 était significativement plus élevée que celle des cellules Li-7 au même temps d'incubation (Fig. 2), indiquant que la quantité de hGC33-coumarine 6-NP entrant dans les cellules HepG2 était significativement plus élevée que celle dans les cellules Li-7. Les résultats ont montré que l'anticorps hGC33 sur hGC33-Coumarin6-NP avait toujours la capacité de cibler GPC3 et de favoriser l'internalisation des nanoparticules. L'expression de GPC3 dans les cellules HepG2 et les cellules Li-7 a été examinée par fluorescence indirecte et coloration cytochimique. Les résultats ont montré que les cellules HepG2 surexprimaient GPC3, tandis que les cellules Li-7 n'exprimaient pas GPC3 (Fig. 2).

hGC33-Null-NP inhibe la prolifération des cellules HepG2

Pour déterminer si la NP modifiée par hGC33 (hGC33-null-NP) pouvait inhiber la croissance du CHC, nous avons mesuré l'inhibition de la croissance cellulaire de la lignée cellulaire HCC positive GPC3 HepG2 et de la lignée cellulaire Li-7 négative GPC3. Nous avons constaté que hGC33-null-NP et hGC33 inhibaient la croissance de la lignée cellulaire HCC GPC3-positive HepG2 après 24 h de traitement, mais hGC33 avait un effet inhibiteur plus important sur les cellules HepG2 que hGC33-null-NP (Fig. 3a); en revanche, hGC33-null-NP et hGC33 n'ont pas affecté la croissance de la lignée cellulaire Li-7 GPC3-négative (Fig. 3b). L'évolution temporelle représentative de hGC33-null-NP (équivalent à 0,1 m de hgc33) et de hGC33 (0,1 m) sur la prolifération des cellules HepG2 est illustrée à la Fig. 3c. Parce que hGC33 est un peptide C-terminal qui reconnaît GPC3, hGC33 est supérieur à hGC33-null-NP pour inhiber HepG2. Les résultats suggèrent que la molécule hGC33 dans hGC33-null-NP peut avoir un effet de blocage de l'espace, ce qui peut affecter la capacité de liaison de hGC33 aux épitopes.

La prolifération des cellules HepG2 et Li-7 a été inhibée par hGC33, null-NP et hGC33-null-NP. un Le test de prolifération cellulaire a été réalisé sur des cellules HepG2 GPC3-positives traitées avec hGC33, null-NP ou hGC33-null-NP; b des tests de prolifération cellulaire ont été effectués sur des cellules Li-7 GPC3 négatives traitées avec hGC33, null-NP et hGC33-null-NP. Les cellules ont été incubées avec 0-2,5 μM de hGC33, null-NP ou hGC33-null-NP pendant 1 jour. La prolifération des cellules a été mesurée avec la méthode MTT et standardisée en tant que cellules non traitées. Toutes les valeurs représentent la moyenne  ± SD. Par rapport au groupe témoin (0 μM) sans traitement aux anticorps, *P < 0,01 ; c les résultats représentatifs de la réponse de HepG2 à hGC33, null-NP et hGC33-null-NP dans le traitement hGC33 (1,0 μM)

hGC33-Null-NP inhibe le cycle cellulaire des cellules HepG2

Pour comprendre le mécanisme de l'activité moléculaire de l'anticorps hGC33 modifié sur des nanoparticules hGC33-null-NP, nous avons étudié la progression du cycle cellulaire de HepG2 traité avec hGC33-null-NP. Dans la lignée cellulaire HepG2, hGC33-null-NP et hGC33 ont significativement augmenté la proportion de cellules dans G1 (Fig. 4a, b), indiquant que hGC33-null-NP et hGC33 pourraient induire un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. De plus, hGC33-null-NP et hGC33 pourraient considérablement réguler à la baisse l'expression de cyclinD1 dans les cellules HepG2 (Fig. 4c, d).

hGC33-null-NP et hGC33 induit l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et inhibe l'expression de cyclinD1 dans les cellules HepG2. un Diagramme représentatif du cycle cellulaire de divers groupes traités avec hGC33-null-NP et hGC33. b Analyse du cycle cellulaire de divers groupes traités avec hGC33-null-NP et hGC33. Les cellules HCC ont été incubées avec 0,5 µm de hGC33 ou hGC33-null-NP (avec la concentration molaire de hGC33 comme référence). *P <0,05, la phase G1 des cellules hGC33-null-NP ou hGC33 a été comparée à celle des cellules 0 h. c , d Après le traitement par hGC33-null-NP ou hGC33, cyclinD1 était significativement régulé à la baisse dans les cellules HepG2 par rapport à celui du groupe témoin

Activation Wnt dans les cellules HepG2, Huh-7 et Li-7

Pour comprendre l'activation du signal classique Wnt/β-Caténine dans les cellules HCC, nous avons d'abord détecté l'expression du ligand Wnt et de la protéine de sertissage du récepteur (frizzled, FZD ou Frz) dans diverses lignées cellulaires HCC :HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC ⁺ ) et Li-7 (GPC3 ⁻ ). Les résultats ont montré que les récepteurs Wnt3a et FZD de transduction de la voie β-caténine étaient exprimés dans toutes les lignées cellulaires, en particulier dans les cellules HepG2 et Huh-7 (Fig. 5).

Expression de Wnt3a, FZD1 et FZD3 dans les lignées cellulaires HCC

hGC33-Null-NP inhibe la prolifération cellulaire dépendante de la transduction du signal Wnt induite par Wnt3a

Certaines études ont montré que la partie extracellulaire de GPC3 peut être un co-récepteur de Wnt, qui favorise l'activation et la transduction du signal Wnt/β-caténine. Par conséquent, lorsque HepG2 (GPC3 ⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ) et Li-7 (GPC3 ⁻ ) cells were co-incubated with hGC33 and hGC33-null-NP, the activation of Wnt/β-catenin signal was blocked by hGC33 and hGC33-null-NP, and proliferation of HepG2 and Huh-7, but not Li-7, in Wnt3a-conditioned medium was inhibited. That proliferation of Li-7 cells most likely is due to the absence of GPC3 on the surface of Li-7 cells (Fig. 6). Our results indicate hGC33 and hGC33-null-NP nanoparticles specifically bind to GPC3 molecules on cell membrane. hGC33 and hGC33-null-NP partially neutralize the mitogenic activity of Wnt3a and inhibit the Wnt/β-catenin signaling pathway. However, the inhibition of proliferation by hGC33-null-NP nanoparticles was less than that of hGC33. Perhaps the spatial structure of the nanoparticles interferes with hGC33-null-NP and limits the function of the hGC33 molecule on the nanoparticles so they cannot completely block the interaction between GPC3 and Wnt3a.

GPC3-activated Wnt signal transduction in HCC. Fifty percent Wnt3a DMEM medium was added with anti-wnt3a antibody, hGC33, or hGC33-null-NP. HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ) and Li-7 (GPC3 ⁻ ) cells were co-incubated for 48 h, and cell proliferation was measured by MTT assay. The data were expressed as mean ± SD (*P  < 0.01)

hGC33-Null-NP Inhibits Wnt3a-Induced Signal Transduction in HepG2 and Huh-7 Cells

To understand the effect of hGC33-null-NP on Wnt/β-catenin signaling in HCC cells, we extracted the proteins of HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33 or hGC33-null-NP. The results of western blot showed that after hGC33-null-NP treatment, the levels of pYAP and pβ-catenin were increased, but the levels of YAP and β-catenin were decreased. Furthermore, the levels of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC in the hGC33-null-NP group were lower than those in the control group, but the level was less than with hGC33 treatment. Similar effects were observed in HepG2 and Huh-7 cells, as shown in Fig. 7.

Inhibition of Wnt3a-induced β-catenin signaling by hGC33-null-NP or hGC33. un Compared with the control group, Wnt/β-catenin signaling pathway in HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33-null-NP or hGC33 was inhibited, and the levels of β-catenin and YAP were decreased, while the increased phosphorylated β-catenin and phosphorylated YAP molecules were unstable, and degraded in cytoplasm. The decreased β-catenin was difficult to maintain in the nucleus and drive the expression of CyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC, which resulted in the decrease of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-myc protein levels. b The mechanism pattern of Wnt/β-catenin signaling pathway inhibited by hGC33-null-NP or hGC33

hGC33-SFB-NP or hGC33 Attenuates HCC Cell Migration by Inhibiting Epithelial Mesenchymal Transition (EMT)

HCC is one of the deadliest cancers in the world, and its incidence is steadily increasing. Sorafenib is the only approved standard treatment for patients with advanced HCC, as it has been shown to improve the survival rate of these patients. However, clinical and preclinical observations suggest that sorafenib therapy has limited efficacy due to the rapid development of drug resistance. Therefore, elucidating the mechanism of escape resistance to sorafenib is a major emphasis in HCC research. In recent years, more and more attention has been paid to the role of epithelial mesenchymal transition (EMT) in the progress of HCC and the development of drug resistance. EMT refers to the transformation of epithelial to mesenchymal cells, which endows cells with the ability metastasize and invade, including acquisition of stem cell characteristics, reducing apoptosis and aging, promoting immunosuppression, and participating in the occurrence and development of cancer. The loss of E-cadherin expression is considered a key step in the carcinogenesis and EMT. EMT is a developmental multi-step molecular and cellular reprogramming process that cancer cells use to achieve aggression. This is mainly through down regulating the expression of E-cadherin, keratin, mucin, ZO-1 (tight junction protein); up regulating the expression of vimentin, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), FN fibronectin, MMPs (degradation matrix), N-cadherin, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, type I collagen, and type II collagen to achieve the invasion, metastasis, and anti-apoptosis of EMT characteristic tumor. The changes of these protein expressions mainly involve the activation of Wnt/β-catenin and Ras/Raf/MAPK signaling pathways.

Our experiments have shown that hGC33 antibody on the surface of NP vector can inhibit Wnt3a-induced β-catenin signal transduction, and then down regulate the expression of β—catenin, CD44, vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclin D1, and c-MYC. Furthermore, hGC33-SFB-NP inhibits the activation of Ras/Raf/MAPK signal pathway and inhibits proliferation and apoptosis of HCC cells. hGC33 and SFB have a synergistic effect, inhibiting EMT and decreasing the migration of HCC cells (Fig. 8).

Effect of hGC33-SFB-NP on EMT inhibition. un Compared with the control group, the hGC33-SFB-NP treatment group had less cell migration. Photographs were taken under an optical microscope (magnification, × 200). The error value represents the standard deviation of three independent experiments. *Compared with the control group, p < 0.01. b Compared with the control group, the EMT-related proteins snail, vimentin, and MMP-2 in HCCs treated with hGC33-SFB-NP decreased, whereas E-cadherin increased. c Molecular mechanism of EMT. EMT, epithelial–mesenchymal transition; MMP-2, matrix metalloproteinase-2; SFB, sorafenib; NP, nanoparticle

hGC33-SFB-NP Inhibits the Growth of Hepatocellular Carcinoma In Vivo and Improves the Survival Rate of Tumor-Bearing Mice

To evaluate the anti-tumor activity of hGC33-SFB-NP in vivo, HepG2 and Huh-7 cells were inoculated subcutaneously into the right abdomen and dorsal side of female BALB/c nude mice, respectively. When the tumor xenograft growth reached about 30 mm ³ , the mice were randomly divided into groups to further evaluate the inhibition of each group (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, free SFB, and control group) HCC effect (n  = 5 per group). It can be seen from Fig. 9a, b that hGC33-SFB-NP significantly slowed tumor growth in mice compared with the PBS control and other treatments. Compared with the PBS control, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, and free SFB also had some inhibition of HCC, which is because free hGC33 and free SFB directly inhibit Wnt signal and Ras/Raf/MAPK, respectively. Such pathways can inhibit the proliferation of HCC cells to a certain extent. Although the nanoparticle-modified hGC33 (hGC33-null-NP) is connected to the nanosurface through chemical bonds, it did not affect hGC33′s targeting of GPC3 molecules and inhibition of Wnt activity. Nanoparticle-loaded SFB (SFB-NP), after being endocytosed by cells, was degraded to release SFB from the copolymer to inhibit the growth of HCC. In all, the inhibitory effect of hGC33-SFB-NP on HepG2 cell grafts was, as expected, more than on Huh-7 cell grafts, probably because HepG2 expresses GPC3 molecules.

The effect of hGC33-SFB-NP on xenotransplantation of HCC in nude mice and the changes of mice weight. Liver cancer cells were inoculated subcutaneously on the back of each nude mouse (n  = 10). After 10 days, the tumor bearing mice were treated with PBS (control), free hGC33, free SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, and hGC33-SFB-NP. Tumor size (a , b ) and body weight (c , d ) of mice were monitored at designated time points

The body weight of nude mice in each treatment group also was measured, as shown in Fig. 9c, d. The body weight of the control group decreased gradually. The weight of mice in free hGC33, free SFB, SFB-NP, and hGC33-null-NP treatment groups also decreased progressively and not significantly less than in the control group. However, the weight of nude mice bearing HepG2 and Huh-7 treated with hGC33-SFB-NP only slightly decreased, and the weight remained relatively stable during the treatment cycle. These results support that the novel hGC33-SFB-NP nanodrug has no significant toxicity in nude mice, and the SFB loaded on the nanocarrier and the surface modified hGC33 can produce additive or even synergistic anti-tumor effect.

Discussion

To examine the suitability of hGC33-SFB-NP for targeted HCC therapy, we tested the model conjugates for their ability to bind to human glypican-3 on HCC cells in vitro; to inhibit glypican-3-positive HCC cell proliferation, migration, and Wnt/β-catenin signal transduction; and inhibit HCC that overexpress glypican-3 in vivo.

To covalently bind GPC3-specific antibody hGC33 with mal-PEG-b -PLGA nanoparticles, we cross-linked the free sulfhydryl group in the Fc segment of hGC33 with maleimide functionalized PEG-b -PLGA (mal-PEG-b -PLGA) by forming stable thioether bonds. Conjugation is a prerequisite for targeting of GPC3-positive HCC. A series of experiments, including the changes of nanoparticle diameter and zeta potential detected by lens and the intracellular uptake of hGC33-SFB-NP, verified the targeting of hGC33-SFB-NP to HepG2 (GPC3 ⁺ ) cells. These results indicated that the binding activity of antibody hGC33 was not altered by the conjugation.

We directly detected the phagocytic effect of GPC3 ⁺ HepG2 and GPC3 ⁻ Li-7 cells on PEG-b -PLGA NP surface-modified hGC33 by confocal microscopy. After HepG2 and Li-7 cells were co-cultured with hGC33-coumarin 6-NP, the green signal intensity in HepG2 cells was significantly higher than in Li-7 cells, indicating that there were more nanoparticles in the HepG2 cells. This finding is consistent with the hGC33 antibody modified on the surface of PEG-b -PLGA NP specifically binding to glypican-3 on the surface of HCC cells and being internalized. The efficiency of hGC33-modified NP internalization depends on the expression level of GPC3 antigen on the cell surface.

We used the standard MTT assay to measure the efficiency of inhibiting the proliferation of hepatoma cells. Both hGC33-null-NP and hGC33 inhibited the growth of the GPC3-positive HCC cell line HepG2, but hGC33-null-NP and hGC33 did not affect the proliferation of GPC3-negative Li-7 cells (Fig. 3b). At the animal level, hGC33-null-NP or hGC33 alone inhibited the growth of Huh-7 and HepG2 xenografts to a certain extent, while hGC33-SFB-NP caused growth arrest of Huh-7 and HepG2 hepatoma xenografts in mice. The finding that hGC33-null-NP significantly inhibited GPC3-positive hepatoma cells showed that the inhibitory effect of PEG-b -PLGA NP surface-modified hGC33 on HCC cell proliferation depends on the expression of GPC3 antigen on the cell surface.

GPC3 regulates many pathways in HCC pathogenesis, including Wnt and YAP signaling [25,26,27]. GPC3 interacts with Wnt ligand and may be a coreceptor for Wnt and facilitate Wnt/Frizzled binding for HCC growth [28, 29]. We further examined the effect of nanodrug surface-modified hGC33 on Wnt signaling pathway in hepatoma cells. Like free hGC33, nanodrug surface-modified hGC33 inhibited the proliferation of hepatoma cells not only by blocking Wnt-induced signal transduction in HepG2 and Huh-7 cells of expressing GPC3, but also by inhibiting Wnt3a-induced β-catenin and YAP signal transduction. Previous studies have shown that YAP expression is regulated by β-catenin at the transcriptional level of HCC [30, 31]. In this study, free hGC33 and nanodrug surface-modified hGC33 inhibited Wnt3a-induced YAP activity, indicating that Yap/TAZ released from β-catenin complex can also initiate classic Wnt signaling transduction [32, 2]. These results indicate that typical Wnt and YAP cross talk through a variety of mechanisms. Compared with hGC33-null-NP and hGC33, hGC33-SFB-NP had stronger anti-proliferation and anti-migration ability in vitro and in vivo. Thus, hGC33 not only determines the specificity of HCC cells, but also increases the inhibitory effect of SFB on the proliferation and migration of HCC cells by blocking the key signals related to tumor growth, such as Wnt/β-catenin and Wnt/YAP signaling pathway.

Conclusion

Antibody hGC33 to glypican-3, a membrane protein that is overexpressed on hepatocellular carcinoma cells, increased binding of sorafenib-loaded polyethylene glycol-b-PLGA polymer nanoparticles (hGC33-SFB-NP) to glypican-3 on the cancer cells. Administration of the antibody-modified nanoparticles synergistically inhibited Wnt-induced signal transduction and Ras/Raf/MAPK signaling pathway; hepatocellular carcinoma cells were arrested in G0/1 phase by down-regulation of cyclin D1 expression, thus attenuating cancer cell migration by inhibiting epithelial–mesenchymal transition. hGC33-SFB-NP inhibited the growth of liver cancer in vivo and improved the survival rate of tumor-bearing mice.

Availability of data and material

Yes, all data have presented in the manuscript.

Abréviations

AKT/PKB:

Protein kinase B

c-MET:

HGFR:Hepatocyte growth factor receptor

EE%:

Encapsulation efficiency %

EMT:

Epithelial mesenchymal transition

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

¹ H NMR:

¹ H-nuclear magnetic resonance spectroscopy

HCC:

Hepatocellular carcinoma

LC%:

Drug loading %

MAPK:

Mitogen-activated protein kinases

PDI :

Indice de polydispersité

PI3K:

Phosphoinositide 3-kinase

pRAD51:

Phospho-RAD51

SFB:

Sorafenib

TEM :

Microscopie électronique à transmission

YAP:

Yes-associated protein-1