Rôles des ROS et de l'arrêt du cycle cellulaire dans la génotoxicité induite par la nanostructure à noyau de nanotige d'or/coquille d'argent

Introduction

Les nanoparticules d'argent (AgNPs), de 1 à 100 nm, peuvent présenter un large spectre de propriétés antimicrobiennes en pénétrant les agents pathogènes et en inactivant le groupe sulfhydryle interne de leurs enzymes métaboliques [1]. Ils ont démontré une puissante bactériostase et des effets bactéricides sur Escherichia Coli , Neisseria gonorrhoeae et Chlamydia trachomatis , et sont largement utilisés comme revêtements médicaux, produits ménagers [2] ainsi que pansements [3]. Des preuves convaincantes montrent que les nanoparticules sont capables d'entrer dans le noyau et d'interférer avec le processus de synthèse et de transcription de l'ADN [4]. Dans notre étude précédente, nous avons signalé qu'une dose intraveineuse unique de 5 mg/kg d'AgNPs pourrait introduire une rupture chromosomique remarquable dans les cellules de la moelle osseuse de rats Sprague-Dawley [5]. Une seule injection intrapéritonéale de 10 mg/kg ou plus d'AgNPs a induit à la fois des dommages à l'ADN et aux chromosomes [6]. Fleur et al. [7] ont suggéré que les AgNP à des doses de 50 et 100 μg mL ⁻¹ pourrait déclencher des dommages à l'ADN dans les cinq minutes suivant l'administration, mettant en évidence la génotoxicité de l'argent (Ag) rapidement libéré. Compte tenu du risque d'exposition excessive, l'enquête sur la nanogénotoxicologie ou les dommages à l'ADN et le potentiel cancérogène des nanomatériaux manufacturés a reçu beaucoup d'attention [8].

Les principaux mécanismes des lésions génétiques induites par l'AgNP sont considérés comme la surproduction d'espèces oxydatives réactives, l'inflammation et la perturbation du cycle cellulaire [9, 10]. Comme suggéré dans des études précédentes, les AgNPs pourraient soit interagir directement avec l'ADN via des dommages oxydatifs [11] et interférer dans l'interphase au niveau de l'ADN et la mitose au niveau chromosomique, soit interagir avec la nucléoprotéine et l'appareil du fuseau mitotique pour perturber les points de contrôle du cycle cellulaire [ 12]. Cependant, que la génotoxicité induite par les AgNPs soit partiellement attribuable aux nanoparticules [13, 14] ou entièrement à l'Ag ⁺ libéré ions n'est toujours pas clair [15, 16].

L'étude de la génotoxicité des AgNPs est difficile en raison de la libération instable et ininterrompue de l'argent dans les tissus, ce qui entraîne des difficultés à localiser les AgNPs et à différencier le nanocore de l'Ag. Notre groupe a récemment développé une nanostructure cœur/coque argent nanotige (Au@Ag NR) pour étudier la toxicité induite par les nanoparticules [17]. Le noyau d'or de Au@Ag NR est physiologiquement inné dans le tissu et pourrait être utilisé comme étalon interne pour surveiller la libération d'Ag ⁺ ions de la tige en surveillant l'évolution du rapport Ag/Au, mesurée par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) [18]. Par cette méthode, les différentes origines des toxicités peuvent être identifiées. Des études antérieures ont montré que l'Ag ⁺ libéré Les ions de la coquille de Au@Ag NR ont entraîné des dommages oxydatifs aux reins et ont finalement conduit à des changements morphologiques et à une altération de la fonction de filtration du glomérule [19]. Jiang et al. [20] ont suggéré que l'activité spécifique des particules et la libération intracellulaire d'ions argent par Au@Ag NR contribuent à la réponse toxique des cellules de la granulosa. Nous avons également adopté Au@Ag NR comme modèle pour étudier le potentiel de génotoxicité in vivo des AgNPs et démontré que la clastogénicité, et non la mutagénicité, est la principale forme de génotoxicité induite à la fois par la coquille d'Ag et l'Ag libéré ⁺ ions, alors qu'il n'y avait pas de différence dans leurs schémas de toxicité [21].

Le foie est l'un des principaux organes sujets à l'accumulation d'AgNPs et est reconnu comme un organe/tissu cible pour la génotoxicité induite par les AgNPs. Notre étude précédente a montré qu'une certaine quantité d'argent (8,26 ± 3,90 μg/g) et d'or (80,07 ± 64,72 μg/g) restait dans le foie de rats SD huit semaines après l'administration intraveineuse d'une dose d'Au@Ag NR [21 ]. Dans cette étude, nous avons tenté d'identifier les rôles de l'arrêt du cycle cellulaire et du stress oxydatif réactif sur les dommages aux chromosomes et à l'ADN induits par AgNP en utilisant Au@Ag NR dans des cellules HepaRG dérivées d'hépatomes humains. Des tests de génotoxicité, y compris le test des comètes, le test γ-H2AX et le test du micronoyau, ont été effectués en parallèle avec un capteur de radicaux oxydants pour sonder la contribution des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les dommages à l'ADN/les chromosomes, tandis que l'apoptose cellulaire, le cycle cellulaire et les protéines associées ont été déterminés à explorer les mécanismes par lesquels les AgNPs interrompent la synthèse et la réplication de l'ADN. En outre, l'accumulation et la distribution intracellulaires de Au@Ag NR ont été étudiées en combinant la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) et la microscopie électronique à transmission (MET) pour différencier le rôle des nanoparticules et des ions Ag libérés.

Matériaux et méthodes

Culture cellulaire et traitement

La lignée cellulaire d'hépatome humain HepaRG (Thermo Fisher Scientific) a été utilisée dans cette étude. Les cellules ont été cultivées dans du RPMI 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Australia Origin, Gibco) et 1 % de solution pénicilline-streptomycine-glutamine (Gibco) dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ à 37 °C. Les cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes d'Au@Ag NR pendant 24 h ou 72 h, respectivement, et les concentrations ont été déterminées conformément à IC₅₀ estimée par test de viabilité cellulaire. Pour étudier le rôle des ROS dans la génotoxicité, 1 mM N - L'acétyl-l-cystéine (NAC, Sigma-Aldrich) a été appliquée pendant 1 h avant le traitement avec Au@Ag NR.

Test de croissance/viabilité cellulaire ATP

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque 96 puits à une densité de 5 × 10 ³ /bien. Après 24 h d'incubation, le milieu a été aspiré et les cellules ont été exposées à différentes concentrations d'Au@Ag NR pendant 24 h ou 48 h, respectivement. Un large spectre de concentrations a été préparé et quatre puits par traitement ont été réalisés au cours d'une période de traitement. La cytotoxicité de Au@Ag NR a été examinée par le dosage de l'adénosine triphosphate (ATP) (CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega), qui mesure l'activité métabolique cellulaire en quantifiant la quantité d'ATP, un paramètre important du métabolisme dans les cellules viables. Les signaux luminescents, qui reflètent les quantités de cellules viables, ont été détectés à l'aide du lecteur de plaques VICTOR Multilabel (2030-0050, PerkinElmer) et IC₅₀ les valeurs ont été estimées comme la concentration de Au@Ag NR pour une viabilité semi-maximale par Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, USA). Le ratio de viabilité est calculé à l'aide de l'équation suivante :

où RLU est l'unité lumineuse relative représentée comme la valeur moyenne de quatre puits, RLU_véhicule cellules représentées non traitées avec des nanotiges, et RLU_échantillon représenté les cellules qui ont été traitées avec différentes concentrations de Au@Ag NR.

Détermination de la concentration d'argent et d'or dans les cellules

Les échantillons de cellules ont été digérés dans de l'acide nitrique en utilisant le système de digestion par micro-ondes. Après la digestion, les échantillons ont été préparés avec un mélange contenant 1 % d'acide nitrique et d'acide chlorhydrique. Les quantités d'Ag et d'Au dans les solutions ont été déterminées par ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). L'analyse MET a été utilisée pour déterminer la présence de Au NR et Au@Ag NR dans la cellule. Les échantillons cellulaires ont été fixés dans un mélange de 2,5% de glutaraldéhyde et 2% de paraformaldéhyde pendant 2 h à 4 °C. Les culots cellulaires ont été fixés et rincés trois fois dans du tampon phosphate (pH 7,4) et post-fixés dans du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 2 h à 4 °C. Les échantillons ont ensuite été rincés à l'eau distillée trois fois et déshydratés pendant 15 min dans différentes concentrations d'éthanol (50 %, 70 %, 90 % et 100 % d'éthanol, respectivement) l'une après l'autre. Par la suite, de l'oxyde de propylène à des dilutions de 1:1 et 1:3 a été appliqué sur la résine à 20-26 °C pendant 2 h. La polymérisation a été réalisée par chauffage progressif à 35 °C pendant 16 h, 45 °C pendant 8 h, 55 °C pendant 14 h et 65 °C pendant 48 h. Des coupes ultrafines ont été colorées pendant 25 min avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb et analysées au microscope électronique à transmission (H-7650, HITACHI, Japon).

Test de comète conventionnel et modifié

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à des densités de 2 × 10 ⁵ /puits ou 3 × 10 ⁵ /puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ) à une concentration de 200 μmol a été exposé aux cellules comme contrôle positif pendant une heure. Pour chaque échantillon, deux puits ont été préparés à la fois pour le traitement conventionnel et le traitement à la formamidopyrimidine glycosylase (Fpg). Le dosage conventionnel des comètes a été réalisé dans des conditions alcalines (pH > 13) comme décrit précédemment [21]. Pour les puits traités par Fpg, un traitement Fpg supplémentaire a été appliqué avant la procédure de déroulement de l'ADN, et les lames ont été immergées dans un tampon enzymatique (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg.mL ^-1 BSA) trois fois pendant 5 min chacune. Le Fpg (New England Biolabs, Inc., Royaume-Uni) a été dilué à 1:50 000 avec un tampon enzymatique. Des aliquotes de cent millilitres de l'enzyme diluée ont été ajoutées à chaque gel sur les lames de microscope et incubées dans une chambre humide à 37 °C pendant 30 min. Les étapes restantes étaient les mêmes que le traitement conventionnel. Les tests de comètes ont été effectués en triple. Au moins 50 cellules par échantillon ont été évaluées indépendamment à l'aide du microscope à fluorescence Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokyo, Japon), tandis que Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, Royaume-Uni) a été utilisé pour analyser la valeur moyenne du pourcentage d'ADN dans la queue et la queue d'olive. moment (OTM) de chaque échantillon.

Qualification des foyers γ-H2AX par cytométrie en flux et criblage à haut contenu

Pour la quantification par cytométrie en flux, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à des densités de 2 × 10 ⁵ /puits ou 3 × 10 ⁵ /puits pour un traitement de 24 ou 72 heures, respectivement, tandis que pour le test de criblage à haute teneur, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à des densités de 6 × 10 ³ /puits ou 1 × 10 ⁴ /puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Comme contrôle positif, 2 μM de méthanesulfonate de méthyle (MMS, Sigma-Aldrich) a été appliqué en parallèle avec les cellules pendant une heure. Les cellules ont été rincées dans une solution saline tamponnée au tris (TBS) et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante. Après lavage avec du TBS, les cellules ont été incubées avec 50 μL de méthanol glacé pendant 30 min à - 20 °C. Les cellules ont encore été rincées trois fois dans du TBS et le réactif de blocage (TBS contenant 0,3 % de Triton X-100 et 10 % de sérum de chèvre) a été appliqué pendant 1 h. L'anticorps primaire (souris anti-phospho-H2AX Ser139, Millipore) a été dilué à 1:200 avec un réactif de blocage et incubé avec les cellules pendant une nuit à 4 °C. La plaque a ensuite été à nouveau rincée avec du TBS trois fois, et l'anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris, Life Technologies), dilué avec le réactif de blocage dans un rapport 1:20, a été ajouté par la suite. Les échantillons ont été conservés dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h et 2 μg mL ⁻¹ (20 μL/puits) DAPI (Invitrogen) a été ajouté à chaque puits. La fluorescence a été mesurée à l'aide d'une cytométrie en flux (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) ou d'un système d'analyse à haut contenu (Operetta CLS, PerkinElmer). Pour le test de cytométrie en flux, les données d'au moins 10 000 cellules par groupe ont été analysées et les expériences ont été réalisées en triple; pour une analyse à haut contenu, 20 champs visuels dans chaque puits et au moins cinq puits dans chaque groupe ont été analysés.

Test du cytome du micronoyau par bloc de cytokinèse (CBMN-cyt)

Le CBMN-cyt a été réalisé selon la procédure décrite par Fenech et al. [22]. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits à des densités de 2 × 10 ⁵ /puits ou 3 × 10 ⁵ /puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. 0,2 μg mL ⁻¹ La mitomycine C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japon) a été exposée aux cellules comme contrôle positif pendant 24 h. 3 μg mL ⁻¹ la cytochalasine B a été appliquée après un traitement de 24 ou 72 h pour bloquer le processus de cytokinèse, et les cellules ont été récoltées après 40 h. Les échantillons ont été colorés avec 5% Giemsa après hypotonie avec 0,075 mol L ⁻¹ préchauffé KCl et fixation avec un mélange 3:1 de méthanol et d'acide acétique. Des puits en triple par groupe ont été préparés et au moins 1000 cellules binucléées par puits ont été examinées.

Mesure du contenu MDA, total GSH et SOD

Les cellules ont été cultivées dans des plaques 12 puits à des densités de 5 × 10 ⁵ /puits ou 3 × 10 ⁵ /puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Par la suite, les cellules ont été récoltées et rincées trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS). Les quantités de malondialdéhyde (MDA) dans les homogénats cellulaires ont été déterminées à l'aide d'une méthode à base d'acide thiobarbiturique (Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute, Nanjing, Chine). Les quantités de glutathion total (GSH) et de superoxyde dismutase (SOD) ont été déterminées à l'aide des kits de quantification du glutathion total et de dosage SOD (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Japon), respectivement. Les densités optiques (D.O.) de chaque puits ont été mesurées à l'aide du lecteur de plaques VICTOR Multilabel (2030-0050, PerkinElmer).

Analyse par cytométrie de flux pour le cycle cellulaire

Les cellules ont été cultivées dans des plaques 6 puits à des densités de 1 × 10 ⁶ /puits ou 5 × 10 ⁵ /puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement, et ont ensuite été fixés avec de l'éthanol à 70 % à 4 °C pendant la nuit. Les échantillons ont été rincés avec du PBS trois fois et colorés avec du tampon de coloration PI/Rnase (BD Biosciences) pendant 15 minutes à température ambiante. Les populations cellulaires sous la phase G0/G1, S et G2/M parmi 20 000 cellules ont été déterminées en utilisant des régions avec une surface FL2 par rapport à une largeur FL2. L'analyse a été effectuée par cytométrie en flux (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, États-Unis) et FlowJo (BD Bioscience), et les expériences ont été réalisées en triple.

Analyse par cytométrie de flux de l'apoptose cellulaire

Les cellules ont été cultivées dans des plaques 6 puits à des densités de 1 × 10 ⁶ /puits ou 5 × 10 ⁵ /puits pour un traitement de 24 ou 72 h, respectivement. Ils ont ensuite été rincés deux fois avec du PBS et dilués avec 500 μL de tampon de liaison 1 ×  (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) pour ajuster la suspension à environ 1 × 10 ⁶ cellules/mL, puis une dilution de 100 μL a été mélangée avec 5 µL d'Annexine V de FITC et 5 µL de PI. Les échantillons ont été colorés à température ambiante pendant 15 min, et au moins 10 000 cellules ont été analysées pour déterminer la population cellulaire en apoptose précoce et tardive en utilisant des régions avec FL1H par rapport à FL2H à l'aide de la cytométrie en flux (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, États-Unis) et FlowJo (BD Biosciences). Les expériences ont été réalisées en triple.

Analyse Western blot

Les cellules ont été cultivées dans un tube de 75 cm ² flacon à des densités de 1 × 10 ⁷ /bien et 6 × 10 ⁶ /puits pour un traitement de 24 et 72 h, respectivement. Les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse RIPA contenant un inhibiteur de protéase (PMSF), et la concentration de protéines a été déterminée en utilisant un kit de quantification de protéines BCA (Beyotime Biotechnology, Chine). Les concentrations des échantillons ont été ajustées à l'aide du tampon de lyse RIPA avant la dénaturation par chauffage à 95 °C pendant 3 min. Les échantillons de protéines ont été séparés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide SDS à 12 % et transférés sur des membranes de nitrocellulose (Millipore). Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % pendant 30 min et incubées avec du p53 primaire (SC-137174, Santa Cruz), du p21 (SC-6246, Santa Cruz) et de la -actine (sc-47778, Santa Cruz) et des anticorps secondaires IgG(H+L)-HRP(SE131, solabio) de chèvre anti-souris, respectivement. Les niveaux d'expression des protéines cibles dans les échantillons ont été visualisés à l'aide d'une méthode de chimiluminescence améliorée (ECL) et analysés par le système ImageJ (National Institutes of Health).

Analyses statistiques

Les données ont été présentées comme la moyenne  ± SEM. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour tester la signification statistique des différences entre les groupes témoins négatifs et traités, suivie du test de comparaison multiple de Dunnett utilisant SPSS (version 22, IBM, Armonk, NY, États-Unis), et les données ont été prises en compte statistiquement significatif à P < 0,05. Les figures ont été préparées à l'aide de GraphPad Prism 7 pour Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Résultats

Caractérisation de Au NR et Au@Ag NR

Des nanotiges d'or (Au NRs), des noyaux de nanotiges d'or et des nanostructures de coque d'argent (Au@Ag NR) ont été conçus, préparés et caractérisés comme décrit précédemment [21]. En bref, les diamètres et longueurs moyens sont de 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ± 2,5 nm pour les NR Au et 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ± 8,9 nm pour les NR Au@Ag. L'épaisseur de la coque Ag est d'environ 5 nm. Les potentiels zêta des NR Au revêtus de PDDAC et des NR Au@Ag dispersés dans l'eau étaient respectivement de 37,7 ± 1,6 mV et 52,5 ± 1,4 mV. Le rapport pondéral Ag/Au de Au@Ag NR préparé a été estimé à 2,3. Les résultats de la caractérisation sont présentés sur la figure 1.

Caractérisation de Au NR et Au@Ag NR. un Schéma structurel de Au NR et Au@Ag NR; b Spectres d'extinction UV–Vis–NIR de Au NR et Au@Ag NR dispersés dans l'eau ; c images MET représentatives de Au NR; d images MET représentatives de Au @Ag NR

Viabilité de la cellule

La cytotoxicité de Au@Ag NR vis-à-vis des cellules HepaRG a été étudiée par test de viabilité ATP (tableau 1), et les cellules ont été exposées à Au@Ag NR pendant 24 ou 48 h à des concentrations variant de 0,125 à 160 μg mL ^-1 . Au@Ag NR a induit des effets cytotoxiques significatifs de manière dépendante du temps et de la dose après une exposition de 24 et 48 h, avec un % de viabilité IC₅₀ à 20 µg mL ⁻¹ et 6 µg mL ⁻¹ , monté par le logiciel GraphPad Prism 7.0, respectivement. Compte tenu de la cytotoxicité globale, les périodes de traitement ont été ajustées à 24 h et 72 h, tandis que les concentrations appliquées ont été déterminées à 0,8 µg mL ⁻¹ , 4 µg mL ⁻¹ et 20 µg mL ⁻¹ . De plus, Au NR a été inclus en tant que contrôle inerte, et la teneur en Au dans le groupe AuNR était la même que 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR, qui est de 16 µg mL ⁻¹ . En revanche, un prétraitement de 1 mM de NAC a été adopté dans le groupe Au@Ag NR + NAC comme contrôle de la réponse au stress oxydatif (la concentration de Au@Ag NR est de 20 µg mL ⁻¹ ).

Répartition cellulaire de Au NR et Au@Ag NR

La distribution de la teneur en Au et Ag dans les cellules HepaRG a été analysée par ICP-MS. Comme le montrent les tableaux 2 et 3, la teneur en Ag a augmenté de manière dose-dépendante. Cependant, l'antioxydant N - L'acétyl-l-cystéine (NAC) en tant que capteur de radicaux libres peut restreindre l'absorption cellulaire des nanoparticules, car une teneur en Ag moindre a été observée même si la même concentration de Au@Ag NR (20 µg mL ⁻¹ ) a été appliqué dans ce groupe. La baisse du rapport Ag/Au de 24 à 72 h indique une libération continue d'Ag ⁺ de la coquille de Au@Ag NR. De plus, l'absorption cellulaire d'Ag est bien supérieure à celle d'Au (tableau 4). De plus, les données MET ont montré que la plupart des Au NR et Au@Ag NR étaient retenus dans les cellules sous forme d'agglomérats. Les structures des nanotiges étaient clairement visibles à l'intérieur des cellules soumises à l'exposition de Au NR ou Au@Ag NR sans pénétrer dans le noyau (Fig. 2).

Internalisation Au NR et Au@Ag NR :HepaRG par MET à 80 kV après 24 h d'exposition à 16 μg mL ⁻¹ Au NR et 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR. un Contrôle du véhicule ; b Au NR; c Au@Ag NR

dommages à l'ADN

Les dommages à l'ADN déclenchés par Au@Ag NR ont été évalués à la fois par le test des comètes et le test γH2AX (Fig. 3). Il a été observé à partir du test des comètes que 0,8 à 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR pourrait introduire des dommages importants à l'ADN. Après une exposition de 24 ou 72 heures à Au@Ag NR, le % d'ADN de queue et l'OTM des cellules ont augmenté à la fois en fonction du temps et de la concentration. De plus, des dommages à l'ADN associés à l'induction du stress oxydatif ont été observés dans les cellules traitées avec 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR par le test de comète modifié par l'enzyme Fgp (Fig. 3a, b). Pour évaluer l'étendue de la rupture double brin qui représente une corrélation plus élevée avec la genèse du cancer, les cellules γ-H2AX-positives et les intensités moyennes de fluorescence dans les cellules γ-H2AX-positives ont été analysées. Après une exposition de 24 heures à Au@Ag NR, aucune différence n'a été trouvée entre les groupes de cellules γ-H2AX-positives. Cependant, 4 μg mL ⁻¹ Le groupe Au@Ag NR a provoqué une augmentation significative après un traitement de 72 heures. Des augmentations significatives des intensités de fluorescence ont été observées dans tous les groupes Au@Ag NR après 72 h par rapport au véhicule témoin (Fig. 3c-e, P < 0,05).

Dommages à l'ADN induits par Au@Ag NR. Les cellules HepaGR ont été exposées à Au@Ag NR à différentes concentrations (0,8 à 20 μg mL ⁻¹ ) pendant 24 h et 72 h, respectivement. un % moyen d'ADN de queue après exposition à Au@Ag NR pendant 24 h ; b % moyen d'ADN de queue après exposition à Au@Ag NR pendant 72 h ; c pourcentage de cellules positives avec des foyers γ-H2AX estimé par cytométrie en flux ; d intensités moyennes de fluorescence dans les cellules avec des foyers γ-H2AX estimées à l'aide d'une coloration immunofluorescente. ^* P < 0,05 par rapport au véhicule témoin ; ^un P < 0,05 versus Au NR. 2 μM mL ⁻¹ Le MMS a été utilisé comme contrôle positif

Dommages chromosomiques

La formation de micronoyaux est un biomarqueur important pour identifier les dommages chromosomiques, qui sont un dommage plus critique pour le matériel génétique que la rupture de l'ADN. Le rapport de cellules binucléées contenant des micronoyaux a été noté comme le montre la figure 4c. Au@Ag NR a augmenté la formation de micronoyaux selon un schéma dépendant de la concentration. Après une exposition de 24 h, les ratios de micronoyaux observés dans les cellules traitées avec 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR et 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR étaient de 1,133 ± 0,145% et 1,567 ± 0,318 %, respectivement, les deux étant significativement plus élevés que ceux du groupe témoin véhicule. Après une exposition de 72 h, le rapport de micronoyau dans les cellules traitées avec 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR était de 1,767 ± 0,233%, ce qui était significativement plus élevé que le groupe témoin véhicule ; le rapport du micronoyau dans les cellules traitées avec 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR était de 2,167 ± 0,252%, ce qui était significativement plus élevé que ceux observés dans les deux groupes de contrôle du véhicule et 16 μg mL ⁻¹ Groupe Au NR (0.700 ± 0.153%). En revanche, aucune différence n'a été trouvée entre les cellules traitées avec 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR + NAC et contrôle du véhicule, suggérant la participation des ROS dans la rupture chromosomique induite par Au@Ag NR.

Dommages chromosomiques induits par Au@Ag NR. Les cellules HepaGR ont été exposées à Au@Ag NR à différentes concentrations de 0,8 μg mL ⁻¹ à 20 μg mL ⁻¹ pendant 24 h et 72 h. un , b Images représentatives du micronoyau (flèche rouge) ; c fréquence du micronoyau (%). ^* P < 0,05 par rapport au véhicule témoin ; ^un P < 0,05 versus Au NR. 0,2 μg mL ⁻¹ la mitomycine C a été utilisée comme contrôle positif

Effets de Au@Ag NR sur la Formation ROS

Pour explorer davantage le rôle de la formation de ROS dans l'ADN et les dommages chromosomiques induits par Au@Ag NR, les niveaux de MDA, de GSH et de SOD ont été estimés. Une augmentation significative de la formation de MDA (P < 0,05) a été observée après une exposition à 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR pour 24 et 72 h (Fig. 5a). De plus, les niveaux de GSH et de SOD dans les cellules exposées à Au@Ag NR ont montré une réduction significative (P < 0,05) d'une manière dépendante du temps et de la concentration. Ces résultats suggèrent un déséquilibre entre l'oxydation et l'anti-oxydation, généré par l'exposition de Au@Ag NR (Fig. 5b, c).

Effets de Au@Ag NR sur la formation des ROS. Les cellules HepaGR ont été exposées à Au@Ag NR à différentes concentrations de 0,8 μg mL ⁻¹ à 20 μg mL ⁻¹ pendant 24 h et 72 h. un niveau MDA ; b niveau de GSH ; c niveau de SOD. ^* P < 0,05 par rapport au véhicule témoin ; ^un P < 0,05 contre Au NR

Effets de Au@Ag NR sur le cycle cellulaire et l'apoptose

Après une exposition de 72 h à Au@Ag NR, l'augmentation du nombre de cellules en phase G2/M a été observée dans 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR, 20 μg mL ⁻¹ Groupe Au@Ag NR et Au@Ag NR + NAC, avec des proportions de 32,63 % ± 1,77%, 32,267 % ± 2,17% et 32,967% ± 4,25%, respectivement (Fig. 6a, b), qui étaient significativement supérieures à celles du groupe le groupe témoin véhicule (22,37% ± 0,92%). En attendant, l'apoptose cellulaire induite par Au@Ag NR a pu être observée après une exposition de 72h, et le taux d'apoptose tardive des cellules traitées avec 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR et 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR + NAC était de 78,90 ± 1,19 % et 70,20 ± 4,50%, respectivement (Fig. 6c, d). Au@Ag NR induisait plus d'apoptose tardive que d'apoptose précoce, et le traitement de la NAC pourrait atténuer le taux cellulaire d'apoptose tardive déclenchée par Au@Ag NR.

Effets de Au@Ag NR sur le cycle cellulaire et l'apoptose. Effets de Au@Ag NR sur le cycle cellulaire (a , b ) et l'apoptose (c , d ) après exposition pendant 24 h et 72 h, respectivement ; les données représentatives des niveaux d'expression de p53 et p21 dans les cellules HepaRG de différents groupes (e , f Voie 1 :contrôle du véhicule; Piste 2 :Au NR ; Piste 3 :Au@Ag NR + NAC ; Piste 4 :Au@Ag NR 20 μg mL ⁻¹ ; Piste 5 :Au@Ag NR 4 μg mL ⁻¹ ; Ligne 6 :Au@Ag NR 0,8 μg mL ⁻¹ ); le niveau moyen d'expression relative de p53 et p21 à la -actine dans différents groupes a été résumé en (g , f ). ^* P < 0,05 par rapport au véhicule témoin ; ^un P < 0,05 contre Au NR

Les niveaux d'expression de p21 et p53 ont été détectés par Western blots, et un schéma similaire a été observé. Les niveaux d'expression de p53 et p21 dans les cellules traitées avec 4 μg mL ⁻¹ et 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR ont été nettement augmentés (P < 0,05) et ont été significativement diminués dans les cellules traitées avec à la fois 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR et NAC (P < 0,05, contre 20 μg mL ⁻¹ Groupe Au@Ag NR, Fig. 6e–h). Il est connu que la protéine p53 est une molécule centrale qui médie l'activation du point de contrôle G2/M en réponse à des dommages à l'ADN, et p21 est reconnue comme un inhibiteur du cycle cellulaire dépendant de p53. Ainsi, l'Au@Ag NR pourrait interférer avec la réplication de l'ADN et entraver la réparation de l'ADN par l'arrêt du cycle cellulaire.

Discussion

À l'heure actuelle, les rôles des Ag ⁺ libérés et les AgNPs dans la génération de la génotoxicité sont loin d'être clairs. Des études antérieures de notre groupe [21] et d'autres [13] ont démontré que si Ag ⁺ est la principale source d'introduction de toxicités, les nanoparticules pourraient également être hautement toxiques. Par exemple, les AgNPs pourraient contribuer à la génotoxicité en induisant la formation de radicaux hydroxyles [13]. De plus, des dommages chromosomiques plus graves, un stress oxydatif et une apoptose ont été introduits par AgNP par rapport à Ag ⁺ seul [23], suggérant que différentes voies pourraient être impliquées. Nous avons utilisé Au@Ag NR comme matériau modèle pour comprendre les formes et les distributions des AgNPs dans les cellules, et les quantités d'Ag et d'Au intracellulaires ont été déterminées par ICP-MS. The Ag/Au weight ratio of prepared Au@Ag NR was estimated as 2.3. However, after a 24-h exposure, it sharply increased to 16.5 in the cells treated with Au@Ag NR, suggesting that large amount of Ag was released from the shell of Au@Ag NR within that period. When the exposure period of Au@Ag NR was extended to 72 h, the Au/Ag weight ratio was decreased to 1.7, indicating that the Ag ⁺ was released from the cell and the nanorod was the major form of Au@Ag NR in the cell at that stage. Therefore, it could be deduced that once the Au@Ag NR entered the cell, Ag ⁺ rapidly dissolved from its shell within 24 h and gradually released to the extracellular environment, while the Au@Ag NR itself retained in the cell for a longer period.

Oxidative stress is deemed as one of the most important toxicological mechanisms of nanoparticles [24]. N-acetylcysteine (NAC) is a thiol, a mucolytic agent and precursor of l-cysteine which reduced glutathione. NAC is also a source of sulfhydryl groups in cells and exerts the ROS scavenger activity by interacting with OH ^· et H₂ O₂ [25]. In this study, the GSH and SOD levels were significantly decreased after exposure to Au@Ag NR, while the MDA level increased in a concentration- and time-dependent manner, indicating that the Au@Ag NR introduced the oxidative stress in the cells.

The potentials of Ag and Au@Ag NR in interfering with the genetic materials were further investigated by a series of genotoxicity assays. It is noteworthy that co-culturing the NAC with Au@Ag NR could ameliorate the ROS formation, which in turn supports the participation of oxidative stress in the genotoxicity triggered by Au@Ag NR. In this study, comet and γ-H2AX assays were performed to confirm that Au@Ag NR could interact with DNA and induce certain DNA damage, and the repair endonuclease Fpg was included in the comet assay to identify the oxidative DNA damage [26]. The Fgp could recognize oxidized pyrimidines and remove oxidized purines, e.g., 8-hydroguanine, so as to create apurinic or apyrimidinic sites that could introduce gaps in the DNA strands. The oxidative stress-induced DNA breakage could be determined subsequently by another comet assay [27]. The further DNA breakage detected by the additional Fgp in the comet assay suggested that the Au@Ag NR could cause DNA damage. Mei et al. [28] observed that 5-nm-sized AgNPs induced oxidative lesion-specific DNA damage by employing the hOGG1, EndoIII and Fpg endonucleases in the comet assay. Li et al. [29] also suggested that both PVP- and silica-coated AgNPs (15–100 nm and 10–80 nm, respectively) could lead to a significant increase in DNA breakage in mice hepatocytes in the presence of hOGG1and EndoIII. The formation of γ-H2AX foci, which represents an early cellular response to genotoxic stress, is the most sensitive and specific biomarker for detecting DSBs [30]. As demonstrated in this study, γ-H2AX foci in cells exposed to Au@Ag NR were markedly increased after 24 h, and a further increase could be observed after 72 h. The reduction in the 20 µg mL ⁻¹ group might be due to the cytotoxicity to the HepaRG cells at higher concentration. Similar results were observed for AgNPs with different coatings [31, 32]. Further, our results suggest that Au@Ag NR could induce chromosome damage in HepaRG cells, as the micronucleus rates were significantly increased. This is consistent with previous studies, where AgNPs-induced increased micronucleus rate was reported in HaCaT and TK6 cells [33]. In contrast, the addition of oxidative radical scavenger NAC could inhibit the formation of micronucleus induced by Au@Ag NR. Taken together, these data suggest the participation of oxidative stress in AgNP-introduced clastogenicity risk in vitro.

Previous studies have investigated the cell cycle arrest and cytotoxicity induced by AgNPs [33,34,35]. With prolonging the exposure time, the impact of AgNPs on cell cycle and apoptosis might be enhanced and in turn aggravate the cytotoxicity and genotoxicity. Usually, the cell cycle checkpoints (e.g., G2/M) were initiated by cells when experiencing DNA damage, and this mechanism serves to prevent the cell from entering mitosis (M phase). The G2/M cell cycle arrest indicates that an increasing percentage of cells is hindered in G2 phase for DNA repairing. Cells experiencing successful DNA repairing would further proceed to mitosis; however, for those with fatal damages, irreversible G2/M cell cycle arrest and cells apoptosis would take place [36]. We observed that Au@Ag NR could arrest the majority of HepaRG cells in G2/M phase, induce late cell apoptosis and increase the expression levels of p53 and p21, which are important proteins associated with the regulation of cell cycles [37]. As p53 could also induce apoptosis, when the DNA cannot be repaired properly [38], the p21 might indirectly participate in cell apoptosis by cell cycle arrest in a p53-dependent pathway via down-regulating the nuclear protein ICBP90 for DNA replication and cell cycle regulation [39]. Furthermore, apoptosis and a G2/M arrest induced by activation of the p53/p21 system have been reported in HepG2 cells following the administration of garlic extracts [40]. Thus, it could be inferred that the oxidative stress-triggered DNA/chromosome damages might facilitate the expression of p53 and p21, which subsequently induces cell cycle arrest. Extending the exposure period of Au@Ag NRs to the DNA/chromosome during replication may further aggravate the genotoxicity or apoptosis.

Conclusion

Genotoxicity induced by AgNPs may be attributed to the oxidative stress induced by the nanoparticles as well as the released ions [41]. This study employed Au@Ag NR as a model to determine the distribution and release behavior of Ag after the nanoparticles enter into the cells. Considering the disparate forms of Au@Ag NR in the cell, after its exposure the Ag ⁺ was rapidly dissolved from the silver shell. Ag ⁺ and Au@Ag NR could introduce cytotoxicity and genotoxicity (clastogenicity) in the cells, and the Au@Ag NR retained in the nucleus may further release Ag ⁺ to aggravate the damage, which are mainly caused by cell cycle arrest and ROS formation (summarized in Fig. 7). Collectively, these data reveal the correlation between the intracellular accumulation, Ag ⁺ release as well as the potential genotoxicity of AgNPs.

Schematic diagram of the possible mechanism of genotoxicity introduced by AgNP in vitro

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données et matériaux sont disponibles sans restriction.