Plateformes réactives au pH et à l'acoustique basées sur des nanoparticules de protéines chargées de perfluoropentane pour l'imagerie et la thérapie par ultrasons ciblant les tumeurs ovariennes

Introduction

Le cancer de l'ovaire est l'un des cancers féminins les plus mortels au monde [1,2,3]. Le traitement du cancer de l'ovaire reste cliniquement dépendant de la radiothérapie, de la chimiothérapie, de la chirurgie et d'autres thérapies auxiliaires [4,5,6]. Cependant, les lacunes de ces stratégies continuent d'entraver l'amélioration des taux de survie des patients. Pour surmonter ces lacunes, des méthodes de diagnostic plus efficaces et plus sûres sont nécessaires. Ces dernières années, l'intégration de l'imagerie et de la thérapeutique dans une plateforme de traitement unique est devenue un sujet brûlant [7,8,9].

La technologie des ultrasons (US), en raison de ses caractéristiques non invasives, non radiatives, peu coûteuses et spécifiques, est largement utilisée dans le diagnostic clinique et le traitement des tumeurs [10,11,12]. Au cours des dernières décennies, une plate-forme de réponse acoustique (ARP) avec des capacités d'imagerie et thérapeutiques américaines a été développée pour un diagnostic et un traitement efficaces des tumeurs [13,14,15,16]. L'ARP comprend principalement des plateformes à base de microbulles ou nanobulles (MB ou NB) et de nanoparticules (NP) [16, 17]. Parmi ces ARP, MB ou NB présentent de bonnes capacités de réponse acoustique, mais en raison de leur grande taille, la pénétration tissulaire in vivo est faible et la stabilité de l'échantillon est mauvaise. Le NP présente une perméabilité tissulaire plus forte et un cycle pharmacocinétique plus long en raison de sa petite taille. Cependant, les capacités de réponse acoustique des NPs sont limitées. Il est donc urgent de concevoir des ARP de petite taille, avec une grande stabilité et une forte réactivité.

Les fluorocarbures liquides subissent une transition de phase gazeuse en phase liquide en réponse à une stimulation externe [18, 19]. Natalya et ses collègues ont développé une nano-émulsion contenant du fluorocarbure liquide qui a produit des effets de vaporisation acoustique de gouttelettes (ADV) sous ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) [20,21,22]. Les émulsions formaient des bulles et déclenchaient simultanément la libération du médicament, permettant ainsi le traitement des tumeurs. Cependant, une couche de matériau d'étanchéité enroulée autour du fluorocarbure liquide a entraîné une augmentation de l'intensité et de la durée des ultrasons nécessaires au traitement de la tumeur, entraînant des dommages aux tissus sains environnants. Une optimisation supplémentaire du support de fluorocarbure liquide est donc à la demande.

Dans cette étude, nous avons développé une nanoparticule de ferritine (FRT) chargée de fluorocarbure liquide perfluoropentane (PFP) qui a ensuite été combinée avec la molécule cible de la tumeur, l'acide folique (FA) pour former FA-FRT-PFP. La ferritine est une protéine nanocage endogène hautement biocompatible qui présente une sensibilité au pH [23,24,25]. La protéine peut se désassembler dans un environnement acide et peut être réassemblée dans un environnement alcalin. Cela permet le chargement et la libération contrôlés de ferritine en réponse aux changements de pH [26,27,28]. Le PFP est un matériau de transformation de phase fréquemment utilisé qui montre une température d'ébullition de 29 ^o C. La basse température d'ébullition a facilité la transformation de phase facile par LIFU qui était plus sûre que HIFU. Le PFP a été chargé dans de la ferritine et le FA-FRT-PFP résultant avait un diamètre d'environ 47,3 ± 2,8 nm avec une stabilité élevée aux solutions physiologiques et aux températures. Selon les résultats, le FA-FRT-PFP présentait les avantages suivants :(1) le PFP pouvait être facilement chargé dans le FRT en changeant le pH d'acide à neutre ; (2) sous ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU, 2 W/cm ² , 3 min) et pH =5,0, FA-FRT-PFP libère du PFP et subit des changements de phase pour améliorer les signaux d'imagerie américains par vaporisation de gouttelettes acoustiques (ADV) ; 3) Sous irradiation LIFU à long terme (4 min) et pH =5,0, le PFP libéré par FA-FRT-PFP a explosé et a produit une onde de choc physique qui pourrait détruire efficacement les cellules tumorales par nécrose. À notre connaissance, il s'agit du premier exemple de chargement de PFP dans FRT en tant que tumeur théranostique américaine. Ces résultats indiquent que FA-FRT-PFP + LIFU est une nouvelle stratégie pour le diagnostic et le traitement intégrés des tumeurs.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Gel d'agarose, ferritine (FRT), acide folique (FA) et perfluoropentane (C₃ F₈ , PFP) ont été achetés chez Sigma (St. Louis, MO, USA). NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA et NH₂ -PEG₂₀₀₀ -COOH ont été fournis par Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (Chine). Le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) et le N-hydroxysuccinimide (NHS) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Le kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) a été obtenu auprès de Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japon). Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), la pénicilline-streptomycine, la trypsine-EDTA et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été achetés auprès de Gibco (Grand Island, NY, États-Unis).

Culture cellulaire

La lignée cellulaire du cancer de l'ovaire humain SK-OV-3 a été fournie par l'Institut de biologie cellulaire de Shanghai, Académie chinoise des sciences. Des cellules epitheliales ovariennes normales HUM-CELL-0088 ont été obtenues auprès de PriCells, Wuhan, Chine. Les cellules ont été cultivées dans des milieux DMEM contenant 10 % de sérum bovin foetal et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine. Les cellules ont été maintenues dans un incubateur avec une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂ à 37°C.

Préparation du FA-FRT-PFP

Premièrement, la molécule cible FA a été conjuguée avec FRT par la réaction d'estérification [29]. En bref, NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA (10 mg) et la solution FRT ont été mélangés avec la présence d'EDC (5 mg/mL) et de NHS (20 mg/mL). Après 3 h de réaction à température ambiante sous légère agitation, le mélange est purifié par dialyse contre de l'eau distillée (PM seuil =1,2 kDa) pendant 24 h. La solution résultante était des nanoparticules FA-FRT. Deuxièmement, le chargement de PFP dans la cavité de FRT a été préparé avec le processus de dénaturation et de renaturation de la protéine [30]. En bref, FA-FRT a été dilué dans 5 ml de PBS à 2 mg/ml et ajusté à pH =5,0 avec une légère agitation de 30 min à température ambiante pour assurer une dissociation complète du FRT. Après cela, 500 ul de PFP ont été ajoutés à la solution dans un bain de glace et ont été soumis à une sonication pulsée avec 5 s de marche et 5 s de pause pour un total de 5 min à 80 W dans un bain de glace. Après la sonication, la valeur du pH du mélange a été ajustée à neutre (pH =7,4). Comme le PFP était à l'état d'huile et insoluble dans l'eau, le PFP excessif a été facilement éliminé par séparation liquide pour être FA-FRT-PFP. FRT-PFP a été préparé avec une méthode similaire à l'exception du changement de NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA en NH₂ -PEG₂₀₀₀ -COOH.

Caractérisation de FA-FRT-PFP

Les tailles et les potentiels zêta des nanoparticules ont été testés par un Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). La morphologie de FA-FRT-PFP a été observée par microscopie électronique à transmission (TEM, Hitachi, Japon) et microscopie à fluorescence inversée (Olympus, Japon). La structure chimique des nanoparticules a été détectée par une spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Allemagne). L'absorption cellulaire du FA-FRT-PFP a été détectée par microscopie confocale à balayage laser (LEXT OLS4100, Olympus, Japon). Les cellules à double coloration FITC/PI ont été analysées par cytométrie en flux (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

Les performances des générateurs de gaz sensibles au pH et aux ultrasons

FA-FRT-PFP dans des conditions de pH =5,0 et 7,5 ont été irradiés avec différentes intensités acoustiques de LIFU (1,5 et 2,0 W/cm ² ) et pour un temps total différent (1, 2, 3 et 4 min) dans le modèle de gel d'agarose, puis des images américaines ont été observées par un équipement américain (Esaote Mylab 90, Italie) avec une fréquence de 5 à 12 MHz et un indice mécanique ( MI) de 0,06. Après cela, l'apparition de FA-FRT-PFP a été observée par microscopie optique dans le temps. L'intensité américaine de la région d'intérêt dans l'image américaine a été analysée par le logiciel ImageJ.

Captation cellulaire

Brièvement, 1 mg de FITC a été dissous dans 1 mL de DMSO puis mélangé avec FRT-PFP et FA-FRT-PFP pendant 30 min sous agitation douce. Ensuite, la solution mélangée a été dialysée pendant la nuit dans de l'eau déminéralisée pour éliminer le FITC et le DMSO libres pour obtenir des nanoparticules marquées au FITC. Ensuite, des cellules SK-OV-3 et des cellules ovariennes normales (HUM-CELL-0088) ont été cultivées dans le milieu pendant 24 h, puis le FITC libre, le FRT-PFP marqué au FITC et le FA-FRT-PFP ont été co-incubés avec Cellules SK-OV-3 pendant 5 h. De plus, le FA-FRT-PFP marqué au FITC a été incubé avec des cellules SK-OV-3 prétraitées au FA pendant 5 h. Les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % et colorées avec 0,2 mg/mL de solution de DAPI pendant 10 min. Les cellules ont été imagées par microscopie confocale à balayage laser pour capturer des images fluorescentes. Le signal de fluorescence a été quantifié par un cytomètre en flux.

Imagerie par ultrasons in vitro

Les cellules SK-OV-3 ont été cultivées pendant 24 h dans un milieu sans FA, puis PBS, FRT-PFP et FA-FRT-PFP, et FA-FRT-PFP + FA ont été incubés avec les cellules SK-OV-3 pendant 6h Les cellules ont été collectées et mélangées avec du gel d'agarose, puis les cellules ont été irradiées avec ou sans LIFU pendant 3 min (1 s de marche et 1 s de pause pour un total de 3 min ; 1 MHz ; 2,0 W/cm ² ). Enfin, des images américaines ont été capturées.

Efficacité anticancéreuse in vitro

Les cellules SK-OV-3 ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits à la densité de 1 × 10 ⁴ cellules/puits, et laissés se fixer pendant 24 h. Pour la cytotoxicité de FA-FRT, différentes concentrations (0, 20, 40, 100, 200 et 500 g/mL) de FA-FRT ont été cultivées avec des cellules SK-OV-3. Après 24 h de traitement, les cellules ont été traitées par des milieux DMEM contenant 10 % de CCK-8 pendant 20 min dans un incubateur. L'absorbance des cellules à une longueur d'onde de 450 nm a été détectée par un lecteur de plaques multimode (Thermo Scientific) pour caractériser la viabilité cellulaire. De plus, les cellules SK-OV-3 et les cellules ovariennes normales (HUM-CELL-0088) ont été traitées PBS, FRT-PFP et FA-FRT-PFP et FA-FRT-PFP + FA pendant 3 h, puis ont été irradié par LIFU (1 s avec une pause de 1 s pour un total de 4 min ; 1 MHz ; 2,0 W/cm ² ). Les cellules traitées ont été incubées pendant 21 heures supplémentaires. A titre de contrôle, sans LIFU, les cellules ont été traitées PBS, FRT-PFP, et FA-FRT-PFP et FA-FRT-PFP + FA pendant 24 h. Après cela, la viabilité des cellules traitées a été détectée par le test CCK-8.

Analyse de la mort cellulaire

Pour évaluer le type de mort cellulaire, les cellules SK-OV-3 ont été ensemencées dans des plaques 6 puits à une densité de 5 × 10 ⁴ cellules/mL. Après 24 h, les cellules ont été traitées avec PBS, FRT-PFP et FA-FRT-PFP et FA-FRT-PFP + FA pendant 3 h, puis irradiées avec LIFU (1 s, pause de 1 s pour un total de 4 min ; 1 MHz ; 2,0 W/cm ² ). Les cellules traitées ont été incubées pendant 23 h supplémentaires. En tant que contrôle, les cellules ont été traitées avec du PBS, FRT-PFP et FA-FRT-PFP et FA-FRT-PFP + FA pendant 24 h en l'absence de LIFU. Les cellules ont été trypsinisées, centrifugées à 1500×g pendant 3 min, lavé 3 fois avec du PBS glacé, puis remis en suspension dans 200 ml de tampon de liaison. Ensuite, 5 L d'annexine V-FITC et 10 L de PI ont été ajoutés et incubés avec les cellules pendant 15 min à l'obscurité. Les cellules colorées ont été analysées à l'aide d'un cytomètre en flux.

Western Blot

Le western blot a été réalisé conformément à la littérature antérieure. Les cellules ont été traitées avec 40 g/mL de PBS (contrôle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP combinés avec ou sans irradiation LIFU (2,0 W/cm ² , 4 min) et 21 h d'incubation supplémentaires. Et puis les cellules traitées ont été lysées dans du tampon RIPA (Sigma). Cinquante microgrammes de chaque protéine avec le tampon d'échantillon Laemmli ont été bouillis pendant 5 min et soumis à SDS-PAGE. Les protéines ont été transférées sur membrane PVDF (Bio-Rad Laboratories) en utilisant le Trans-Blot semi-sec (Bio-Rad Laboratories). Les transferts ont d'abord été incubés dans du tampon de blocage TBS contenant soit 2 % de lait, soit 2 % de BSA (pour les anticorps phospho-spécifiques) pendant 1 h à température ambiante, puis avec les anticorps primaires respectifs dilués dans du TBST (contenant 0,1 % de Tween20 et 2 % de BSA) une nuit à 4°C. Par la suite, les transferts ont été lavés et incubés avec des anticorps secondaires appropriés (Santa Cruz) dans du TBST et détectés à l'aide du substrat chimioluminescent SuperSignal West Pico (Thermo).

Analyse statistique

Toutes les données sont présentées en moyenne ± écart type. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du test t de Student. *P <0,05, **P <0,01 ont été considérés comme statistiquement significatifs.

Résultats et discussion

Préparation et Caractérisation de FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP a été synthétisé et utilisé pour le traitement des tumeurs (Fig. 1). Des gouttelettes de transformation de phase ont été chargées dans FRT par le biais du démontage et du réassemblage réversibles induits par le pH de FRT. Le PFP avec vaporisation de gouttelettes acoustiques induite par LIFU (ADV) a été délivré dans les cellules et a agi comme un agent d'imagerie par ultrasons. La figure 2a–c montre des images MET de FRT, FRT-PFP et FA-FRT-PFP, qui étaient de morphologie sphérique. Les tailles de particules moyennes de FRT, FRT-PFP et FA-FRT-PFP étaient respectivement de 6,9 ​​± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm et 47,3 ± 2,8 nm (Fig. 2d), démontrant que la charge de PFP et la conjugaison FA ont amélioré la taille de FRT. Le potentiel zêta moyen de FRT et FA-FRT-PFP était respectivement de − 43,2 ± 3,1 mV, − 46,9 ± 2,2 mV et − 41,5 ± 2,7 mV (Fig. 2e). De plus, la conjugaison de FA avec FRT a été caractérisée par FT-IR comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1. Le spectre FT-IR affichait des bandes d'absorption à ~ 1110 cm ⁻¹ peut correspondre à la liaison vibrationnelle éther C–O–C du PEG ; pics d'absorption à ~ 1601 cm ⁻¹ et ~ 1710 cm ⁻¹ appartiennent aux liaisons vibrationnelles C=O de PEG et FRT ainsi que de –COOH et –CONH₂ de FA et FRT; les bandes à ~ 2820 cm ⁻¹ , ~ 2920 cm ⁻¹ , et ~ 2950 cm ⁻¹ correspondent aux vibrations d'étirement C–H asymétriques et symétriques de –CH₂ de FA et PEG; pics d'absorption à ~ 1440 cm ⁻¹ sont associés au cycle phényle de FA. Le résultat confirme la conjugaison réussie de FA avec FRT. Au cours de la période de stockage de 28 jours, la taille et le PDI de FA-FRT-PFP dans l'eau, le PBS, la solution saline et le FBS n'ont pas changé de manière significative (Fig. 3a, b), indiquant que FA-FRT-PFP montre une excellente stabilité. La figure 3c montre le changement de taille de FA-FRT-PFP à diverses températures allant de 25 ^o C à 45 ^o C. La taille de FA-FRT-PFP était presque inchangée lorsque la température a été réduite à 25-40 °C, indiquant que FA-FRT-PFP montre une stabilité élevée en dessous de 40 ^o C. Lorsque la température a atteint 45 °C, la taille de FA-FRT-PFP variait de 42,1 nm à 6 nm, probablement en raison du fait que le PFP dans FA-FRT-PFP subissait une gazéification sévère, entraînant la rupture des nanoparticules. La température de gazéification du FA-FRT-PFP est passée de 29 ^o C (température de gazéification du PFP sous pression normale) à 45 ^o C, probablement en raison de la couverture du shell FRT [21, 31,32,33].

Représentation schématique de la synthèse de FA-FRT-PFP et de son application en théranostic tumoral

un –c Images TEM de FRT, FRT-PFP et FA-FRT-PFP. d , e La taille et la distribution du potentiel zêta de FRT, FRT-PFP et FA-FRT-PFP

un , b Changement de taille et de PDI de FA-FRT-PFP dans l'eau, le PBS, le sérum physiologique et le FBS sur 28 jours. c Le changement de taille de FA-FRT-PFP à différentes températures de 25 ^o C à 45 ^o C

Amélioration du pH et du LIFU Responsive US

Des expériences fantômes américaines de FA-FRT-PFP ont été réalisées à différentes valeurs de pH et intensité de puissance LIFU. Comme le montre la figure 4a, en l'absence d'irradiation LIFU (pré), le signal US était faible dans tous les groupes. À pH 7,5 après 3 min d'irradiation LIFU, FA-FRT-PFP a montré un faible signal US à la fois à 1,5 et 2,0 W/cm ² , tandis qu'à pH =5,0 sous le même temps d'irradiation LIFU, FA-FRT-PFP avait une intensité de signal US plus forte. Cela a démontré que le FA-FRT-PFP montrait des effets ADV dépendant du temps et de l'intensité acoustique. En effet, à pH =5,0, FA-FRT-PFP a désassemblé et libéré le PFP, ce qui facilite la transformation de phase. Fait intéressant, lorsque le temps d'irradiation LIFU a été prolongé à 4 min, FA-FRT-PFP à pH =5,0 et 2,0 W/cm ² de LIFU avait une intensité de signal US plus faible par rapport à celle à un temps d'irradiation inférieur, probablement en raison du LIFU à cette condition est trop fort pour induire la rupture des bulles. Ces résultats ont démontré que le FA-FRT-PFP pouvait libérer du PFP, générant des transformations de phase et une explosion à 2,0 W/cm ² d'irradiation LIFU à pH =5,0. Les résultats de l'intensité US sont montrés dans la Fig. 4b, c. La figure 4d-g montre la morphologie des solutions FA-FRT-PFP après 3 min d'irradiation LIFU (2,0 W/cm ² ) et à pH =7,5 et 5,0. FA-FRT-PFP à pH =5,0 et 2,0 W/cm ² LIFU a généré de grosses bulles, validant davantage nos découvertes.

un Images américaines de FA-FRT-PFP mélangées avec du gel d'agarose à différentes valeurs de pH et irradiées par différentes intensités de puissance LIFU. b , c Les données statistiques correspondantes du signal américain en a . d –g Les images de microscopie optique de FA-FRT-PFP mélangées à du gel d'agarose à différentes valeurs de pH et irradiées à 2,0 W/cm ² pendant 3 minutes

Captation cellulaire

La figure 5 montre la capacité d'absorption cellulaire de FA-FRT-PFP. Les cellules traitées au FITC libres ont montré une fluorescence négligeable, mais après le marquage sur FA-FRT-PFP, un fort signal de fluorescence était évident, indiquant que FA-FRT-PFP a une forte capacité d'absorption cellulaire. Les cellules traitées par FRT-PFP et FA-FRT-PFP pré-incubées avec FA ont montré une fluorescence FITC plus faible. Cela a en outre démontré que l'AF améliore le ciblage actif des nanoparticules. De plus, FA-FRT-PFP a montré un comportement d'absorption comparable à celui du FCM (Fig. 5c, d). Les taux d'absorption de FA-FRT-PFP étaient de 46,5 ± 2,8 %, ce qui était significativement plus élevé que celui de FITC libre (contrôle), FRT-PFP et FA-FRT-PFP + FA. En outre, fichier supplémentaire 1 :la figure S2 montre l'absorption cellulaire des nanoparticules dans les cellules ovariennes normales. Il n'y a pas de différences significatives entre les groupes FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP dans l'absorption cellulaire. Cela est probablement dû au fait que les cellules ovariennes normales (HUM-CELL-0088) ont une faible expression des récepteurs FA par rapport aux cellules SK-OV-3.

Absorption cellulaire. un , b Les images de fluorescence confocale des cellules traitées avec du FITC libre et FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP marqués au FITC. Les couleurs verte et bleue représentaient respectivement la fluorescence FITC et DAPI. Barre d'échelle =25 m. c , d Le signal de fluorescence FITC et les données statistiques correspondantes à l'intérieur des cellules traitées avec du FITC libre et des FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP étiquetés FITC

Imagerie échographique in vitro

Pour confirmer que FA-FRT-PFP améliore l'imagerie échographique par ADV in vitro, des nanoparticules ont été incubées avec les cellules pendant 5 h et irradiées avec ou sans LIFU (2,0 W/cm ² ). Comme le montre la figure 6a en l'absence d'irradiation LIFU, les cellules de tous les groupes testés n'ont montré aucun signal ultrasonore amélioré alors qu'après l'irradiation LIFU, les cellules traitées par FA-FRT-PFP ont montré des intensités américaines élevées par rapport aux contrôles FRT-PFP et FA-FRT -Groupes PFP + FA, respectivement. Pour l'imagerie par ultrasons, l'analyse quantitative des valeurs de niveaux de gris a été calculée à l'aide du logiciel ImageJ. Les résultats étaient cohérents avec les données d'imagerie US (Fig. 6b) montrant que l'intensité US des cellules traitées par FA-FRT-PFP était augmentée après irradiation par LIFU à 2,0 W/cm ² pendant 3 minutes. FA-FRT-PFP pénètre dans les cellules et dans l'environnement acide des lysosomes (pH =~ 5,0) se désassemble et libère la PFP dans le cytoplasme [34, 35]. Après l'irradiation LIFU, le PFP a facilement généré des transformations de phase de gouttelettes en gaz, ce qui a amélioré l'intensité des États-Unis.

Imagerie échographique in vitro. un Les images échographiques et les données statistiques correspondantes (b ) de cellules traitées au PBS (témoin), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP avec ou sans irradiation LIFU (2,0 W/cm ² , 3 minutes)

Analyse de l'efficacité anticancéreuse et de la mort cellulaire in vitro

La figure 7a montre la cytotoxicité de FA-FRT-PFP à des concentrations allant jusqu'à 0,5 mg/mL. En l'absence d'irradiation LIFU, FA-FRT-PFP n'a montré aucune suppression évidente de la viabilité dans les cellules SK-OV-3. Les tests CCK-8 ont été utilisés pour analyser l'efficacité anticancéreuse de FA-FRT-PFP combiné avec LIFU. Comme le montre la figure 7b, en l'absence d'irradiation LIFU, FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP n'ont présenté aucune cytotoxicité remarquable par rapport aux groupes témoins. Lorsqu'il est combiné avec 4 min d'irradiation LIFU, FA-FRT-PFP a montré une cytotoxicité significative qui était supérieure à celle de FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, avec des taux d'inhibition cellulaire de pointe approchant 90 % à 40 g/mL. Cela peut être dû au fait que FA-FRT-PFP est plus facilement absorbé dans le cytoplasme puis les lysosomes par rapport à FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. Dans l'environnement acide des lysosomes, FA-FRT-PFP a libéré la PFP dans le cytoplasme. Sous 4 min d'irradiation LIFU, le PFP libéré s'est gazéifié, provoquant une cavitation et une rupture, générant une série de forces de choc physiques qui ont considérablement amélioré les effets destructeurs des tumeurs [36,37,38]. De plus, le fichier supplémentaire 1 :la figure S3 montre la cytotoxicité des nanoparticules dans les cellules ovariennes normales. Il n'y a pas de différences significatives entre les groupes FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP en termes de cytotoxicité lorsqu'ils sont combinés avec LIFU. Le résultat peut être dû au fait que les cellules HUM-CELL-0088 ont une faible expression des récepteurs FA qui n'ont montré aucun effet de ciblage FA.

Efficacité anticancéreuse in vitro. un Viabilités cellulaires des cellules SK-OV-3 après 24 h d'incubation avec différentes concentrations de FA-FRT-PFP. b Viabilités cellulaires des cellules SK-OV-3 traitées avec 40 g/mL de PBS (contrôle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP combinés avec ou sans irradiation LIFU (2,0 W/cm ² , 4 min) et 21 h d'incubation supplémentaires

Comme le montrent les figures 8a, b, en l'absence d'irradiation LIFU, les cellules ont montré une mort cellulaire minimale dans tous les groupes. Après 4 min d'irradiation LIFU, les cellules traitées par FA-FRT-PFP ont montré une nécrose significative (~ 91,6%) par rapport aux autres groupes en raison des ondes de choc physiques générées par la cavitation PFP induite par LIFP ou le dynamitage de bulles. En outre, fichier supplémentaire 1 :la figure S4 montre le niveau d'expression de la protéine TNF des cellules. Sans LIFU, les cellules exprimaient à peine la protéine TNF. Alors qu'avec LIFU, les cellules du groupe FA-FRT-PFP ont un niveau élevé d'expression du TNF, par rapport à celles des groupes FRT-PFP et FA-FRT-PFP + FA, indiquant que la protéine TNF était un FA-FRT-PFP vital + Protéine liée à la mort induite par LIFU [39]. Sur la base de l'excellent effet de la thérapie anticancéreuse in vitro [40,41,42], FA-FRT-PFP est prometteur pour la future thérapie anticancéreuse in vivo.

un Analyse par cytométrie de flux et les données statistiques correspondantes des cellules SK-OV-3 traitées avec 40 g/mL de PBS (contrôle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA et FA-FRT-PFP combinés avec ou sans LIFU rayonnement (2,0 W/cm ² , 4 min) et 23 h d'incubation supplémentaires

Conclusion

En résumé, nous avons développé avec succès des nanoparticules à transformation de phase à base de FRT et chargées de PFP modifiées avec une molécule cible FA (FA-FRT-PFP). En tant que nouveau théranostic américain ciblé, le FA-FRT-PFP présentait de multiples avantages :(1) le FA-FRT-PFP avait une taille de particule à l'échelle nanométrique ; (2) FRT a été utilisé comme support, qui pouvait se désassembler et se réassembler pour télécharger et libérer des gouttelettes de PFP dans des conditions acides et neutres, respectivement ; (3) sous 3 min d'assistance LIFU et de conditions acides, FA-FRT-PFP a libéré PFP et généré des transformations de phase via ADV, ce qui pourrait augmenter considérablement son contraste américain ; (4) sous 4 min d'irradiation par LIFU et un environnement acide, le PFP libéré pourrait facilement induire un « effet d'explosion » intracellulaire, entraînant des caractéristiques physiques antitumorales. Ces résultats démontrent que FA-FRT-PFP avec l'assistance de LIFU fournit une nouvelle stratégie pour l'imagerie moléculaire par ultrasons et la thérapie tumorale.

Disponibilité des données et des matériaux

Les conclusions tirées dans ce manuscrit sont basées sur les données qui sont toutes présentées et montrées dans cet article.

Abréviations

ADV :

Vaporisation acoustique de gouttelettes

ARP :

Plateforme de réponse acoustique.

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

EDC :

1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide

FA :

Acide folique

FBS :

Sérum fœtal bovin

FITC :

Isothiocyanate de fluorescéine

FRT :

Ferritine

LIFU :

Ultrasons focalisés de faible intensité

NHS :

N-hydroxysuccinimide

PFP :

Perfluoropentane

États-Unis :

Échographie