Études préliminaires sur les nanoparticules d'oxyde de zinc biodégradables dopées au Fe comme forme potentielle d'apport de fer à l'organisme vivant

Introduction

Le fer est l'un des composants les plus importants de la construction des organismes vivants sur Terre, y compris la population humaine. L'importance de cet élément est liée au rôle essentiel du fer dans de nombreuses structures et processus qui se déroulent dans le corps, par ex. transport de l'oxygène autour des tissus et des cellules du corps entier (partie de l'hémoglobine et de la myoglobine), production d'énergie (composant des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale à l'intérieur) beaucoup plus [1, 2]. Ainsi, le fer participe à des processus vitaux cruciaux des cellules et de l'organisme entier et sa carence peut entraîner des perturbations importantes dans le fonctionnement du corps vivant.

Comme le montrent les rapports mondiaux, la carence en fer devient un grave problème de santé publique dans la population humaine. Selon l'OMS, près de 30 % de la société dans le monde a été touchée par l'anémie au cours des années 1993-2005. La prévalence de l'anémie est encore beaucoup plus élevée chez les jeunes enfants et les femmes enceintes [3]. L'importance de la supplémentation en fer pendant la grossesse est liée au fait que la carence en fer est un facteur de risque d'accouchement prématuré, de faible poids à la naissance des nouveau-nés et de leur état de santé général pire [4]. Dans le cas des nourrissons et des jeunes enfants d'âge préscolaire, le facteur de risque de carence en fer est causé par la croissance rapide de l'ensemble du corps et la consommation ultérieure des réserves de fer ; ainsi, la supplémentation en fer est également recommandée pour les enfants entre 0 et 5 ans [5]. Fait intéressant, il existe des rapports scientifiques indiquant la corrélation entre un niveau de fer approprié chez les enfants et leur développement émotionnel et neuropsychologique [6]. De plus, la carence en fer est également un trouble nutritionnel grave chez d'autres espèces de mammifères, en particulier chez les porcelets allaités, où un apport intra-utérin limité de cet élément est associé à une faible teneur en fer dans le lait de truie [7, 8]. De plus, une croissance rapide des porcelets épuise rapidement les restes de réserves de fer, car en quelques jours les porcelets nouveau-nés doublent leur poids corporel, augmentant ainsi le nombre de globules rouges et le volume sanguin général. Ainsi, de nos jours, une stratégie de supplémentation en fer plus efficace et plus sûre pour la population humaine et animale est devenue l'un des défis les plus importants dans la prévention et le traitement des carences nutritionnelles.

Il existe trois principaux modes d'apport de fer supplémentaire à l'organisme vivant :intraveineux, intramusculaire et oral. Chacun d'eux démontre à la fois les avantages et les inconvénients de la méthode. L'administration orale semble être simple et plus naturelle pour l'organisme, impliquant des voies physiologiques d'absorption et de transport du fer. Aussi, cette méthode préserve un système naturel contrôlant la quantité de fer circulant dans l'organisme à base d'hepcidine [9]. Cependant, la voie orale de la supplémentation est souvent en proie à une mauvaise absorption et à une faible efficacité finale. Des études scientifiques ont également rapporté que la stratégie standard de supplémentation en fer soluble par voie orale affecte fortement la composition et l'activité métabolique du microbiome intestinal des animaux [10]. D'autre part, les voies intraveineuses ou intramusculaires d'administration du fer à l'organisme sont entravées par le risque d'effets secondaires toxiques [11]. De plus, dans l'élevage porcin industriel, la méthode standard de supplémentation en fer basée sur l'administration intramusculaire individuelle d'une dose unique de fer-dextrane est stressante pour les animaux et gênante pour les éleveurs. De plus, une injection mal effectuée peut provoquer une inflammation et d'autres complications chez les animaux, ainsi que contribuer à la propagation de diverses maladies dans le troupeau, lorsque les conditions de stérilité ne sont pas respectées.

Mentionnés ci-dessus, les effets secondaires toxiques de l'apport de fer exogène à l'organisme vivant sont associés à l'apparition d'éléments ferreux libres et non liés dans le corps, qui, en tant que métal de transition (par un changement de valence) peuvent conduire à la production de radicaux libres nocifs (à savoir l'oxygène réactif espèces—ROS) par réaction de Fenton [12]. Des rapports scientifiques ont indiqué un risque d'augmentation du niveau de radicaux libres dans l'organisme en tant que facteur contribuant à diverses affections, notamment :les infections bactériennes, la néoplasie ou les maladies du foie [13]. La stratégie naturelle et physiologique de prévention de la génération de ROS par le fer libre est basée sur la liaison de l'élément fer avec des protéines particulières à chaque étape de ses voies d'absorption et de transport dans le corps. En cas de surcharge en fer par voie orale et de son administration intraveineuse/intramusculaire, les voies physiologiques de la circulation du fer sont généralement débordées entraînant une augmentation rapide des ROS [14].

Les nanoparticules à base de fer (NPs à base de Fe) ont été largement étudiées comme un outil prometteur à des fins biomédicales. L'utilisation la plus répandue de ces nanostructures est liée à leurs propriétés magnétiques; ainsi, ils ont été principalement testés comme agents de contraste pour des techniques de diagnostic clinique visant à l'imagerie tumorale ou à l'accumulation dans des tissus particuliers [15]. Récemment, les nanostructures ont également été étudiées en tant que nouvelle forme plus efficace d'administration de substances bioactives à l'organisme. Les porteurs de NP peuvent révéler une biodisponibilité considérablement accrue pour l'organisme vivant, par rapport aux substances en vrac, ce qui est principalement lié à leur plus petite taille [16, 17]. Dans l'une des études, l'efficacité des NP contenant du fer a été comparée au sulfate ferreux (supplément standard pour le traitement de l'anémie) chez des rats anémiques. Sur la base des analyses de sang, les résultats obtenus ont montré une augmentation de la biodisponibilité du fer après une dose unique orale de NP avec du fer chez des animaux anémiques. En cas de doses multiples de nanoparticules et de sulfate ferreux, les résultats obtenus étaient similaires [18]. Une autre étude a décrit les résultats obtenus des nanomatériaux à base de Fe en tant qu'agents alternatifs de livraison de fer sur les humains et un modèle de rongeur. Les auteurs ont particulièrement souligné une sécurité supérieure du nanoFe par rapport aux formes solubles du fer, ce qui a entraîné un manque d'accumulation de fer dans la muqueuse intestinale et la promotion d'un microbiote bénéfique [19]. Des résultats tout aussi prometteurs ont été obtenus dans l'étude sur des rats anémiques traités avec des NP à base de Fe coiffées de vitamine C, ce qui a permis d'éviter la voie standard d'absorption du Fe à partir du tractus gastro-intestinal. Les résultats obtenus ont indiqué la récupération des animaux testés de la maladie anémique ainsi que l'amélioration de leurs paramètres sanguins en peu de temps, par rapport à la méthode standard de traitement de la carence en fer [20].

Matériel et méthodes

Synthèse de nanoparticules

Des nanoparticules d'oxyde de zinc dopées au fer (ZnO:Fe NPs) ont été synthétisées en utilisant la technique hydrothermale micro-ondes. La méthode est bien établie, relativement peu coûteuse, biocompatible et évolutive industriellement, capable d'introduire différents ions étrangers en tant que dopants fonctionnels [21,22,23,24,25], dans une variété d'oxydes [26,27,28]. La concentration de fer dans les nanoparticules présentes a été fixée à 5% molaire. La synthèse a été menée à partir des nitrates(V) :Zn(NO₃ )₂ ·6H₂ O (99 %, Sigma-Aldrich) et Fe(NO₃ )₃ ·9H₂ O (96 %, Carl Roth). Nous avons testé divers fournisseurs et choisi ceux qui offrent le produit le plus uniforme qui ne contient pas de niveaux mesurables de restes non solubles. Les composés ont été dissous dans de l'eau distillée :17,63 µg de nitrate de zinc (V) et 1,25 µg de nitrate de fer (III) (V). La solution claire a ensuite été alcalinisée en utilisant une solution aqueuse d'ammoniaque à 25 % (Carl Roth) jusqu'à un pH de 8. Le résidu rouge résultant a été lavé à l'aide d'un entonnoir de Büchner, avec environ 1 l d'eau distillée et filtré par aspiration. Le précipité a été placé dans un récipient en Téflon de 100 ml, rempli d'eau à 80 % du volume puis fermé dans une chambre de réacteur Ertec Magnum II. Le processus hydrothermal par micro-ondes a été mené à 4 MPa par 20 min. Après réaction, le produit rouge pâle a été recueilli et séché pendant une nuit à 60 °C.

Caractérisation des nanoparticules

La caractérisation du produit a été effectuée par microscopie électronique à balayage (MEB), spectroscopie de photoluminescence (PL) et de cathodoluminescence (CL) et analyse élémentaire à dispersion d'énergie (EDX). Les mesures SEM ont été effectuées avec un microscope Hitachi SU-70 haute résolution (1 nm), équipé d'un détecteur de rayonnement caractéristique et d'un système de cathodoluminescence GATAN Mono CL3 en modes électron secondaire (SE) et transmission (TE). Les spectres d'émission et d'excitation de photoluminescence ont été enregistrés à l'aide d'un spectrofluorimètre Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3, équipé d'une lampe au xénon comme source d'excitation et d'un photomultiplicateur Hamamatsu R928P. La diffusion dynamique de la lumière (DLS) et le potentiel zêta ont été mesurés avec le système de caractérisation des particules DelsaMax Pro. L'analyse par thermogravimétrie (TGA) a été réalisée à l'aide du thermogravimètre NETZSCH STA 449 F1 Jupiter sous flux d'argon. Les mesures SEM ont été effectuées après dépôt des nanoparticules sur la maille de cuivre 400 enduite de polycarbonate Agar. L'échantillon a été mis en suspension dans de l'eau distillée à l'aide d'un processeur à ultrasons Sonics VCX500, puis une goutte de la suspension a été placée sur le maillage puis séchée. L'échantillon a été préparé après une sédimentation de 2 h de particules plus lourdes.

Modèle In Vitro

Pour la présente étude, la lignée cellulaire Caco-2 (cellules d'adénocarcinome du côlon caucasien) a été utilisée comme modèle de cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal. La lignée cellulaire a été obtenue auprès de The European Collection of Authenticated Cell Cultures-ECACC (Sigma-Aldrich, Cat. No. 86010202). Les cellules ont été ensemencées à 0,5 × 10 ⁶ cellules/ml sur des plaques 6 puits ou 96 puits et maintenus en Dulbecco's Modification of Eagle's Medium-DMEM (Gibco), additionné de 10% de sérum bovin foetal-FBS (Gibco), 1% d'acides aminés non essentiels-NEAA (Gibco ), 1 % pénicilline-streptomycine-néomycine-PSN (Gibco) et 0,2 % de bicarbonate de sodium (Gibco) à 37 °C et 5 % de CO₂ . Lorsqu'une confluence de 95 à 100 % a été observée, le milieu de culture cellulaire a été retiré et une suspension de ZnO:Fe NPs dans un milieu de croissance frais a été ajoutée. Les cellules ont été incubées avec quatre concentrations différentes de NP de ZnO:Fe (1,0 ; 0,1 ; ​​0,01 ; et 0,001  mg de NP de ZnO:Fe/ml) pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂ .

Analyses de viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été évaluée pour Caco-2 en utilisant deux méthodes :dosage XTT et coloration au bleu Trypan. Tous les réactifs requis pour le test XTT ont été fournis à partir du kit commercial (Cell Proliferation Kit II, Roche). Suite à l'incubation des cellules cultivées sur plaque 96 puits avec différentes concentrations de ZnO:Fe NPs, les cellules ont été incubées avec 50 μl de mélange de marquage XTT pendant 4 h à 37 °C et 5% CO₂ . Par la suite, la concentration de formazan a été évaluée avec une méthode spectrophotométrique. L'absorbance a été mesurée à 470/650  nm et les résultats ont été corrélés avec le nombre de cellules viables. Dans l'expérience suivante, le résultat d'absorbance le plus élevé a été supposé être la viabilité à 100 % des cellules. Les résultats finaux ont été calculés sur la base de quatre répétitions d'expérience distinctes (n =4).

Afin d'effectuer la coloration au bleu trypan, après que les cellules cultivées sur des plaques à 6 puits aient été incubées avec différentes concentrations de NP de ZnO:Fe, les cellules ont été collectées (0,05 % de tripine et 0,2 % d'EDTA pendant 10 min), centrifugées et le culot a été re- en suspension dans 1 ml de milieu de croissance. Cent microlitres de solution stérile de bleu trypan à 0,4% ont été mélangés à 100 µl de suspension cellulaire. Dix microlitres d'échantillon ont été chargés sur la lame de comptage et analysés à l'aide du logiciel JuLi Br Couting (NanoEnTek) pour évaluer le nombre de cellules viables. Les résultats finaux ont été calculés sur la base de trois répétitions d'expérience distinctes (n =3).

Modèle animal

Aux fins de cette étude préliminaire, des souris Balb-c mâles adultes (n =6) ont été individuellement maintenus dans des conditions de vie standard et contrôlées (période lumière-obscurité de 12/12 h, 25 °C, humidité de 30 %) avec de la nourriture et de l'eau standard (fournies à volonté). Toutes les procédures ont été acceptées par le Comité d'éthique local, accord no. WAW2/59/2017. Après 7 jours d'acclimatation, une suspension de ZnO:Fe NPs dans l'eau (10 mg/ml ; 0,3 ml/souris) a été administrée par gavage oral (IG) aux animaux du groupe expérimental (n =4) . Les souris du groupe témoin ont reçu 0,3 ml d'eau potable par IG (n =2). Au cours de l'expérience, nous n'avons remarqué aucun changement de comportement chez les animaux testés ni aucune anomalie tissulaire. Après 24h, les souris du groupe expérimental et du groupe témoin ont été sacrifiées dans du CO₂ -O₂ chambre (CO2 Box, Bioscape, Merazet) avec prélèvement ultérieur de tissus. La moitié des échantillons fraîchement collectés ont été congelés à -20°C pour la spectrométrie d'absorption atomique (AAS). La seconde moitié des tissus a été fixée dans du formol tamponné à 4 % et transférée dans de l'éthanol à 70 % (après 24 h). Par la suite, les échantillons ont été déshydratés dans des concentrations croissantes d'éthanol, inclus dans de la paraffine (Leica TP1020, Leica EG1150) et des lames microscopiques de 6 µm (ou 4 µm pour les examens histopathologiques) ont été préparées avec un microtome (Leica RM2255). /P>

Accumulation de fer évaluée par la coloration de Perl

Des lames de microscopie de la rate, du foie et du cerveau ont été colorées avec la méthode de Perl (bleu de Prusse) pour la présence de fer. Les échantillons ont été déparaffinés et réhydratés dans de l'eau distillée, puis placés dans une solution de travail avec des parties égales de ferricyanure de potassium à 5 % (Sigma-Aldrich) et à 5 % d'acide chlorhydrique (Sigma-Aldrich) et colorés pendant 30 min. Par la suite, les coupes ont été rincées à l'eau et contre-colorées avec du rouge nucléaire (Sigma-Aldrich) pendant 5 min, rincées à l'eau et montées sous les lamelles avec Permount (Fisher Scientific). Les images des échantillons colorés ont été prises à l'aide du microscope Olympus BX60 et du logiciel d'acquisition d'images Cell^P. À partir de chaque échantillon testé, 16 images choisies au hasard ont été sélectionnées pour d'autres examens avec MicroImage v.4.0 (Olympus) selon le protocole d'analyse d'images à domicile [29]. Pour les examens spléniques, seule la pulpe rouge au sein du tissu a été prise en compte lors des analyses. La teneur en fer a été calculée en tant que rapport entre la surface et l'intensité des taches positives en fer (couleur bleue) et la surface des noyaux cellulaires dans une image.

Concentration de fer dans les tissus testés mesurée par spectrométrie d'absorption atomique

Des échantillons de tissus préalablement collectés, stockés à -20°C et ensuite décongelés ont été préparés pour une évaluation quantitative supplémentaire de la concentration en fer avec la méthode de spectrométrie d'absorption atomique (AAS), selon le protocole décrit en détail avant [24]. Brièvement, les tissus ont été pesés et conservés pendant> 16 h dans la solution contenant 5 ml d'acide nitrique à 65 % et 1 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 % (Merck). Par la suite, les échantillons ont été minéralisés dans le système micro-ondes Ethos 900 (Milestone, États-Unis) en solution liquide et évalués avec AAS (Perkin-Elmer) pour la teneur en fer.

Analyse statistique

Les données obtenues dans l'étude ont été présentées comme une moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Pour l'évaluation statistique de l'accumulation de fer obtenue avec la coloration de Perl, une ANOVA à un facteur avec un test post hoc de comparaison multiple de Tukey-Kramer a été réalisée pour tous les groupes. Pour évaluer une différence significative entre les groupes témoins et expérimentaux à partir des analyses AAS, un t non apparié test a été utilisé. Des différences significatives entre les groupes témoins et expérimentaux dans les expériences in vitro ont été évaluées en utilisant l'ANOVA à un facteur avec le test de comparaisons multiples de Dunnett. Les analyses statistiques ont été calculées avec GraphPad InStat 3.10. Pour tous les tests, les résultats obtenus ont été considérés comme statistiquement significatifs avec P ≤ 0,05 et P ≤ 0,01 et P ≤ 0,001 comme hautement et extrêmement significatif.

Résultats

Caractérisation des nanoparticules

Des images de microscopie électronique à balayage (MEB) de nanocristaux de ZnO:Fe cristallisés dans un processus hydrothermal micro-ondes sont présentées sur la figure 1. La poudre sèche stockée après la synthèse a été dispersée dans l'eau à l'aide d'un bain à ultrasons, puis déposée sur le cuivre 400 mesh. La suspension résultant du traitement aux ultrasons a été laissée pendant 2 h pour l'agglomération et la sédimentation des gros grains. Dans l'échantillon, on voit couramment des cristaux de ZnO en forme de prismes hexagonaux allongés. Les cristaux sont allongés dans le sens de la croissance des plans c - [001]. L'intersection des prismes est clairement visible sur l'image :les hexagones ont une taille de 50 à 100  nm. Fondamentalement, les nanoparticules sont agglomérées et forment des structures plus grandes. La figure 1b montre une telle structure de cristaux de ZnO:Fe fortement agglomérés et groupés. L'échantillon est également composé de grains non uniformes dont la distribution granulométrique est comprise entre des centaines de nanomètres et des micromètres. Il n'y a pas d'indication claire de l'existence d'une phase séparée autre que ZnO, suggérant l'absence de cristallisation de la phase à base de fer (par exemple, l'oxyde de fer) [30].

Images de microscopie électronique à balayage de NPs de ZnO:Fe déposées sur des mailles de cuivre après sédimentation de gros agrégats. Grossissement 100 kx (a ) et 20 kx (b ). Une suspension contenant 1 mg de nanoparticules de ZnO par millilitre d'eau a été déposée goutte à goutte sur la maille de cuivre revêtue de polycarbonate pour permettre des observations en microscopie à balayage à haute résolution

L'analyse thermogravimétrique (TGA) et la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) ont été réalisées sous flux d'argon de la température ambiante à 800 °C et les résultats obtenus sont présentés sur la Fig. 2. La première perte de masse a eu lieu jusqu'à 200 °C et il a provoqué une diminution de la masse de l'échantillon de 4,78 % par rapport à sa masse initiale. La seconde perte a été enregistrée entre 200 et 400°C et sa valeur est d'environ 7,36%. Il n'y a pas eu d'autres diminutions de masse jusqu'à 800°C. Le premier était lié à l'évaporation des molécules d'eau adsorbées en surface et le second était probablement causé par une réduction des groupes hydroxyle. La courbe DSC montre un pic endothermique à 118,3 °C (− 0,6175 mW/mg, évaporation de l'eau) et un pic exothermique à 283,1 °C (0,4356 mW/mg, décomposition des groupes hydroxyles). Le petit effet lié à la décomposition a indiqué que la cristallisation presque complète des nanoparticules de ZnO:Fe s'est produite dans le processus hydrothermique par micro-ondes.

ATG/DSC des NPs ZnO:Fe chauffés à l'argon

La figure 3 montre les spectres de photoluminescence à température ambiante de ZnO:Fe NPs. Le spectre d'émission (Fig. 3a) se compose de deux caractéristiques :une luminescence de faible intensité à proximité de la bande proche (NBE) et une luminescence d'émission de niveau profond (DLE) large et très intense. Le premier culmine à ~ 380 nm tandis que le second à 600  nm. La dominance de l'intensité DLE sur le spectre suggère que les nanocristaux obtenus étaient fortement défectueux au niveau cristallographique [31,32,33]. Le spectre d'excitation (Fig. 3b) indique le mécanisme d'émission à partir de niveaux profonds dans la bande interdite de ZnO:Fe.

Émission de photoluminescence (PL) (a , _sauf =260 nm) et excitation (b , λ_em =595 nm) spectres de ZnO:Fe NPs. Les échantillons ont été versés sans serrer dans la matrice d'aluminium puis rééquilibrés pour permettre les mesures de PL. Le deuxième ordre et les ordres supérieurs de longueur d'onde d'excitation ont été filtrés avec un filtre passe-bande spectral

Le spectre de cathodoluminescence des NP de ZnO:Fe est illustré à la figure 4 ; Le rapport d'intensité DLE/NBE est ≈ 25. La bande NBE culmine à env. 380 nm, la bande DLE contient quatre composants culminant à ~ 570, 625, 653  nm et très faible à 770 nm. Selon McCluskey et Jokela [34], la bande de 570 nm est liée aux lacunes d'oxygène, tandis que d'autres ont été attribuées aux lacunes de zinc dans le réseau de type wurtzite [35].

Spectre de cathodoluminescence (CL) des NP de ZnO:Fe. La nanopoudre sèche a été pastillée pour obtenir un spectre CL provenant d'un grand volume de l'échantillon. Les bandes illustrées illustrent la quantité et la qualité des défauts cristallographiques présents dans les nanocristaux d'oxyde de zinc

La quantité de fer dans l'échantillon a été déterminée à l'aide de deux techniques :la spectroscopie d'absorption atomique (AAS) et la spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDX). Dans le cas de l'AAS, la suspension préparée de manière similaire à celle utilisée dans l'expérience sur les rongeurs a été analysée pour indiquer 3,98 % atomique de Fe dans le ZnO:Fe. Par la méthode EDX, la poudre sèche a été analysée dans le treillis de cuivre pour trouver la concentration de fer est de 4,5% à. par rapport aux ions zinc.

Les propriétés de la suspension ont été mesurées à l'aide des méthodes DLS et TEM, avec la distribution des diamètres des nanoparticules illustrée à la Fig. 5. La distribution est bimodale :pour une population, le diamètre le plus fréquent était entre 20 et 100  nm (TEM) ainsi qu'entre 50 et 200 nm (DLS). La deuxième population contient une quantité inférieure d'objets plus gros de 100 à 500  nm (TEM) et env. 150–500 nm (DLS). Le caractère bimodal des nanoparticules est clairement observé par les deux méthodes présentées. Une forte dispersion des tailles dans la population plus large indique qu'elle correspond à des nanoparticules agglomérées. Les statistiques présentées pour les diamètres supérieurs à 100  nm indiquent de nombreuses façons différentes de s'agglomérer les nanoparticules de ZnO:Fe. Les nanoparticules en suspension dans l'eau étaient chargées négativement, comme le révèle le potentiel zêta inférieur à 0 V. Une valeur d'environ - 40  mV indiquait également que la suspension aqueuse finale était stable et que les nanoparticules n'avaient pas d'affinité pour l'agglomération.

Distribution des rayons hydrodynamiques des nanoparticules tels que mesurés dans la suspension aqueuse (points) et pris directement à partir d'images MET le long des côtés les plus courts et les plus longs des nanocristaux (voir texte). Les nanoparticules ont été transférées dans une suspension aqueuse par un cornet à ultrasons à haute puissance. La concentration de matière sèche était de 1 mg pour 1 ml d'eau. Une fois la sédimentation terminée, dix mesures de mobilité ont été effectuées pour obtenir un tracé crédible de la mobilité en fonction du diamètre des nanoparticules. Les tailles TEM ont été prises directement à partir des images :le long de c l'axe (côtés les plus longs des cristaux de ZnO) et le long de m et un axes (côtés les plus courts des cristaux)

Évaluation toxicologique in vitro des nanoparticules de ZnO:Fe

Les deux analyses de viabilité cellulaire (XTT et Trypan Blue) ont révélé une diminution de l'absorbance des cellules Caco-2 incubées avec des NP de ZnO:Fe, qui était directement corrélée avec le nombre de cellules viables. Des changements statistiquement significatifs n'ont été observés qu'après 24 heures d'exposition des cellules incubées aux concentrations les plus élevées de NP (1,0 et 0,1 mg/ml), tandis que les niveaux physiologiques de concentration de NP (0,01 et 0,001  mg/ml) n'ont eu aucun effet significatif sur les cultures cellulaires. (Fig. 6 et 7).

Viabilité cellulaire (lignée Caco-2) testée par méthode XTT. Les cellules ont été exposées pendant 24 h à une suspension de NPs ZnO dopées au fer à différentes concentrations comme suit :0,001 mg/ml; 0,01  mg/ml ; 0,1 mg/ml ; et 1 µmg/ml. Les résultats représentent le pourcentage moyen de cellules viables (±SEM) pour les groupes témoins et expérimentaux (n =4). Différence significative de ***i>P ≤ 0,01 vs contrôle a été marqué sur le graphique

Viabilité cellulaire (lignée Caco-2) testée avec coloration au bleu Trypan. Les cellules ont été exposées pendant 24 h à une suspension de NPs ZnO dopées au fer à différentes concentrations comme suit :0,001 mg/ml; 0,01  mg/ml ; 0,1 mg/ml ; et 1 µmg/ml. Les résultats représentent le pourcentage moyen de cellules viables (±SEM) pour les groupes témoins et expérimentaux (n =3). Différence significative de ***i>P ≤ 0,01 vs contrôle a été marqué sur le graphique

Répartition du fer dans le modèle animal

Pour évaluer une accessibilité au fer in vivo à partir des NP de ZnO:Fe, des souris (n =4) suspension reçue par voie orale de ZnO:Fe NP et après 24 h, les animaux ont été scarifiés avec une collecte supplémentaire de tissus cruciaux. L'évaluation quantitative de la teneur en fer dans les tissus examinés a été analysée avec la méthode AAS pour tous les organes collectés et calculée avec le logiciel Micro Image (basé sur la coloration de Perl) pour les tissus du foie, de la rate et du cerveau. Présentées à la figure 8, les données montrent une augmentation de la teneur en fer (par rapport au témoin) dans les tissus du cœur, des muscles squelettiques, de la rate et de l'intestin grêle 24h après l'administration orale de ZnO:Fe NP (pas d'augmentation statistiquement significative). Dans le cas de l'os, le niveau moyen de fer dans le groupe expérimental n'était que légèrement plus élevé que dans le résultat témoin. La teneur en fer dans les tissus hépatiques et cérébraux était élevée et significativement augmentée (P ≤ 0,01) 24 h après l'IG des NP de ZnO:Fe, par rapport au groupe témoin (Fig. 8). Dans les reins, les tissus adipeux viscéraux et sous-cutanés et les poumons, les niveaux de Fe ont chuté 24h après l'administration de ZnO:Fe NP.

Distribution du fer dans les tissus analysés 24h après l'administration IG de ZnO:Fe NPs. Les données représentent un pourcentage moyen de Fe dans les organes testés du groupe expérimental (n = 4) par rapport au groupe témoin (100 %—ligne horizontale). La teneur en fer a été analysée avec AAS. Différence significative de ***i>P ≤ 0,01 vs contrôle

L'évaluation de la teneur en fer colorée avec la méthode de Perl dans le foie a révélé un (P ≤ 0,001) a augmenté le niveau de Fe chez tous les animaux expérimentaux par rapport aux animaux témoins (Fig. 9b). De même, les résultats obtenus pour la pulpe rouge du tissu splénique ont montré un (P ≤ 0,001) augmentation de la teneur en fer chez tous les animaux expérimentaux vs témoins (Fig. 10b). Les données obtenues à partir de l'analyse du tissu cérébral n'ont indiqué aucune augmentation de Fe dans le groupe expérimental 24h après l'IG des NP de ZnO:Fe (Fig. 11b).

Teneur en fer dans le foie calculée avec le logiciel de coloration Perl et MicroImage. Résultats calculés sous forme de rapport entre la surface et l'intensité des taches positives pour le fer et la surface des noyaux cellulaires. Données présentées sous forme de résultat moyen (± SEM) pour chaque animal examiné (a ) et comme valeur moyenne (±SEM) pour les groupes de contrôle et expérimentaux (b ). Différence significative de *P 0,05, ***i>P 0,01 et ****P 0,001

Teneur en fer dans la pulpe rouge de la rate calculée avec le logiciel de coloration Perl et MicroImage. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ). Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ). The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens

Discussion

As was mentioned in the “Introduction” section, the iron deficiency is a considerable nutritional disorder in human population, as well as in other mammalian species [3, 7, 8]. Consequently, an implementation of new, more efficient and safe iron supplementation strategy seems to be highly desirable. Currently presented results come from preliminary studies aimed at further, detailed investigations related with potential usage of biodegradable ZnO NPs doped with Fe as a novel strategy for iron supplementation. As was confirmed previously, in-house manufactured zinc-based NPs undergo very efficient absorption after their oral administration with further, rapid distribution to major organs and tissues in the living organism [22,23,24]. Moreover, we reported that these nanostructures demonstrated bio-safety and biodegradability within the body along with fast clearance from the organism [36]. Employed in the current study, the oral way of NP administration provides a highly efficient way of fast delivery of the exogenous nanostructures to the body, based on persorption process [37, 38]. Furthermore, this strategy decreases chance of eventual toxic effects related with administration of iron-doped substances, because of the existence physiological “security mechanisms” related to both Zn and Fe absorption from the gastrointestinal tract. This crucial, physiological pathways of iron distribution may be avoided in case of intravenous/intramuscular application iron-doped substances [14], which can result in increased possibility of occurrence iron-related toxic side effects. The examination of the internalization pathways of the nanoparticles, their dynamics, and cellular systems involved in the process is being currently studied in the frame of other publication. In the current paper, we decided to show overall effect of our nanoparticles on living organism, focusing on the effect of iron.

Toxicity of nanostructures may be related with various features of material, not only with chemical composition, but also with e.g. size, shape, or their ability to aggregate [39]. Nevertheless, it was confirmed that smaller NPs were better absorbed than bigger one and high surface-to-volume ratio makes the particles of some metals exceptionally reactive and cytotoxic [40, 41]. Nanostructures were able to enter cells and affect their components, which altered the viability of cells [42, 43]. In one of the previous investigations on cytotoxicity of ZnO or FeO NPs, authors did not observe toxic effects (based on ability of examined cells to grow and divide), even in high doses of NPs [44]. Presented here is a study performed on Caco-2 cell line, as a model of epithelial cells of the gastrointestinal tract, revealing a low toxicity of used nanomaterials. ZnO:Fe NPs in small/physiological doses (0.001 mg/ml and 0.001 mg/ml) did not alter the viability of cells (Figs. 6 and 7). Following the incubation of Caco-2 cells with high doses of ZnO:Fe NPs, a statistically significant decrease of viability was observed. However, IC50 (the half maximal inhibitory concentration), as a measure of the effectiveness of a substance in inhibiting a specific biological or biochemical function, still remained surprisingly high—around 1 mg/ml (Figs. 6 and 7). Observed drop of cell viability was probably associated with the physical deposition of nanoparticles on the surface and overstress of the cells rather than the cytotoxic effect related to the nanoparticles themselves. In another study, authors concluded decrease IC50 of cells from cancer cell line following incubation with ZnO and ZnO:Fe3O4 NPs and relatively low cytotoxicity effect (and non-dose-depended) of examined NPs on noncancerous cells [45]. Similar observations were also reported for ZnO and platinum NPs [46, 47]. Nevertheless, further examinations on chronic toxicity profile of such composites including antioxidant activity profiling, production of reactive oxygen species (ROS), and using another cells and cell line must be performed.

Obtained in the in vivo experiment, results indicated a rapid distribution of ZnO:Fe NPs to tissues mostly related with iron homeostasis (Figs. 8, 9, and 10). Similar studies, concerning the bioavailability of iron from “nano” form, were mostly performed on anemic animals or examined following the iron depletion period [18, 19, 48], where our preliminary studies were carried out on healthy, normally maintained mice. Comparison of data presented in the current work with similar studies may be misleading because of differences in employed NPs e.g. their size, shape and compound or route, dose, and frequency of their administration to animals. Results of iron level in the liver showed significantly increased level at 24 h after application of ZnO:Fe NPs, comparing with control (Figs. 8 and 9). Iron accumulation was visible in hepatocytes of liver tissue (Fig. 12), where the major storage site of the element takes place [49]. Similarly, previous studies with intraperitoneally injected iron oxide, magnetic NPs to rats also resulted in 55% accumulation of these nanomaterials in the liver at 6 h following injection [50]. Likewise, the spleen level of iron in the current study was clearly higher in experimental group, than within control (Figs. 8 and 10). Interestingly, tendency of iron accumulation was detected around blood vessels within the spleen, which might indicate the transfer of ZnO:Fe NPs from general bloodstream into the tissue (Fig. 13b, d). Primary accumulation of nanostructures within the liver and spleen after their application might also be attributed with clearance via mononuclear phagocytes in these tissues, as was also postulated previously [50,51,52].

In case of brain tissue, the measurement of total iron level (AAS method) showed significantly higher level of the element in animals with previously administered ZnO:Fe NPs (Fig. 8), which was not confirmed by analysis based on Perl’s staining (Fig. 11). Inconsistency between both, employed in the study methods, may be related with sensitivity of Perl’s staining. This histological method of iron visualization is dedicated to detect iron aggregates. Iron contained in the “nano” form, additionally distributed within the tissue without physiological deposits of these elements, might not be sensitive enough to stain these extremely small deposits of iron. Possibility of overcoming the blood-brain barrier with manufactured by us nanostructures was already described [23, 24, 53]. In another study, with intraperitoneally administered superparamagnetic maghemite iron oxide NPs to mice, no accumulation of iron in experimental group was detected, nor within brain or heart tissues, which is inconsistent with our results [52]. Another study, focused on a distribution pattern of iron oxide magnetic NPs within living organism, indicated similar circulation mechanism of nanostructures as in our study—increased level of Fe within the brain and heart after administration of NPs [51]. Increased level of iron in heart tissue may be caused by presence of ZnO:Fe NPs in the general blood stream and consequently its higher level within the tissue. Likewise, higher level of iron within a skeletal muscle detected in AAS analyses is probably related with intensive blood circulation within this muscle and in case of small intestine, the improved content of iron is caused by residues of orally administered NPs.

Conclusions

In conclusion, we performed the preliminary study on the distribution of biodegradable ZnO:Fe NPs as a perspective, new supplementation strategy in iron deficiency. Deposition of iron in the body of mice following oral administration of the nanostructures was detected within the crucial tissues, where the major storage site of the element takes place. We assumed that obtained in the study results might indicate the biodegradable ZnO:Fe NPs as a good carriers of exogenous iron in the living body. However, further research is needed to completely understand the exact mechanisms of the deposition, elimination, and influence of ZnO:Fe NPs on the body.

Disponibilité des données et des matériaux

The conclusions of the following study are based on the data presented in this manuscript.

Abréviations

NPs:

Nanoparticules

ZnO:Fe NPs:

Zinc oxide nanoparticles doped with iron

IG:

Intra-gastric

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SEM :

Microscopie électronique à balayage

PL :

Photoluminescence spectroscopy

CL:

Cathodoluminescence spectroscopy

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

Caco-2 cells:

Caucasian colon adenocarcinoma cells

DMEM :

Dulbecco’s modification of Eagle’s medium

FBS:

Fetal bovine serum

NEAA:

Non-essential amino acids

PSN:

Penicillin–streptomycin–neomycin

EDTA :

Acide éthylènediaminetétraacétique

AAS:

Atomic absorption spectrometry

SEM (in statistical analysis):

Standard error of the mean