Combinaison à base de nanoparticules de silice mésoporeuse de l'inhibiteur NQO1 et du 5-fluorouracile pour un effet antitumoral puissant contre le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC)

Introduction

Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (HNSCC) sont l'une des formes de cancer les plus mortelles et 90 % de son origine provient de cellules squameuses [1]. Le HNSCC est de nature hautement angiogénique et son système vasculaire exprime diverses cytokines, notamment les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) et les facteurs de croissance endothéliaux vasculaires (VEGF) qui sont liés à des métastases plus importantes et à une faible survie [2]. L'incidence du HNSCC en Chine est la sixième parmi les décès liés au cancer avec environ 250 000 nouveaux cas enregistrés en 2015 et 77 500 cas de décès. Le taux de survie global à 5 ​​ans du HNSCC est très faible en raison de facteurs tels que la nature agressive, la rechute précoce, les métastases élevées et le taux de mortalité élevé en raison d'un mauvais pronostic [3]. La principale option de traitement dans le HNSCC est une intervention chirurgicale suivie d'une radiothérapie ou d'une chimiothérapie. Pour être précis, la chimiothérapie, si elle est utilisée efficacement à des stades précoces ou post-opératoires, contrecarrerait la croissance tumorale [4, 5]. L'utilisation efficace de la chimiothérapie éradiquera les cellules cancéreuses dans les tissus tumoraux et inhibera la rechute tumorale. Cependant, la chimiothérapie à long terme basée sur un agent unique entraîne souvent une résistance aux médicaments et une efficacité thérapeutique réduite [6]. Par conséquent, il est nécessaire d'employer des stratégies innovantes pour améliorer la survie et la qualité de vie des patients HNSCC.

Plusieurs agents anticancéreux utilisés dans le traitement du HNSCC comprennent le cisplatine, le 5-fluorouracile (5-FU), le paclitaxel ou le docétaxel. Parmi tous, le 5-fluorouracile (5-FU) est utilisé comme traitement de première intention dans le HNSCC et d'autres traitements du carcinome épidermoïde [7]. Le 5-FU est un analogue de la pyrimidine qui agit en inhibant de manière irréversible la thymidylate synthase dans les cellules cancéreuses et supprime ainsi la réplication de l'ADN entraînant la mort cellulaire [8]. Comme avec tous les médicaments anticancéreux, le 5-FU n'est pas sans effet indésirable dans la circulation systémique et provoque une toxicité pour les tissus normaux, alors qu'il est rapporté que l'association du 5-FU avec un agent secondaire pourrait potentiellement réduire les effets secondaires et améliorer la efficacité thérapeutique globale dans le traitement du cancer [9].

La NAD(P)H:quinone oxydoréductase 1 (NQO1) est une flavoprotéine qui est élevée dans les tissus tumoraux de 100 à 200 fois par rapport à celle des tissus normaux [10]. L'oxydoréductase à deux électrons est une enzyme détoxifiante de phase II inductible capable de détoxifier les quinones en formant des hydroquinones stables [11]. NQO1 s'exprime à un faible niveau basal dans les tissus humains normaux où il protège les cellules contre le cycle redox et le stress oxydatif et stabilise le suppresseur de p53. NQO1 est constitutivement surexprimé dans plusieurs cancers, notamment les carcinomes du sein, du pancréas et des cellules squameuses [12]. La surexpression de NQO1 favorise la progression du fardeau du cancer et rend les cellules cancéreuses plus résistantes aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le 5-FU ou le cisplatine (inducteurs de stress oxydatif) faisant de NQO1 une oncocible potentielle pour améliorer l'efficacité thérapeutique [13]. Il a été rapporté que le knockdown de NQO1 par siRNA augmentait l'effet cytotoxique de plusieurs médicaments comme la gemcitabine ou la doxorubicine [14]. Par ailleurs, plusieurs inhibiteurs synthétiques et naturels de NQO1 sont rapportés tels que les coumarines ou les curcumines ou l'ES936 [15,16,17]. Dans cette étude, nous avons utilisé la ß-lapachone (ß-lap, 3,4-Dihydro-2,2-dimethyl-2H-naphto [1,2-b]pyran-5,6-dione) comme inhibiteur de NQO1 [ 18]. ß-lap agit par le biais d'un mécanisme dépendant de NQO1 et crée une quantité importante d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui endommageront les brins d'ADN et entraîneront la mort des cellules cancéreuses [19].

L'utilisation de nanoparticules pour l'administration systémique de petites molécules devient une approche prometteuse dans le traitement du cancer [20]. Les nanoparticules chargées de médicaments nécessitent moins de schéma posologique et ont montré qu'elles améliorent l'efficacité anticancéreuse et réduisent relativement les effets indésirables. Parmi tous les supports, la nanoparticule de silice mésoporeuse (MSN) détient un potentiel important pour délivrer efficacement la charge utile aux tissus tumoraux [21, 22]. Les pores de la taille d'un micromètre permettent le chargement stable des médicaments et empêchent sa libération dans la circulation systémique et permettent l'accumulation préférentielle dans les tissus cancéreux qui fuient en utilisant l'effet de perméation et de rétention (EPR) amélioré [23].

Dans l'ensemble, l'objectif principal de la présente étude était de combiner les avantages thérapeutiques du 5-FU et de l'inhibiteur de NQO1 pour améliorer l'effet anticancéreux dans le HNSCC. L'effet anticancéreux in vitro a été analysé à l'aide de diverses techniques telles que la viabilité cellulaire, l'analyse par transfert Western, le cytomètre en flux/le test d'apoptose basé sur Hoechst et le test vivant/mort. Des études in vivo ont été réalisées sur le modèle de xénogreffe portant des cellules tumorales Cal33.

Conclusion

En résumé, nous avons formulé avec succès des nanoparticules de silice mésoporeuse enrobées de bicouche lipidique chargées de 5-FU + ß. Nous avons montré que (i) l'effet antitumoral de ß-lap d'une manière dépendante de la concentration dans les cellules tumorales HNSCC, (ii) la combinaison de 5-FU + ß-lap entraîne une inhibition significative de la protéine NQO1 et de la protéine Bcl-2, ( iii) la combinaison FNQ-MSN a démontré une réduction significative de la charge tumorale dans la xénogreffe HNSCC. Ces données indiquent sans équivoque qu'une dose sublétale d'inhibiteur de NQO1 (ß-lap) pourrait potentiellement améliorer l'efficacité thérapeutique du 5-FU dans les tumeurs HNSCC et pourrait potentiellement être étendue au traitement clinique d'autres tumeurs malignes.

Matériaux et méthodes

Préparation de nanoparticules de silice mésoporeuse-bicouche lipidique chargées de 5-FU/ß-lap

Le MSN chargé de médicament a été préparé en dissolvant du bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) (210 mg) dans 180 ml d'eau et bouilli à 80 °C, suivi de 5-FU et ß-lap ont été ajoutés 20% w/w de nanoparticules totales et puis du fluorure d'ammonium (NH4F) (30 mg) a été ajouté et bien agité pendant 60 min. Ensuite, 1,6 ml d'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS) ont été ajoutés goutte à goutte pendant 30 min et agités en continu pendant 3 h. Des colloïdes blancs semi-transparents se sont formés et ont été collectés après centrifugation (15 min) à 10000 rpm à 24 ± 1 °C. Les MSN ont été remis en suspension dans de l'eau ultrapure et le cycle de centrifugation a été répété 2 fois. Séparément, une membrane à couche mince a été préparée à l'aide de DSPE-PEG2000 (2% du poids total de MSN) et hydratée avec de l'eau en suspension avec du MSN chargé de médicament. Le mélange a été immédiatement soniqué à la sonde pendant 5 min à 50 W à température ambiante (25 °C). La bicouche lipidique pégylée supportée par le MSN a finalement été lavée deux fois et remise en suspension dans de l'eau ultrapure.

Taille des particules, analyse du potentiel zêta et analyse de la morphologie

Le diamètre des particules, l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta ont été évalués à l'aide de Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). Les particules ont été analysées à l'aide d'un mécanisme de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et les dispersions de particules ont été bien diluées avant l'expérience. Toutes les expériences ont été réalisées en triple à température ambiante. La morphologie des nanoparticules a été déterminée par microscopie électronique à transmission (MET) en utilisant CM 200 UT, Philips, MA, USA) opéré à 100 kV. Brièvement, les dispersions de particules ont été diluées, une goutte a été placée dans une grille TEM de 300 mesh et laissée à décanter pendant 10 min. Les particules ont été contre-colorées avec de l'acide phosphotungstique (PTA) à 2 % comme coloration négative, séchées à l'air et observées au microscope TEM.

Chargement de médicaments

Une analyse de charge de médicament à deux voies a été effectuée en calculant le médicament déchargé ou non lié dans le surnageant et le médicament chargé dans la nanoparticule. L'efficacité de chargement du médicament a été réalisée par la méthode HPLC. La HPLC était équipée d'une pompe PLC Shimadzu LC-20 AD et d'un détecteur SPD-M20A PDA et du logiciel d'analyse Shimadzu LC contenant une colonne C18 en phase inverse (Phenomenex C18, 150 4,6 mm, 5 μm). La phase mobile pour le 5-FU est constituée d'un mélange d'acétonitrile et d'eau (10:90, v/v) et pompée à un débit de 1 ml/min. La longueur d'onde de détection fixée à 265 nm pour le 5-FU. La phase mobile pour ß-lap est constituée d'acétonitrile/eau (31:69, v/v) et d'une longueur d'onde de détection fixée à 254 nm à 35 °C. La capacité de chargement (LC) et l'efficacité de chargement (LE) de 5-FU/ß-lap ont été calculées en utilisant la formule respective.

Étude sur la libération de médicaments

La libération de 5-FU et de -lap a été évaluée dans du PBS (pH 7,4) et ABS (pH 5,0) à 37 °C en utilisant la méthode de dialyse. En bref, 1 mg d'équivalent de chaque nanoparticule chargée de médicament a été chargé dans une membrane de dialyse dans 1 ml de tampon respectif et les extrémités sont scellées. La membrane de dialyse scellée a été placée dans 25 ml de tampon ABS et PBS respectifs et placée dans un bain-marie agité à 37°C. Des échantillons ont été collectés à un intervalle de temps prédéterminé et remplacés par un volume égal de tampon frais. La quantité de médicament libérée dans le tampon respectif a été évaluée par la méthode HPLC comme décrit dans la section précédente.

Culture cellulaire et test d'activité NAD(P)H:Quinone oxydoréductase 1 (NQO1)

La cellule Cal33 HNSCC a été cultivée dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de FBS et de 1 % de mélange antibiotique. Les cellules ont été maintenues dans des conditions ambiantes dans un incubateur. Pour le test d'activité NQO1, les cellules Cal33 ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité d'ensemencement de 8 × 10 ³ cellules par puits et incubées pendant la nuit. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de -lap et incubées pendant 24 h. 0,8 % de digitonine (50 μl d'EDTA 2 nM) a été utilisée pour lyser les cellules et le dosage a été réalisé en utilisant du ménadiol et du MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) comme la réaction de couplage du substrat et l'activité ont été mesurées à 620  nm. Le dosage a été réalisé en triple.

Test de viabilité cellulaire in vitro

Le test de viabilité cellulaire de ß-lap en concentration croissante et le test de viabilité cellulaire du régime individuel et combinatoire ont été testés par un 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-car boxyméthoxyphényl)-2-(4 dosage du -sulfophényl)-2H-tétrazolium (MTS). En bref, les cellules Cal33 ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité d'ensemencement de 1 × 10 ⁴ cellules par puits et incubées pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec une concentration croissante de -lap, séparément; les cellules ont été traitées avec un régime individuel et combinatoire de 5-FU et de -lap à une concentration de base de 5, 10 et 20 g/ml et incubées pendant 24 h. Les cellules ont été lavées deux fois et traitées avec une solution de MTS conformément aux directives du fabricant. La viabilité cellulaire a été calculée par rapport aux cellules non traitées, et un lecteur de microplaque a été utilisé pour l'absorbance à 460  nm.

Analyse Western Blot

Les cellules ensemencées dans une plaque à 6 puits ont été traitées avec une concentration croissante de -lap, séparément; les cellules ont été traitées avec un régime individuel (5-FU ou -lap) et combinatoire de 5-FU et -lap (FNQ-MSN) et incubées pendant 24h. Les cellules ont été récoltées, lysées (M-par tampon) et centrifugées, et le surnageant contenant la protéine a été collecté. La concentration en protéines dans le lysat cellulaire a été évaluée en utilisant la méthode à l'acide bicinchoninique (BCA). 10 % de gel de polyacrylamide Bis-Tris ont été utilisés pour séparer les protéines et immédiatement transférés sur une membrane en fluorure de polyvinylidène (PVDF). La membrane a été bloquée en utilisant du lait écrémé à 5 % préparé dans un tampon salin Tris n tamponné (TBS) contenant du Tween 20 (TBST, pH 7,2). Les anticorps primaires de NQO1 polyclonal de lapin (1:1000), Bcl-2 monoclonal de souris (1:1000) et GAPDH monoclonal de souris (1:1000) ont été incubés sur membrane pendant une nuit à 4°C. La membrane a été lavée avec du TBST puis incubée avec des anticorps secondaires (IgG anti-souris ou anti-lapin) à une dilution de 1:10000 dilutions. La membrane a été à nouveau lavée avec du TBST et les taches ont été exposées à une solution de substrat ECL et les densités des bandes de protéines ont été évaluées à l'aide d'un photodéveloppeur.

Apoptose et dosage de Hoechst

Les cellules Cal33 ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à une densité d'ensemencement de 2 × 10 ⁵ cellules par puits et incubées pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été traitées avec un régime individuel (5-FU ou -lap) et combinatoire de 5-FU et -lap (FNQ-MSN) et incubées pendant 24h. Les cellules ont été récoltées, lavées, centrifugées et sédimentées. Les cellules ont été traitées avec 2,5 μl d'annexine V et 2,5 μl de PI et incubées pendant 15 min à l'obscurité. Les cellules ont ensuite été complétées à 1 ml et évaluées en utilisant un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS, BD, FACSverse). Au total, 10 000 cellules ont été analysées. Une procédure similaire pour l'ensemencement cellulaire et le traitement médicamenteux a été suivie puis colorée avec le colorant Hoechst 33342 (10 ug/ml) et incubée pendant 10 um. Les cellules ont été lavées et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et lavées à nouveau. La morphologie cellulaire a été observée au microscope à fluorescence (Nikon A1, Japon).

Efficacité antitumorale du FNQ-MSN DANS le modèle de tumeur de xénogreffe HNSCC

Dix-huit à vingt-deux grammes de souris mâles BALB/c âgées en moyenne de 4 à 5 semaines ont été achetées au In-House Animal Facility Center de l'Université de l'industrie légère de Zhengzhou, Henan. Les animaux ont été maintenus dans une pièce climatisée avec un cycle de lumière sombre de 12 h et ont eu libre accès à la nourriture et à l'eau. Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de l'industrie légère de Zhengzhou, Henan. Pour établir un modèle de xénogreffe, 1 × 10 ⁷ Des cellules Cal33 dans 150 μl de milieu de culture ont été inoculées dans la hanche droite de la souris par voie sous-cutanée. Lorsque la taille moyenne de la tumeur atteint 80-100 mm3, les souris ont été réparties au hasard en 5 groupes pour le contrôle, 5-FU, -lap, 5-FU+ß-lap et FNQ-MSN, respectivement avec 8 souris dans chaque groupe . Le 5-FU a été administré à une dose fixe de 5 mg/kg et le -lap à une dose fixe de 25 mg/kg et administré 3 fois avec un intervalle de 3 jours pour chaque injection dans la veine caudale. Le poids des souris et le volume tumoral ont été régulièrement contrôlés pendant 18 jours. Le volume tumoral a été calculé à l'aide de la formule

La présente étude n'a observé aucune mort de souris due à la charge de cellules tumorales et tous les animaux ont été euthanasiés avec du CO₂ puis sacrifié par luxation cervicale vers la fin de l'étude.

Analyse statistique

Plusieurs groupes ont été comparés à l'aide d'une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA). Niveau de signification de p <0,05 a été considéré comme significatif et toutes les données sont présentées sous la forme d'une moyenne ± écart type, à moins que cela ne soit spécifiquement mentionné dans les expériences respectives.

Résultat et discussion

Préparation de nanoparticules de silice mésoporeuse supportées par bicouche lipidique 5-FU/ß-lap-load

Dans cette étude, nous avons personnalisé une nanoparticule de silice mésoporeuse stabilisée par bicouche lipidique PEGylée. Le MSN chargé de 5-FU/ß-lap a été préparé par la méthode de sonication en émulsion, puis le MSN chargé de médicament a été introduit dans le flacon contenant un film mince lipidique constitué de DSPE-PEG2000. Le mélange a été soniqué et le MSN enduit de lipides contenant 5-FU/ß-lap a été obtenu (FNQ-MSN) (Fig. 1a). Les efficacités de chargement (LE) du 5-FU et du -lap étaient respectivement de 91,5 ± 1,65 % et 92,9 ± 1,24 %. Le FNQ-MSN présentait 8,1 ± 1,12 % en poids de 5-FU et 7,6 ± 0,95 % en poids de ß-lap, indiquant la capacité de charge élevée (LC) du support MSN. La présence de bicouche lipidique empêchera sa libération indésirable dans la circulation systémique et empêchera ainsi la toxicité. La taille moyenne des particules du MSN chargé de médicament était de 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089) tandis que l'assemblage de la bicouche lipidique sur la surface du MSN (FNQ-MSN) augmentait la taille moyenne des particules à 128,4 ± 1,24  nm (PDI ~ 0,115) indiquant un présence solide de matières lipidiques à la surface du MSN (Fig. 1b). Le potentiel zêta est passé de − 18,2 ± 1,22 à − 26,4 ± mV. La petite taille des particules de FNQ-MSN permettra l'accumulation préférentielle d'un support chargé de médicament dans les tissus tumoraux qui fuient en raison de l'effet EPR. En outre, la surface PEGylated conférera une excellente stabilité et un temps de circulation sanguine prolongé qui augmenteront encore les chances de FNQ-MSN dans les tissus tumoraux. L'image MET a montré une ressemblance morphologique avec celle du liposome et a présenté une forme sphérique parfaite uniformément répartie sur la grille. L'image MET a clairement montré un noyau externe grisâtre plus tardif et plus sombre indiquant la présence d'un assemblage lipidique sur la surface du MSN (Fig. 1c). La taille observée par MET corrobore avec la taille des particules DLS d'un zetasizer. MSN possède des canaux bien ordonnés pour la distribution homogène des molécules médicamenteuses. La propriété de surface des pores est l'un des facteurs importants dans le chargement stable des petites molécules. Les différentes forces physiques impliquées dans l'interaction hôte-invité comprennent principalement les forces hydrophobes et les forces d'interaction de van der Waals. La capacité de charge de médicament plus élevée fournira une concentration intracellulaire plus élevée et une efficacité de destruction plus élevée dans les sites tumoraux. Le FNQ-MSN présentait une excellente stabilité dans le milieu PBS et la taille des particules est restée inchangée tout au long de la période d'étude jusqu'à 30 jours. Une telle stabilité améliorée du système de support et une capacité de charge élevée du système de support amélioreront la biodistribution et l'efficacité dans le traitement des tumeurs.

un Présentation schématique de la construction de nanoparticules de silice mésoporeuse enrobées de bicouche lipidique chargées en 5-FU et ß-lap. Deux médicaments sont chargés dans les pores du MSN qui ont été davantage stabilisés par l'assemblage de la bicouche lipidique pégylée sur la surface externe du MSN. b Distribution granulométrique de FNQ-MSN. c Image TEM de FNQ-MSN avec un encart de grossissements plus élevés

Libération de médicament in vitro

La libération de médicament in vitro de 5-FU et -lap de FNQ-MSN a été étudiée dans PBS et ABS (Fig. 2). Comme indiqué, deux tendances de rejet différentes ont été observées à pH 7,4 et pH 5,0. Par exemple, 25 % du 5-FU libéré en 24  h à pH 7,4 contre ~ 40 % de libération de médicament à pH 5,0 en 24 h. De même, 20 % et 30 % de -lap ont été libérés à pH 7,4 et pH 5,0, respectivement. La cinétique de libération était identique tout au long de la période d'étude avec 50 % de 5-FU libéré dans un tampon alcalin et 80 % de libération de médicament à pH 5,0 après 72 h de période d'étude. Une libération de médicament sensible au pH dans des conditions acides est avantageuse pour le traitement du cancer. Aucun phénomène de libération en rafale n'a été observé dans les deux conditions de pH, principalement attribué à la présence de la couche DSPE-PEG qui contrôlait la libération du médicament à partir du FNQ-MSN tout au long de la période d'étude. Une différence significative dans la libération du médicament a été observée entre des conditions de pH 7,4 et de pH 5,0. Aux conditions de pH 7,4, PEG-b -DSPE présente une propriété de couche furtive élevée empêchant ainsi la libération du composé encapsulé. Le présent résultat a montré que la libération du médicament s'accélérait à pH 5,0, indiquant le démontage de la coque protectrice autour de la surface du MSN. Le taux de libération du médicament sensible au pH, qui garantit une libération maximale du médicament dans les cellules cancéreuses, peut améliorer l'efficacité antitumorale et diminuer la toxicité indésirable pour les tissus normaux. Il est possible qu'en présence d'un élément sensible au pH, le FNQ-MSN entraîne la perte de la bicouche lipidique sur le MSN, entraînant une libération accrue dans des conditions de pH inférieur.

Libération in vitro de 5-FU et de -lap à partir de FNQ-MSN dans des conditions de tampon pH 7,4 et pH 5,0. L'étude de libération a été poursuivie jusqu'à 72 h et la libération de médicament a été quantifiée à l'aide de la méthode HPLC. **p <0.01

Sensibilité de NQO1 à ß-lap

Comme la régulation positive de NQO1 dans de nombreuses cellules cancéreuses, y compris HNSCC, est associée à un mauvais pronostic et à de mauvais résultats thérapeutiques, les médicaments ciblant NQO1 pourraient être une stratégie potentielle pour le traitement du cancer [24]. NQO1 est surexprimé dans le niveau allant de 100 à 200 fois dans le carcinome épidermoïde par rapport à celui associé aux tissus normaux. Par conséquent, l'influence de -lap sur l'activité enzymatique NQO1 a été étudiée dans les cellules Cal33. Comme montré, ß-lap a montré une inhibition dépendante de la concentration de l'activité enzymatique NQO1 dans les cellules Cal33 (Fig. 3a). Notamment, un effet inhibiteur significatif a été observé à une dose de 20 à 50  μg/ml de -lap. En outre, le potentiel inhibiteur de -lap sur la protéine NQO1 a été étudié plus en détail par analyse de transfert de Western (Fig. 3b). Les résultats ont clairement révélé la diminution significative de la protéine NQO1 dans les cellules cancéreuses avec une augmentation de la concentration de -lap. Environ 80 % d'inhibition de NQO1 observée à 100 µg/ml de -lap. Le médicament bioactivable NQO1 tel que ß-lap est métabolisé par NQO1 et forme un composé hydroquinone instable qui se reconvertit immédiatement en composant d'origine laissant 2 oxydations à un électron et consomme 2 O ²⁻ . Cela créera un cycle redox futile dans lequel 1 molécule de -lap générera 130 moles de superoxyde au prix de la consommation de 60 à 70 moles de NAD(P)H6. Les radicaux superoxyde (O2.-) ainsi formés seront convertis en peroxyde d'hydrogène (H2O2-) et provoqueront l'apoptose et la mort cellulaires [25].

un Effet de l'activité concentration-dépendante de ß-lap sur l'activité NQO1 des cellules cancéreuses Cal33 par la méthode enzymatique. b Effet de l'activité dépendant de la concentration de -lap sur les niveaux de protéine NQO1 par analyse western blot utilisant GAPDH comme protéine d'entretien

Effet anticancéreux in vitro de FNQ-MSN dans les cellules HNSCC

L'effet anticancéreux in vitro de -lap dans la cellule Cal33 a été étudié par dosage MTT. Les résultats ont révélé que ß-lap présentait une diminution typique de la viabilité cellulaire dépendante de la concentration (Fig. 4a). Notamment, une diminution significative de la viabilité cellulaire a été observée à une concentration de 50 µg/ml. Pour d'autres expériences, 20 g/ml ont été sélectionnés (en dessous de la valeur IC50 de -lap). Ensuite, l'effet de potentialisation du -lap sur le 5-FU a été étudié à 3 concentrations différentes (5, 10 et 20  μg/ml). Comme indiqué, la combinaison de 5-FU + ß-lap a entraîné une viabilité cellulaire inférieure; plus particulièrement, FNQ-MSN présentait une viabilité cellulaire significativement plus faible par rapport à celle de l'un des médicaments individuels ou des combinaisons physiques (Fig. 4b). Par exemple, le 5-FU et le -lap ont montré une viabilité cellulaire de 35,7 % et 70,2 % tandis que le 5-FU+ß-lap a montré 26,5 % et le FNQ-MSN a montré 13,1 %, respectivement. Les résultats ont clairement montré que l'effet cytotoxique du 5-FU était significativement augmenté lorsqu'il était combiné avec le -lap. Il convient de noter que le FNQ-MSN était plus efficace que celui du 5-FU + ß-lap attribué à la meilleure internalisation et à la libération contrôlée des agents thérapeutiques chargés du système porteur. Les résultats révèlent clairement l'effet inhibiteur de ß-lap sur l'activité enzymatique NQO1 et les niveaux de protéines et ont potentialisé l'effet anticancéreux du 5-FU et se traduisent par une amélioration des résultats thérapeutiques dans le traitement du HNSCC.

un Effet de l'activité dépendante de la concentration de -lap sur la viabilité cellulaire des cellules Cal33. b Effet cytotoxique de l'individu et de l'association avec un deuxième agent chimiothérapeutique, le 5-FU à 3 concentrations différentes de 5 à 20  μg/ml, respectivement. La viabilité cellulaire a été évaluée par dosage MTT après 24h d'incubation. c Analyse par transfert Western de l'expression des protéines NQO1 et Bcl-2 après traitement avec un individu et une combinaison de 5-FU et -lap

Rôle FNQ-MSN dans les voies de signalisation :analyse Western Blot

Le mécanisme de l'effet cytotoxique médié par -lap a été exploré plus avant par une analyse par transfert de Western. Comme indiqué, ß-lap a entraîné une diminution de la bande protéique de NQO1 par rapport au contrôle ; cependant, la diminution la plus notable du niveau de NQO1 a été observée dans le groupe cellulaire traité par FNQ-MSN (Fig. 4c). L'amélioration induite par ß-lap de la chimiosensibilité de Cal33 en améliorant l'apoptose cellulaire a été évaluée par le niveau de protéine Bcl-2. La famille Bcl-2 joue un rôle important dans la régulation de l'homéostasie cellulaire et contrôle la prolifération et la mort des cellules cancéreuses. Le processus de diminution de Bcl-2 et d'augmentation de Bax entraîne la libération du cytochrome C dans le cytosol qui initiera toute la cascade des caspases entraînant la mort cellulaire [26]. Les résultats ont clairement mis en évidence que la combinaison de 5-FU et de -lap (FNQ-MSN) a considérablement diminué le Bcl-2 indiquant l'effet anticancéreux accru dans les cellules cancéreuses Cal33.

Analyse de l'apoptose du HNSCC

Après l'analyse de la viabilité cellulaire, l'effet d'apoptose du médicament individuel et combiné sur les cellules Cal33 a été évalué par cytomètre en flux après coloration à l'annexine V/PI (Fig. 5). L'effet d'apoptose du 5-FU individuel (10 µg/ml) ou du -lap (30 µg/ml) n'a entraîné aucune apoptose appréciable des cellules cancéreuses; cependant, le 5-FU+ß-lap a entraîné une augmentation spectaculaire de la proportion d'apoptose des cellules cancéreuses. Il est important de noter que le FNQ-MSN a entraîné plus de 60 % d'apoptose cellulaire (apoptose précoce et tardive), ce qui signifie l'effet thérapeutique supérieur du régime combiné à base de porteurs. L'effet d'apoptose a été confirmé par la coloration Hoechst 33342. Comme indiqué, les cellules traitées avec FNQ-MSN entraînent une plus grande quantité de cellules subissant des caractéristiques d'apoptose, de condensation nucléaire et de fragmentation par rapport à celle du 5-FU ou du -lap seul (Fig. 6). Au cours du processus d'apoptose, les cellules rétrécissent sans être endommagées dans la membrane cellulaire externe et entraînent une condensation de la chromatine avec une formation accrue de corps apoptotique.

Analyse par cytomètre de flux de cellules Cal33 en utilisant une double coloration de l'annexine V et PI après traitement avec un individu et une combinaison de 5-FU et -lap. 10 000 événements ont été enregistrés dans le cytomètre en flux

Analyse de la morphologie nucléaire des cellules Cal33 après coloration avec Hoechst 33342 ; les cellules ont été traitées avec un individu et une combinaison de 5-FU et de -lap. 10 000 événements ont été enregistrés dans le cytomètre en flux

Live/Dead Assay

The anticancer effect of individual and combined drug was further evaluated by the Live/Dead assay. The treated cells were subjected to Calcein AM and ethidium bromide staining as a respective marker of live and dead cells (Fig. 7). As shown, untreated cells are stained with 100% of green fluorescence. The individual drugs, 5-FU (10 μg/ml) or ß-lap (30 μg/ml) though showed slight red fluorescence stained cells; however, predominant cells exhibited green fluorescence indicating limited cell death. Remarkable cell death was observed in FNQ-MSN-treated cancer cells as shown by predominant red fluorescence and fewer green fluorescence stained cells. The higher anticancer effect of FNQ-MSN was attributed to the synergistic activity of 5-FU and ß-lap in the cancer cells and the ability of ß-lap to increase the chemosensitivity of 5-FU.

Live/dead analysis of Cal33 cells using double staining of Calcein AM and ethidium bromide after treatment with individual and combination of 5-FU and ß-lap

In Vivo Antitumor Efficacy of FNQ-MSN Against HNSCC Xenograft Model

To further evaluate the efficacy of combinational regimen in an animal model, HNSCC xenograft was prepared and administered with 5 mg/kg of 5-FU and 10 mg/kg of ß-lap, respectively. The pharmaceutical grade of ß-lap is ARQ761 which is presently in phase I clinical trial for the treatment of metastatic malignancies. ß-lap has set the limit for the maximum tolerable dose in humans as per the preclinical studies [27]. Keeping this in mind, we have optimally selected a dose of 10 mg/kg of ß-lap for the in vivo studies. As shown, no significant decrease in tumor volume was observed with individually administered 5-FU and ß-lap compared with that of non-treated control (Fig. 8a). Notable decrease in tumor volume was observed with a physical mixture of 5-FU+ß-lap; however, combined treatment of carrier-based 5-FU and ß-lap (FNQ-MSN) significantly delayed the tumor growth and prolonged the survival of tumor-bearing xenograft mice. The tumor volume graph of FNQ-MSN could be divided into two parts; insignificant growth in tumor volume was observed until day 9 while tumor significantly increased after day 9 until day 18, nevertheless, overall tumor volume was manifold smaller compared with that of control or other groups. The toxicity concern of the individual and combinational regimen was evaluated in terms of body weight (Fig. 8b). As shown, physical mixture of 5-FU+ß-lap resulted in severe toxicity as represented by more than 10% loss in body weight while 5-FU resulted in 5% of body weight. As expected, FNQ-MSN did not result in any loss of body weight indicating the unique advantage of the lipid-MSN-based carrier system. The enhanced antitumor effect of FNQ-MSN was attributed to the inhibitory effect of ß-lap towards the NQO1 enzyme and protein which in turn increased the chemosensitivity of 5-FU and resulted in synergistic anticancer effect in the Cal33 human tumors, second, lipid bilayer–coated MSN protected the drug during the systemic circulation and might release in a controlled manner in the tumor tissue, third, PEGylation of nanocarrier might prolonged the blood circulation time allowing for the preferential accumulation in the tumor tissues owing to EPR effect [28, 29]. PEGylated MSN were mainly trapped in RES of the liver, spleen, and lung, accounting for over 80% of the administered dose. PEG modification of MSN obviously decreased the clearance rate of MSN in organs, demonstrating that the PEGylated NPs were more difficult to be removed from the RES organs regardless of the particle shape [30, 31]. Overall, in vivo study on HNSCC model offer a “proof of concept” that effective combination of 5-FU+ß-lap in stable nanocarrier might enhance the therapeutic efficacy in tumor while alleviating the associated toxic effect.

un In vivo antitumor efficacy of FNQ-MSN in HNSCC xenograft model. The mice bearing HNSCC tumors were treated with 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap and FNQ-MSN at a fixed dose of 5 mg/kg of 5-FU and 10 mg/kg of ß-lap intravenously for 3 times. Tumor volume was noted as a part of efficacy analysis and compared with non-treated control. b Body weight analysis corresponding to tumor volume data. *p <0.05 and ***p <0.001

Disponibilité des données et des matériaux

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Abréviations

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

FNQ-MSN:

5-FU/ß-lap-loaded mesoporous silica nanoparticles

HNSCC:

Head and neck squamous cell carcinomas

MSN:

Mesoporous silica nanoparticle

NQO1:

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1

ß-lap:

ß-lapachone