Nanogels de gélatine/silice-aptamère sensibles à la rédox pour la distribution ciblée d'ARNsi

Introduction

L'interférence ARN (ARNi) est un silençage spécifique à une séquence de gènes et est également actuellement en cours d'évaluation comme méthode la plus prometteuse dans le traitement d'un large éventail de maladies, notamment les troubles génétiques, les cancers et les maladies infectieuses, en raison de sa spécificité élevée et de sa faible toxicité. [1]. Les petits ARN interférents (siARN) avec des molécules d'ARN double brin sont plus résistants à la dégradation par la nucléase que les oligonucléotides antisens et présentent donc des avantages par rapport à la thérapie antisens. L'incorporation de nucléotides modifiés chimiquement dans les siARN a été utilisée pour augmenter ou diminuer l'efficacité et la durée de l'ARNi. Il a été prouvé que le remplacement des ribonucléotides du brin sens par des désoxynucléotides pouvait augmenter la stabilité du brin sens et maintenir une efficacité 40 % de l'ARNi [2, 3]. Cependant, la livraison de siARN spécifique aux tissus reste un obstacle majeur pour ses applications malgré les grandes puissances de knockdown de gènes observées dans les études in vitro [4, 5].

La livraison à base de nanoparticules présente des avantages potentiels dans la stabilisation efficace des siARN et une modification supplémentaire pour la livraison spécifique au site [6,7,8]. La livraison productive dirigée vers le site de siRNA peut améliorer la transfection et réduire les effets hors cible, qui sont requis par la plupart des applications pratiques [9]. La nucléoline est associée à divers processus biologiques et sauvagement exprimée dans le noyau et le cytoplasme de diverses cellules normales. De plus, la nucléoline est fortement exprimée sur les membranes plasmiques des cellules cancéreuses en prolifération active par rapport à leurs homologues normales et est donc utilisée comme cible attrayante pour les traitements antinéoplasiques. L'aptamère AS1411 (également connu sous le nom d'AGRO100), un aptamère d'ADN du quatuor G, peut se lier fortement à la nucléoline de surface cellulaire et bloquer la voie anti-apoptotique dans les cellules cancéreuses en se combinant avec le modulateur essentiel du facteur nucléaire-kB, qui a atteint les essais cliniques de phase II en tant que premier aptamère d'acide nucléique pour le traitement du cancer chez l'homme [10, 11]. Jusqu'à présent, AS1411 a été conjugué avec succès à diverses nanoparticules et les a internalisées dans des cellules cancéreuses [12,13,14,15]. La gélatine a été utilisée pour l'encapsulation d'ARNsi en raison de ses excellentes propriétés de biocompatibilité, de biodégradabilité et de gélification [16,17,18]. Notre groupe a exploré une série de nanogels de gélatine réticulée au siloxane (GS NG) avec une taille et une charge de surface contrôlées, démontrant l'efficacité de transfection des GS NG in vitro et in vivo [19, 20].

Outre les barrières intracellulaires, les barrières intracellulaires après l'internalisation, y compris le désassemblage efficace des siARN et l'échappement endosomal, restent également difficiles. La conjugaison d'ARNsi à un transporteur par des liaisons labiles ou non labiles est une méthode prometteuse pour surmonter ce défi de livraison. La libération sensible aux stimuli sous pH acide et potentiel redox a suscité un grand intérêt. La réticulation disulfure présente un grand potentiel dans une explosion de libération de médicament via des liaisons clivées dans les cellules tumorales en raison d'un niveau plus élevé de glutathion (GSH) dans l'environnement extracellulaire [21, 22]. Il a été rapporté que les conjugués poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA)/ARNsi formés via une liaison disulfure présentent une efficacité d'encapsulation et d'administration améliorée [23].

Dans ce travail, des nanogels hybrides basés sur GS avec une double fonction de réactivité redox de la conjugaison disulfure et de ciblage tumoral spécifique de l'aptamère AS1411 ont été explorés en tant que porteur de siRNA pour la thérapie contre le cancer (Schéma 1). Nous visons à déterminer si les GS NG fonctionnels d'AS1411 amélioreraient l'internalisation cellulaire efficace et permettraient d'inhiber le gène spécifique à la tumeur du gène modèle de la luciférase in vitro. En outre, la sécurité de ce système a également été évaluée in vitro.

Un Apt-GS NG réactif à l'oxydoréduction et ciblant les tumeurs a été développé pour l'administration d'ARNsi avec conjugaison disulfure et aptamère AS1411

Méthodes

Matériaux

La gélatine (numéro de floraison :240-270, pH 4,5-5,5) a été achetée auprès de BBI Company Inc. (USA). N -succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP), 3-glycidoxypropyl-triméthoxysilane (GPSM) et 3-aminopropyl-triméthoxysilane (APTMS) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Co. (USA). Le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazolyl-2)-2, 5-diphényltétrazolium (MTT) a été acheté chez Amresco Co. (USA). Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal, la pénicilline et la streptomycine ont été obtenus auprès de Hyclone Co. (USA). L'aptamère AS1411, l'AS1411 marqué au 5'-FAM et l'ADN témoin négatif (TDO) ont été synthétisés par Sangon Biotech Co. (Chine). Brin sens thiol du Luc-siRNA, 5′-SH-(CH₂ )₆ -CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3′ (désoxynucléotides remplaçant les ribonucléotides) et le brin antisens, 3′-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5′, et le brin antisens marqué FAM à l'extrémité 3′ ont été synthétisés et purifiés par HPLC par Gene Pharma Co. ( Chine). La lipofectamine 2000, le plasmide de luciférase pGL3 et le système de dosage de luciférase ont été achetés auprès de Promega Co. (USA). Les cellules d'adénocarcinome pulmonaire humain malin A549 et les fibroblastes NIH 3T3 normaux ont été utilisés et fournis par le Centre de génie biomédical de l'Université de Xiamen (Chine). Tous les matériaux utilisés étaient de qualité analytique et sans autre purification. La verrerie a été soigneusement nettoyée et rincée à l'eau déminéralisée.

Les séquences d'ADN sont les suivantes :

Aptamère AS1411 :5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3′, TDO de contrôle :5′-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3′

Préparation et caractérisation des complexes Apt-GS/siRNA

Des nanogels de gélatine/silice aminofonctionnalisés (GS NG) ont d'abord été préparés par une procédure sol-gel, comme décrit précédemment [19]. Typiquement, 0,2 g de GPSM a été ajouté à 20 mL de solution de gélatine à 0,75% dans une solution de HCl (pH = 3) à 60 °C sous 30 min d'agitation, puis en ajoutant 0,08 g d'APTMS et en incubant pendant 24 h supplémentaires. Les GS NG obtenues ont été purifiées par centrifugation (14 000 rpm, 25°C, 12 min) trois fois. Deuxièmement, les GS NG (0,5 mL, 5 g/L dans du PBS) ont été traités avec 25 uL de SPDP (20 mM dans du DMSO) pendant 60 min à température ambiante, suivis de l'ajout d'AS1411 thiolé (1 mg/mL) et d'une agitation pendant 12 h. Les nanogels Apt-GS ont été obtenus par centrifugation (14 000 rpm, 25°C, 12 min) et purifiés trois fois avec de l'eau déminéralisée. Troisièmement, la suspension Apt-GS NG activée par SPDP obtenue (80 mL, 5 mg/mL) a été directement mélangée avec le brin sens de l'ARNsi pendant une nuit à 4°C. Après purification par centrifugation, le brin anti-sens siRNA a été ajouté et incubé pendant 5 min à 94 °C, puis recuit pendant 20 min à 47 °C pour former des complexes Apt-GS/siRNA.

Les morphologies de surface des complexes AS1411-GS et AS1411-GS/ARNsi ont été examinées par microscopie électronique à transmission (MET) (Hitachi S-4300, Japon). La taille des particules et les potentiels zêta de chaque échantillon ont été mesurés par un détecteur de diffusion dynamique de la lumière Nano-ZS Zetasizer (Malvern Instruments, Royaume-Uni). Les diamètres de particules effectifs ont été calculés à partir de la fonction d'autocorrélation en utilisant le logiciel Malvern Zetasizer en supposant une distribution log-normale. Les conjugaisons de GS et AS1411 ou siRNA ont été déterminées en collectant et en mesurant la concentration d'ADN marqué au FAM non attaché en utilisant la microscopie à fluorescence F-7000 (Olympus-IX73, Japon). Groupe aminé total (-NH₂ ) les niveaux à la surface des nanogels GS ont été déterminés quantitativement en utilisant la réaction colorimétrique à la ninhydrine. La quantité était d'environ 0,642 mmol/g.

Analyse par électrophorèse sur gel

L'électrophorèse sur gel a été réalisée à 100  V pendant 20 à 30  min en utilisant un gel d'agarose à 2 % (p/v) dans du tampon TBE. Les images ont été observées par irradiation avec un système de documentation sur gel (Tanon GIS-2008, Chine). Dans le test d'encapsulation Apt-GS/siRNA, les complexes siRNA, GS/siRNA et Apt-GS/siRNA nus ont été chargés dans le gel sans aucun additif. Dans les tests réactifs à l'oxydoréduction, les complexes GS/siRNA et Apt-GS/siRNA ont été incubés avec une solution de GSH 10 mM dans du PBS pendant 2 h avant la mesure.

Cytotoxicité in vitro

La cytotoxicité contre les cellules d'adénocarcinome pulmonaire humain A549 a été évaluée par dosage MTT. En bref, les cellules A549 (1 × 10 ⁴ cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques de culture à 96 puits en polystyrène et incubées pendant 24 h jusqu'à 70 % de confluence. Après avoir retiré le milieu de culture, 100 μL de milieu DMEM sans sérum contenant des nanogels (100-600 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits. Les cellules traitées avec le milieu n'ont servi que de groupe témoin négatif. Après 24 h de co-incubation, 100 μL de milieu frais avec 20 μL de solution MTT (5 mg/mL en tampon PBS) ont été ajoutés et cultivés pendant 4 h supplémentaires. Ensuite, la solution de MTT a été retirée et 100 L de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés. Après avoir oscillé pendant 30 min dans l'obscurité, l'absorbance de chaque puits a été mesurée par un lecteur de microplaque (TECAN DNA export, Swiss) à la longueur d'onde de 490 nm. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. La viabilité cellulaire relative (%) a été exprimée en pourcentage par rapport aux cellules témoins non traitées.

Internalisation des cellules

Les cellules sont co-cultivées avec 25 μL de nanogels Apt-GS et TDO-GS marqués FAM (2 mg/mL) pendant 10 h dans un milieu sans sérum à 37 °C. Après trois lavages avec du PBS, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde (4% en PBS) pendant 30 min puis observées au microscope confocal à balayage laser (Leica, Allemagne). Pour quantifier l'absorption cellulaire, les cellules ont été traitées avec 25 μL d'AS1411-GS et de TDO-GS marqués FAM (2 mg/mL) pendant une période (0,5–16 h) dans un milieu sans sérum à 37 °C. Pour évaluer le rôle de la nucléoline dans l'absorption cellulaire des NG Apt-GS, le mélange des NG Apt-GS préparés et des aptamères AS1411 libres de concentrations variées (0,5, 5 et 50 M) a été incubé avec les cellules A549 pendant 8 h. Ensuite, les cellules ont été remises en suspension dans du PBS glacé et les cellules fluorescentes avec des nanogels marqués FAM ont été comptées à partir de 10 000 cellules en utilisant un cytomètre en flux EPICS XL (Beckman Coulter, USA). L'analyse des données a été réalisée avec le logiciel de cytomètre en flux EPICS XL, et les portes analytiques ont été choisies comme 1% des cellules de contrôle tombant dans la région positive.

Silence génique

La capacité de faire taire les gènes a été examinée en utilisant la combinaison de siRNA pour la luciférase et les cellules exprimant la luciférase. En bref, A549 exprimant la luciférase (2 × 10 ⁵ cellules/puits) et fibroblastes NIH 3 T3 (4 × 10 ⁵ cellules/puits) ont été ensemencées en plaque 12 puits et cultivées pendant une nuit puis traitées avec 100 μL de complexes à tester (80 μg/mL) contenant LUC-siRNA (ou siRNA contrôle) pendant 8 h. Les échantillons ont été divisés en trois groupes :(a) seuls les complexes Apt-GS/siRNA pendant 8 h, (b) les complexes Apt-GS/siRNA pendant 8 h suivis de liposomes pendant 1 h supplémentaires (nommés A-GS/si → groupe Lip), et (c) co-incubation des complexes Apt-GS/siRNA et liposome pendant 8 h (groupe A-GS/si+Lip). Les cellules sans aucun traitement et celles transfectées avec le plasmide luciférase pGL3 (Madison, WI, USA) étaient comme contrôles. Après 40 h d'incubation supplémentaire, l'efficacité du knockdown du gène a été étudiée en quantifiant l'expression de la luciférase dans les cellules à l'aide d'un système de dosage de la luciférase selon le protocole du fabricant. Les expériences ont été réalisées en triple et les données sont présentées sous forme de moyennes  ± erreurs standard des moyennes.

Résultats et discussions

Synthèse et caractérisation des complexes GS-AS1411/siRNA

Pour construire le porteur de siRNA ciblant le cancer, un nanogel de gélatine/silice-AS1411 (Apt-GS) a été conçu (schéma 1) en utilisant une méthode sol-gel [19, 20]. Une image MET typique (Fig. 1) a révélé que les blancs GS et Apt-GS étaient des structures sphériques dispersées avec des diamètres moyens de 170 à 200  nm. L'ADN marqué au FAM a été utilisé pour la synthèse afin de confirmer le couplage de l'AS1411 et de l'ARNsi sur les GS NG. La quantité d'aptamère conjugué sur GS était d'environ 0,65 µmol/g, comme quantifié à l'aide de spectres de fluorescence. Pendant ce temps, une fluorescence verte intense peut être facilement observée dans les images de fluorescence, suggérant l'intégration de l'aptamère AS1411 et du siRNA. Comme le montre la figure 2, la taille hydrodynamique des NG nus GS, Apt-GS et Apt-GS/siRNA (162,3 nm, 216,5 nm et 234,9 nm, respectivement) a progressivement augmenté avec la procédure de fonctionnalisation en raison d'une augmentation de la couche fonctionnelle de surface. D'autre part, le potentiel zêta de l'Apt-GS était moins positif (33,9 ± 0,5 mV) que celui des GS NG nus (40,1 ± 0,5 mV) en raison de l'effet masquant des aptamères d'ADN négatifs sur la surface. Après une nouvelle conjugaison avec l'ARNsi à la surface, le potentiel zêta des NG Apt-GS/ARNi passe toujours négativement à 24,9 mV en raison des groupes phosphate négatifs sans excès de l'ARNsi. Ce résultat suggère une toxicité biologique réduite car les fortes charges positives pourraient interférer avec les protéines chargées négativement dans le sang et perturber la membrane cellulaire [24].

Images d'Apt-GS (a , c ) et des nanogels Apt-GS/siRNA (b , d ). un , b images TEM. Les barres d'échelle représentent 0,5 m. c , d Images fluorescentes. Les barres d'échelle représentent 5 μm

Taille hydrodynamique et potentiels zêta des nanogels GS, Apt-GS et Apt-GS/siRNA

Chargement et libération de siRNA

Un ARNi réussi ne peut se produire que lorsque l'ARNsi est délivré et libéré rapidement de son porteur dans le cytoplasme [25]. Les cellules tumorales ont une concentration de GSH 7 à 10 fois plus élevée que celle des cellules normales [26, 27]. Dans cette étude, l'ARNsi a été conjugué à des NG Apt-GS actifs par le biais de la réaction de réticulation disulfure. L'électrophorèse sur gel (GE) a été réalisée pour évaluer la capacité de chargement et de libération des siRNA des complexes Apt-GS/siRNA. Comme prévu, alors que l'ADNp libre (Fig. 3, pistes 1 à 5) s'est déplacé vers sa position habituelle, les complexes Apt-GS/siRNA ont montré une mobilité réduite dans un test de décalage d'électromobilité (Fig. 3, pistes 10 à 11) démontrant la bonne chargement de siRNA. Pour imiter l'état intracellulaire, 10 mM de GSH ont été traités avec des complexes pendant 2 h pour réduire les NG Apt-GS/siRNA. Comme le montre la figure 3, piste 6-7, des molécules de siRNA ont été observées dans le gel de polyacrylamide après le traitement du GSH, indiquant que les Apt-GS/siRNA NG pourraient libérer de manière réversible des molécules de siRNA fonctionnelles par clivage disulfure en présence de glutathion. En outre, la quantité de siRNA sur les nanoparticules a été analysée en comparant la quantité totale de siRNA et de siRNA de contrôle dans une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 2 %. L'Apt-GS a encapsulé les molécules d'ARNsi dans un rapport de 3:1∼2:1 pmol par microgramme. Il est également noté que le mélange de siRNA et d'Apt-GS présentait une rétention plus faible en raison du piégeage physique du siRNA négatif (Fig. 3, piste 8).

Analyse AGE de la liaison réversible de l'ARNsi aux nanogels Apt-GS. Pistes 1 à 5 :ARNsi libre avec une quantité de 50, 40, 30, 20 et 10 pmol. Pistes 6 et 7 :GS/siRNA et Apt-GS/siRNA avec 10 mM de GSH à 2 h. Piste 8 :le mélange de siRNA libres et de NG Apt-GS. Pistes 10 et 11 :complexes GS/siRNA et Apt-GS/siRNA sans GSH 10 mM comme contrôles

Cytotoxicité et ciblage de la nucléoline

L'évaluation de la cytotoxicité in vitro a été étudiée par dosage MTT dans des cellules A549. Le test MTT est utilisé pour évaluer la cytotoxicité des nanogels préparés. L'ARNsi de luciférase non toxique a été sélectionné comme rapporteur, qui n'a pas d'effet destructeur sur les cellules tumorales [28, 29]. Par conséquent, la viabilité cellulaire représentait la biocompatibilité du support. Comme le montre la figure 4, la prolifération cellulaire n'a pas été remarquablement affectée par GS, Apt-Apt et Apt-Apt/siRNA aux concentrations de groupes de 100 à 600  μg/mL (viabilité cellulaire>   80 %) et la cytotoxicité est apparue à la dose -dépendant. Par rapport aux GS NG nus, les nanogels modifiés par AS1411 présentaient une légère diminution de la viabilité cellulaire en raison de l'inhibition de la signalisation NF-κB [27, 30] et de la destruction des membranes des organites [16]. La biocompatibilité bénigne des nanogels Apt-GS les rend appropriés comme porteurs d'ARNsi in vivo.

Viabilité cellulaire des cellules A549 avec des nanogels GS, Apt-GS et Apt-GS/siRNA de diverses concentrations déterminées par le test MTT

Pour évaluer le ciblage de l'Apt-GS dans les cellules tumorales in vitro, nous avons incubé des cellules A549 et des fibroblastes 3T3 avec les mêmes quantités d'Apt-GS marqué au FAM ou de contrôle TDO-GS (GS décoré d'un oligonucléotide contrôle). De faibles niveaux de fluorescence ont pu être observés dans les cellules 3T3 ou lorsque les cellules étaient traitées avec le contrôle TDO-GS (Fig. 5b, c). En revanche, la fluorescence verte émise par l'aptamère AS1411 était nettement améliorée dans les cellules cancéreuses A549 (Fig. 5a), suggérant que l'Apt-GS était spécifiquement accumulée dans les cellules tumorales en raison de l'introduction des aptamères AS1411 ciblés sur la nucléoline. Dans l'analyse quantitative par cytométrie en flux (Fig. 6), les NG Apt-GS présentaient des intensités de fluorescence dépendantes du temps dans les deux types cellulaires. De 0,5 à 16 h, l'intensité de fluorescence de l'internalisation de l'Apt-GS dans les cellules A549 et les cellules 3T3 s'est améliorée 13 et 2 fois, respectivement. Quant au ratio de cellules contenant des NG, il a rapidement augmenté au cours des 30 premières minutes et a apparemment atteint un maximum de saturation possible à 8 h dans A549.96% des cellules A549 avaient été attachées ou avaient pris les nanogels dans les 16 heures, alors que seulement 52% des cellules 3T3 a été observé. Afin d'évaluer le rôle de la nucléoline dans l'absorption cellulaire des nanogels, le mélange des NG Apt-GS préparés et des aptamères AS1411 libres de concentrations variées (0,5, 5 et 50 M) a été incubé avec des cellules A549 pendant 8 h. L'intensité de fluorescence et les pourcentages de cellules contenant des nanogels ont diminué de 50 % et 30 %, respectivement, lors de l'utilisation de l'aptamère AS1411 libre pour concurrencer les NG Apt-GS à la nucléoline exprimée au niveau de la membrane cellulaire, suggérant une endocytose induite par le récepteur induite par la nucléoline ( fig. 6c). Ces données ont démontré que les NG Apt-GS présentaient une accumulation plus élevée dans les cellules cancéreuses A549 via l'internalisation médiée par la nucléoline.

un –c Absorption cellulaire du FAM-siRNA délivré par les nanogels Apt-GS et TDO-GS. Les images ont été prises avec CLSM. Signal vert :FAM. La barre d'échelle est de 10 μm

Analyse par cytométrie en flux (FCMS) de l'absorption cellulaire de nanogels Apt-GS et TDO-GS marqués FAM dans différents types cellulaires. Insérer :profils FACS, a , b la courbe rouge, verte, bleue, violette, aqua et jaune présente le temps d'incubation de 0,5 à 16 h ; c la courbe rouge, verte, bleue et violette signifie la concentration d'AS1411 de 0 à 16 μM

interférence ARN

Il est rapporté que l'incorporation de désoxynucléotides dans l'ARNsi peut augmenter la stabilité du brin sens et maintenir une efficacité 40 % de l'ARNi [2, 3]. Pour évaluer l'efficacité de précipitation des porteurs d'ARNsi de test, nous avons utilisé un système de gène rapporteur de luciférase remplacé par un ribonucléotide dans les deux cellules. L'efficacité de knockdown de gène (KD) de siRNA a été évaluée par l'activité de luciférase après 48h. Comme le montre la figure 7a, l'Apt-GS/ARNsi améliore l'efficacité de knockdown du gène de 4,6 fois des cellules A549 par rapport à 6 % des cellules 3T3 normales, montrant une bonne sélectivité cellulaire. Cela suggère que la modification de l'aptamère AS1411 améliore l'efficacité de la transfection en générant un effet de ciblage. Il a été prouvé que les liposomes cationiques aident à la livraison de la cargaison et à l'échappement des lysosomes [31]. De plus, l'ajout ultérieur de liposomes (A/si-GS → groupe Lip) n'a pas aidé à améliorer l'activité de silençage génique induite par les siRNA (30,4 %) malgré la perturbation de l'endosome, ce qui laisse supposer la libération de siRNA dans l'environnement intracellulaire du glutathion (GSH) par clivage disulfure . En outre, la co-transfection de liposomes et d'Apt-GS/siRNA (groupe A/si-GS + Lip) a légèrement amélioré l'efficacité de l'expression de la luciférase (41,6 %) dans A549, bien que les liposomes aident les lysosomes à s'échapper, ce qui correspond aux rapports précédents [27 , 30]. Cependant, les cellules A549 avaient des activités de silençage génique 2,7 fois et 1,4 fois pour le groupe A/si-GS→Lip et pour A/si-GS+Lip, respectivement, par rapport aux cellules 3T3, ce qui induit une diminution de la sélectivité cellulaire.

Effet de silençage in vitro des siARN anti-luciférase formulés dans des nanogels Apt-GS avec différents traitements (a ) et concentration des complexes Apt-GS/siRNA (A-GS/si) sur le silençage génique (b )

Ensuite, nous avons examiné l'effet de concentration des nanogels sur l'ARNi. Comme le montre la figure 7b, l'efficacité d'interférence génique a atteint le maximum à la concentration de complexe de 80  μg/ml. La diminution de l'efficacité du KD à une concentration de 120  μg/ml peut être due à une cytotoxicité accrue de l'aptamère. Il est également noté que l'ajout d'un liposome d'agent d'échappement d'endosome peut augmenter l'efficacité de l'interférence ARN à de faibles concentrations de nanogels Apt-GS/siRNA (40 μg/ml et 80 μg/ml) mais n'a pas conduit à une réduction à des concentrations élevées (120 μg/ml et 80 μg/ml) g/ml). Ainsi, on pense qu'Apt-GS peut délivrer avec succès le siRNA aux cellules tumorales et par la suite aboutir à un ARNi spécifique.

Conclusions

La stabilité et la livraison tissu-spécifique de siRNA restent les plus grands obstacles pour les thérapies RNAi. Ici, l'ARNsi substitué par un désoxynucléotide est utilisé pour améliorer la stabilité de l'ARNsi, et le noyau GS a été en outre recouvert d'un aptamère AS1411 pour le ciblage de la tumeur et d'un lieur disulfure pour la délivrance réactive à l'oxydoréduction de l'ARNsi. Le véhicule a une structure sphérique d'une taille d'environ 200  nm et possède des charges positives à la surface. Ces nanogels Apt-GS/siRNA tels que préparés pourraient protéger la cargaison et présenter une libération accélérée de siRNA sous l'ajout de DTT par clivage disulfure. De plus, avec l'aptamère de ciblage AS1411, les nouveaux nanogels Apt-GS Apt-GS pourraient efficacement délivrer et libérer plus de cargaison dans le cytoplasme, conduisant à une amélioration significative (environ 5 fois in vitro de l'activité de silence dans les cellules A549) surexprimant la nucléoline). Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que l'administration d'ARNsi substitué par des désoxynucléotides est une stratégie innovante et ces nanogels intelligents ciblant les tumeurs et réactifs à l'oxydoréduction sont très prometteurs pour l'administration d'ARNsi et le traitement des tumeurs.

Disponibilité des données et des matériaux

Les ensembles de données soutenant les conclusions de cet article sont inclus dans l'article.

Abréviations

APTMS :

3-Aminopropyl-triméthoxysilane

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

FAM :

Amidite de fluorescéine

GE :

Électrophorèse sur gel

GSM :

3-Glycidoxypropyl-triméthoxysilane

NG GS :

Nanogels de gélatine réticulés au siloxane

MTT :

Bromure de 3-(4,5-Diméthylthiazolyl-2)-2,5-diphényltétrazolium

ARNi :

Interférence ARN

ARNsi :

Petits ARN interférents

SPDP :

N -succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate

TDO :

Oligonucléotide d'ADN négatif