Nanoparticules d'or contenant du chitosane, du chitosane N-acylé et de l'oligosaccharide de chitosane comme vecteurs d'ADN

Contexte

La thérapie génique peut être brièvement définie comme un moyen d'introduire du matériel génétique dans des cellules à différentes fins, le traitement de maladies génétiques parmi eux [1]. Parmi les deux principaux types de vecteurs d'ADN pour la thérapie génique, viraux et non viraux, le dernier présente les avantages de l'absence d'immunogénicité, d'une bonne compliance, de la non-infectivité [2], de la stabilité en stockage et de la facilité de production. D'autre part, même lorsque les vecteurs viraux tels que les rétrovirus, les adénovirus, les virus adéno-associés, etc., ont des taux de transfection élevés et une transcription rapide, ils présentent des inconvénients tels qu'une élimination rapide de la circulation, une toxicité, une immunogénicité et une capacité réduite. pour transporter de grandes quantités d'informations [3,4,5]. Habituellement, dans le cas de porteurs non viraux, l'ADN étranger est chargé sur un plasmide et il est protégé et stabilisé tout au long de la formation de conjugués ou de complexes. En particulier, le chitosane (CO) a été étudié pour le développement de vecteurs d'ADN non viraux, car il a montré des taux de transfection élevés et une faible toxicité, protégeant l'ADN des acides nucléiques lors du transport intercellulaire [4]. Ce polymère largement présent dans la nature (on le retrouve comme constituant principal des carapaces de crustacés et faisant partie des parois cellulaires de nombreux champignons [6]) est un polysaccharide qui peut être obtenu après transformation de la chitine (obtention du 2-amino-2-désoxy -Unités répétitives β-D-glucopyranose mais conservant toujours une petite quantité de résidus 2-acétamido-2-désoxy-β-D-glucopyranose [7]) (Fig. 1a). Les applications médicales du chitosane natif nécessitent, dans la plupart des cas, certaines modifications du polymère; parmi les principaux inconvénients à surmonter sont l'insolubilité au pH physiologique et la viscosité élevée en solution acide diluée [8]. Certains chercheurs ont souligné que la dynamique de transfection cellulaire dépend de la taille et de la forme du véhicule [1, 8,9,10,11,12], par exemple, Huo et. Al. ont rapporté comment ces propriétés sont en corrélation avec l'efficacité de pénétration pour le cas des nanoparticules d'or [10].

La solubilité du chitosane peut être modifiée en changeant la distribution des groupes acétyle restants dans la chaîne et le degré d'acétylation [13]. Une autre méthode pour contrôler les propriétés physiques du chitosane est l'acylation (Fig. 1b). Selon la disponibilité des groupes aminés et le degré d'acétylation, certaines bio-interactions du chitosane peuvent être contrôlées, augmentant son hydrophobie par acylation avec des acides gras, par exemple [7]. Le Tien et. Al. [7] ont rapporté la N-acylation du chitosane pour des matrices à libération contrôlée dans les produits pharmaceutiques. Bhattarai et. Al. [14] ont obtenu des nanoparticules d'or stabilisées au chitosane N-acylé pour des applications dans des conditions physiologiques, présentant les avantages du chitosane non acylé. Une autre modification utile du chitosan est la réduction de la longueur de la chaîne polymère (Chitosan oligosaccharide, COS) [15]. Parmi les propriétés des nombreux types de COS obtenus à partir du chitosane, leur viscosité plus faible et leur solubilité plus élevée dans l'eau sont très utiles pour de nombreuses applications [16]. Il a été rapporté que le chitosane de faible poids moléculaire peut augmenter l'absorption cellulaire, principalement en raison de ses longueurs de chaîne plus courtes (2-10 unités de D-glucosamine) (Fig. 1c) et de ses groupes aminés libres [17,18,19]. De plus, la synthèse de nanoparticules d'or avec un oligosaccharide de chitosane comme agent réducteur n'inclut aucun réactif toxique [20].

Structure chimique de a chitosane, b chitosane acylé, et c oligosaccharide de chitosane

Les nanoparticules d'or (AuNPs) ont conduit au développement d'un nouveau type de nanomatériaux, tirant parti de leurs propriétés optiques et de leur stabilité physique élevée qui en font une option très viable pour plusieurs applications [21,22,23,24,25] ; ainsi, ils présentent des améliorations pour la transfection cellulaire par rapport aux lipocomplexes ou aux polymères, en ayant une densité plus élevée et en réduisant ainsi le temps d'absorption [12]. Comme l'or a une grande affinité avec les amino (-NH₂ ), les groupes fonctionnels cyano (-CN) et thiol (-SH), de vastes opportunités sont ouvertes pour de nombreux types de fonctionnalisation [9, 26]. Des monocouches cationiques sont obtenues, par exemple, en ajoutant des polymères cationiques à des nanoparticules d'or, améliorant l'interaction des acides nucléiques et l'adsorption électrostatique [27, 28]. De cette façon, les nanocomplexes combinant le chitosane et l'or tirent parti des deux matériaux pour des applications biologiques [29,30,31,32,33], représentant un matériau prometteur pour le développement de porteurs d'ADN [5, 10, 12, 14].

Il existe une grande variété de méthodes biologiques pour synthétiser les AuNP, comprenant l'utilisation de glucides, de micro-organismes, d'enzymes, de vitamines et de biopolymères, entre autres [34]. Entre la synthèse dite verte [35], l'utilisation de la méthode de synthèse en un seul pot, utilisant le chitosane comme agent réducteur et stabilisant, s'est avérée plus adaptable et sûre pour les applications biomédicales [36, 37]. Identique aux méthodes de synthèse traditionnelles, dans le cas de la synthèse en un seul pot, la granulométrie obtenue dépend de la concentration en agent réducteur; de cette façon, dans le cas particulier de l'oligosaccharide de chitosane, le rapport chitosane/or doit être contrôlé afin d'obtenir des tailles de particules différentes, le poids moléculaire du chitosane étant un facteur important pour la distribution de la taille et de la forme des nanoparticules. Ce travail visait à évaluer différents nanocomplexes à base de chitosane-AuNP pour la transfection d'ADN, y compris la synthèse verte/en pot unique avec un oligosaccharide de chitosane 5 kDa qui est un poids moléculaire inférieur à ceux rapportés pour des applications similaires [36, 38].

Des tests de transfection ont été réalisés dans la lignée cellulaire HEK-293 (Homo sapiens (humain)-morphologie épithéliale-rein embryonnaire-fœtus) avec les plasmides pSV-β-Gal et pIRES2-EGFP. Ces tests ont été sélectionnés sur la base de l'efficacité de transfection et de la cytotoxicité qui dépendent du type cellulaire et qui, selon Corsi et. Al. [4], la transfection est plus favorable pour la lignée cellulaire HEK-293 en comparaison avec MG63 et les cellules souches mésenchymateuses.

Méthodes

Synthèse nanocomposite

Chaque expérience a été réalisée avec des nanoparticules d'or avec du chitosane modifié et non modifié ; deux méthodes de synthèse principales ont été utilisées :l'une impliquant la synthèse chimique de nanoparticules d'or avec du chitosane sous sa forme simple (CO-AuNPs) et du chitosane modifié hydrophobe avec des groupes acyle (Acyl-CO-AuNPs) et l'autre une méthode verte/one- synthèse en pot utilisant du chitosane à chaîne courte (chitosane oligosaccharide, COS@n-AuNPs). La figure 2 montre un diagramme schématique pour chaque synthèse ; les procédures expérimentales correspondantes sont décrites ci-dessous.

Schéma de principe pour chaque synthèse :a –b synthèse chimique de nanoparticules d'or avec du chitosane sous sa forme simple (CO-AuNPs) et avec des groupes acyles modifiés hydrophobiquement (Acyl-CO-AuNPs) et c –f synthèse verte/one-pot pour le chitosane à chaîne courte (oligosaccharide de chitosane, COS@n-AuNPs)

Matériaux

Chlorure d'or(III) trihydraté (HAuCl₄ ∙3H₂ O), borohydrure de sodium (NaBH₄ ), le chitosane de faible poids moléculaire (50-190 kDa, 75 % de degré de désacétylation) et l'oligosaccharide de chitosane (faible poids moléculaire, 5 kDa) ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich. Toute la verrerie a été lavée et laissée dans un bain d'eau régale fraîchement préparée (HCl :HNO₃ , 3:1 v /v ) pendant 24 h, et rincé abondamment à l'eau Mili-Q avant utilisation, pour éliminer toute trace de métal [39].

Nanoparticules de Chitosan-Or (CO-AuNPs)

La synthèse de nanoparticules de chitosane-or a été réalisée en suivant Huang et. Al. la méthodologie de [9]. Pour cela, 20µmg de solution de chitosane de bas poids moléculaire (2µmg/ml) ont été ajoutés à 10µml d'acide acétique à 1% et mélangés au vortex jusqu'à dissolution complète et conservés pendant une nuit. Deux millilitres de la solution obtenue ont été filtrés à l'aide d'un filtre seringue en polyéthersulfone de 0,22  μm, puis ils ont été mélangés avec 1  ml de 10 mM HAuCl₄ ∙3H₂ O solution en utilisant une forte agitation pendant 30 min. 0,4 ml de 100 mM NaBH₄ fraîchement préparé une solution froide a été utilisée comme agent réducteur ; on l'ajoute goutte à goutte en agitant, et on observe une coloration rapide passant du jaune au rouge vineux; après cela, l'agitation s'est poursuivie pendant une durée totale de 2 h (Fig. 2a).

Nanoparticules acylées de chitosan-or (Acyl-CO-AuNPs)

Chlorure de caproyle (C₆ H₁₁ ClO, Sigma Aldrich) a été utilisé pour la synthèse de nanoparticules de chitosane-or acylées.

Gelation

L'acylation du chitosane (de faible poids moléculaire) a été réalisée en suivant la méthode rapportée par Remant Bahadur et al. [6] avec de légères modifications. Pour cela, 0,83µg de chitosane a été ajouté à 100µml de solution d'acide acétique à 1% sous agitation magnétique qui s'est poursuivie pendant 24µh. Cinq  millilitres de cette solution ont été filtrés avec un filtre seringue en polyéthersulfone 0,22 m, puis son pH a été ajusté à 7,2 avec une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 0,1 M ajoutée lentement sous agitation vigoureuse. Un millilitre de chlorure de caproyle a été ajouté à 5 ml de cette dernière solution et le mélange résultant a été agité pendant 5 h. Le pH du mélange a été ajusté à 6,8-7 avec une solution d'hydroxyde. Le gel obtenu a été précipité avec de l'acétone et centrifugé à 5000 rpm pendant 20 min à 4 °C. L'excès d'acide caproïque a été éliminé en lavant trois fois avec du méthanol (50-60 °C) et en décantant, en le laissant sécher pendant 3 jours sur une cuisinière. Ce gel a été utilisé pour la synthèse des nanocomposites.

Nanocomposites

Un millilitre d'un HAuCl₄ 10 mM ∙3H₂ La solution O a été ajoutée à 2 ml de gel dilué à 0,33 % dans une solution d'HCl 0,1 M, sous agitation pendant 1 h. Enfin, en ajoutant à cela les derniers 0,4 ml d'un NaBH 0,1-M₄ solution froide fraîchement préparée tout en agitant, la formation de nanoparticules d'or était évidente avec la couleur rose/rouge tournant avant de terminer 2 h d'agitation continue (Fig. 2b).

Nanoparticules d'oligosaccharide de chitosane-or (COS@n-AuNPs)

Les COS@n-AuNPs ont été préparés en suivant une méthodologie modifiée rapportée par Manivasagan et al. [20]. L'oligosaccharide de chitosane (COS) a été ajouté à 10 ml de HAuCl₄ ∙3H₂ O et agité pendant 60 min à 80 °C. Quatre synthèses ont été réalisées en faisant varier la quantité de COS (100 et 200 mg) et la concentration en or dans le HAuCl₄ ∙3H₂ O solution (0,003 et 0,017  wt%). Le tableau 1 montre les paramètres utilisés dans la synthèse AuNP pour chaque expérience. La formation de nanoparticules d'or était évidente avec le virage de couleur vin-rouge/rose-rouge, enregistrant un changement de couleur à différents moments dans chaque cas, en fonction de la quantité d'agent réducteur et de précurseur d'or. Les nanocomposites obtenus ont été purifiés par centrifugation à 12.000g pendant 30 min (Fig. 2c–f).

Caractérisation nanocomposite

Spectroscopie infrarouge

Le chitosane utilisé pour les CO-AuNPs, le chitosane acylé pour les Acyl-CO-AuNPs et l'oligosaccharide de chitosane pour les séries de COS@n-AuNPs ont été caractérisés par spectrométrie FTIR (Spectrum One, Perkin Elmer) pour confirmer l'acylation du polymère Acyl-CO en comparant les intensité des bandes caractéristiques des groupes fonctionnels entre les échantillons. Le degré de substitution (SD) a été estimé à partir des informations sur les spectres IR, selon Remant Bahadur et. Al. [6].

ξ-Potentiel

Zetasizer (Nano Z, Malvern) a été utilisé pour évaluer le potentiel de surface composite. Un potentiel positif est attendu pour les nanocomposites pour une adhésion réussie à l'ADN pour former des complexes. ξ- Le potentiel a été évalué avant et après la formation du complexe pour confirmer les changements après l'adhésion de l'ADN. 1,5 ml d'échantillons dilués appropriés ont été utilisés pour les mesures de potentiel de surface, en utilisant une cellule capillaire (DTS 1060, Malvern).

Spectroscopie UV-Vis

Des spectres UV-Vis (UV-1800 m, Shimadzu), dans une gamme de 400 à 700 nm, ont été obtenus pour une confirmation préliminaire de la formation de nanoparticules d'or au moyen de la bande de résonance plasmonique de surface autour de 530 nm. En complément, les spectres de nanocomposites fraîchement préparés ont été utilisés pour évaluer qualitativement la photostabilité des échantillons; cela a été fait en comparant les spectres obtenus à partir des mêmes échantillons 150 jours après la synthèse, en suivant les changements autour de la bande de résonance des plasmons de surface, en choisissant un échantillon pour chaque méthode et en utilisant COS@2-AuNPs comme le plus représentatif pour COS@n-AuNP séries. Une cellule de quartz a été utilisée comme récipient de l'échantillon et de l'eau déminéralisée comme blanc.

Microscopie électronique à transmission (MET)

La microscopie MET (JEM 1010, JEOL) a été utilisée pour déterminer la forme et la distribution granulométrique. Pour les images MET, des échantillons de nanocomposites ont été préparés en déposant 10 μl de solution sur un support de grille en cuivre de 200 mesh, recouvert de formvar, et en séchant à température ambiante pendant 15 min. Trois images pour chaque échantillon ont été sélectionnées et analysées au moyen d'un programme de traitement d'imagerie fait maison développé sous le logiciel Matlab®.

Diplôme Complexe de Formation et d'Adhésion

Nanocomposite-pDNA

pSV-β-Gal (6,82 kb) et pIRES2-EGFP (5,3 kb) (pDNA) ont été isolés à partir de DH5α Escherichia coli transformé . La purification du plasmide a été effectuée par lyse alcaline, en utilisant le kit d'isolement d'ADN microbien Mo Bio® UltraClean. L'électrophorèse sur gel d'agarose a été utilisée pour vérifier l'intégrité structurelle des plasmides, à l'aide d'un transilluminateur ultraviolet haute performance, en acquérant des images avec un système d'imagerie numérique Kodak Gel Logic 100. La concentration et la pureté de l'ADN plasmidique ont été validées avec le lecteur de microplaques multi-détection Synergy™ 2 à l'aide du programme Gen5. Les complexes ont été obtenus en mélangeant de l'ADN plasmidique (ADNp) avec chaque type de nanocomposites de nanoparticules d'or-chitosane dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco sans sérum (DMEM, Sigma-Aldrich) à des quantités de plasmides comprises entre 200 et 400  ng. L'adhésion de l'ADNp au nanocomposite a été évaluée par électrophorèse en utilisant un gel d'agarose à 0,8% et une tension de 90 V pendant 60 min.

Transfection complexe chitosan-or nanoparticule-pDNA dans des cellules HEK-293

Culture cellulaire

HEK-293 Homo sapiens Des cellules (humaines)-morphologiques-épithéliales-rein-fœtus embryonnaires ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié de Dulbecco avec du sérum bovin fœtal (SFB, Sigma-Aldrich) à 37°C sous 5% de CO₂ -atmosphère contenant. Pour la transfection d'ADNp, les cellules HEK-293 ont été ensemencées à 12 000 cellules par puits dans une plaque à 96 puits et incubées pendant 24 h à 37 °C dans 5% CO₂ -atmosphère contenant, obtenant 90% de confluence.

Efficacité de la transfection avec pIRES2-EGFP

La fonctionnalisation in vitro des nanocomposites d'ADNp a été réalisée en versant le milieu de culture des puits jusqu'à recouvrir à peine les cellules et en ajoutant la solution complexe sur chaque puits (15 μl de nanocomposites et 200 ng d'ADN), en incubant pendant 2 h dans les mêmes conditions de culture. Après cela, 500 l de DMEM complet ont été ajoutés pour une incubation pendant 48 h. La transfection pIRES2-EGFP a été directement évaluée par microscopie à fluorescence (Axio Vert.A1, Carl Zeiss).

Efficacité de la transfection avec pSV-β-Gal

L'histochimie du X-gal a été utilisée pour évaluer l'activité -galactosidase, en modifiant l'expression du plasmide pSV-β-Gal sur la lignée cellulaire HEK-293; dans cette méthodologie, les cellules transfectées sont devenues bleues. La fonctionnalisation in vitro des nanocomposites d'ADNp a été réalisée comme expliqué ci-dessus, en incubant pendant 2 h dans les mêmes conditions de culture. Après cela, 500 l de DMEM complet ont été ajoutés pour une incubation pendant 24 h, en changeant le milieu et en incubant pendant 24 h supplémentaires. Les puits ont été lavés deux fois avec 50 ul de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) 1 x après avoir retiré le milieu de culture, puis les cellules ont été fixées avec un mélange de formaldéhyde à 2 % et de glutaraldéhyde à 0,2 % pendant 5 min; après cela, ils ont été lavés deux fois avec 50 μl de PBS 1x. Le fixateur a été retiré avant de laver deux fois avec 50 μl de PBS 1× puis avec un mélange de 0,4 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, Sigma-Aldrich) dilué dans du ferrocyanure de potassium 5 mM (Meyer) et du chlorure de magnésium 2 mM (Meyer) sur PBS 1×. Ensuite, les cellules ont été incubées pendant 24h à température ambiante. L'expression de la β-galactosidase a été observée par microscopie à fond clair (AE2000, Motic), en prenant 5 champs par puits avec un objectif × 40, en s'attendant à ce que les cellules transfectées deviennent bleues. L'efficacité de la transfection a été évaluée en comparant les cellules avec l'expression de la β-galactosidase (devenue bleue) par rapport aux cellules totales par champ. LipofectAMINE ^TM 2000 (30 μl) a été utilisé comme contrôle positif pour chaque test.

Viabilité cellulaire par méthode d'exclusion de colorant

Les microcultures ont été utilisées 24h après le passage cellulaire. Le milieu de culture a été retiré, et les cellules ont été lavées avec du PBS 1X avant d'ajouter 40 μl de solution de complexe. Après cela, les cellules ont été incubées pendant 2 h à 37 °C à 5% de CO₂ -atmosphère contenant. Pour l'exclusion du colorant, la solution de complexe a été lavée des cellules avec 50 l de PBS 1× et 20 l de bleu Trypan (0,2 % sur PBS 1×) ont été incorporés. Avec ce dernier mélange, les cellules ont été incubées 10 min à 37 °C et 5% CO₂ -atmosphère contenant. Après cette dernière incubation, le colorant a été retiré des puits et nettoyé par lavage deux fois avec 50 μl de PBS 1X. Les cellules ont été observées par microscopie à fond clair, en comptant les cellules colorées en bleu (mortes ou endommagées) par rapport aux cellules totales par champ. Des tests de viabilité cellulaire ont été obtenus pour différentes concentrations de complexes sur l'eau, de 0,1 mM à 3 mM, CO-AuNPs et Acyl-CO, à 3 mM; COS@3-AuNPs et COS@4-AuNPs, à 0,5 mM ; et la concentration la plus faible (0,1 mM) pour COS@1-AuNPs et COS@2-AuNPs.

Logiciel Image J (Logiciel Open Source (OSS ) licence ) avec le plugin Outil basé sur l'image pour le comptage des noyaux-ICTN ont été utilisés pour compter les cellules pour les tests de transfection et de viabilité.

Résultats et discussions

Synthèse et caractérisation de nanocomposites

Parmi les trois types de complexes synthétisés dans ce travail, COS@n-AuNP mérite une attention particulière car ils ont été synthétisés sans l'utilisation de réactifs toxiques, comme le borohydrure de sodium ou le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB). Il a été rapporté que le chitosane convient en tant qu'agent réducteur et stabilisant et à une concentration optimale pour synthétiser des complexes AuNP aux tailles et formes souhaitées en fonction de plusieurs facteurs :temps de réaction, température et degré de désacétylation du chitosane et son poids moléculaire, entre autres [38 , 40]. Sous cette considération, le poids moléculaire du chitosane a été maintenu constant à 5 kDa pour les quatre synthèses COS@n-AuNP, en prenant HAuCl₄ ∙3H₂ Solutions d'O et de chitosane à différentes concentrations.

La figure 3 montre les spectres d'absorption UV-Vis des nanocomposites AuNPs-chitosane synthétisés dans ce travail. Bandes de plasmon centrées à 534 nm pour le chitosane (CO-AuNPs), 507 nm pour le chitosane acylé (Acyl-CO-AuNPs), et pour les différents oligosaccharides de chitosane à 533 nm (COS@1-AuNPs), 530 nm (COS@2 -AuNPs), 535 nm (COS@3-AuNPs) et 536 nm (COS@4-AuNPs) confirment la présence de nanoparticules d'or. Les encarts dans cette figure montrent des images des nanocomposites obtenus dont la coloration dépend de la concentration, de la taille, de la forme et de la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules.

Spectres UV-Vis pour les nanocomposites. Les valeurs dans les encarts correspondent à la longueur d'onde maximale de la résonance plasmonique de surface localisée. Ces maxima étaient les suivants :pour les CO-AuNPs à 534 nm (0,1 M NaBH₄ ) (a ), pour les Acyl-CO-AuNPs à 507 nm (b ), et pour l'oligosaccharide de chitosane COS-@n-AuNP à 533, 530, 535, 536  nm pour chacun à 1 à 4 préparations nanocomposites d'épaisseur différente (c )

Stabilité des nanocomposites

La figure 4 montre la comparaison entre les spectres d'absorption UV-Vis de nanocomposites fraîchement synthétisés et 150 jours après la synthèse ; comme on peut l'observer, les deux spectres pour chaque cas restent essentiellement les mêmes, aucun décalage significatif du maximum de bandes de résonance et aucune preuve de pics supplémentaires. Ces résultats suggèrent qualitativement une stabilité élevée des nanocomposites obtenus.

Stabilité des nanocomposites de nanoparticules d'or par spectres d'absorption UV-Vis obtenus 150 jours après synthèse :CO-AuNPs synthétisés chimiquement (a ) et Acyl-CO-AuNPs (b ) et synthèse green/one-pot pour COS@2-AuNPs (c )

Les spectroscopies infrarouges pour les trois échantillons de chitosane différents sont illustrées à la Fig. 5. Cette technique a été utilisée pour l'identification du chitosane acylé en comparant ses bandes d'absorption à l'intérieur de la région infrarouge (IR) (qui sont des caractéristiques de la structure chimique) avec l'IR base de données. Quelques bandes IR caractéristiques méritent d'être signalées :bandes de chitosane (50-190 kDa, 75 % de degré de désacétylation) à 1656 cm ⁻¹ , 1593 cm ⁻¹ , et 1373 cm ⁻¹ correspondent à des groupes amide (amides I, II et III, respectivement); la bande à 2895 cm ⁻¹ correspond aux liaisons C-H, et celles entre 3200-3500 cm ⁻¹ aux liaisons N-H et O-H. Pour le chitosane acylé, les bandes IR ont été obtenues à 1651 cm ⁻¹ , 1591 cm ⁻¹ , et 1369 cm ⁻¹ correspondent aux groupes amide (amides I, II et III, respectivement) et ceux à l'intérieur de 3200-3500 cm ⁻¹ correspondent aux liaisons N-H et O-H. L'acylation du chitosane a été confirmée selon les données de spectroscopie IR [7] :la bande à 1591 cm ⁻¹ était plus faible pour le chitosane acylé par rapport au chitosane natif en raison d'un plus grand nombre d'amides secondaires sur le chitosane acylé. Bandes à l'intérieur de 3200-3500 cm ⁻¹ , caractéristique des vibrations N-H et O-H dans le chitosane natif, disparaît pour le chitosane acylé et l'oligosaccharide de chitosane en raison de la réduction primaire des amides.

Spectres FT-IR du chitosane, de l'acyl-chitosane et de l'oligosaccharide de chitosane. Bande à 1591 cm ⁻¹ correspond aux amides secondaires; 3200-3500 cm ⁻¹¹ les régions correspondent aux vibrations N-H et O-H

Le degré de substitution du chitosane acylé a été estimé, selon Bahadur et. Al. [6], par l'expression suivante :

où A ₁₆₅₁ = 1.973965 et A ₃₃₅₀ = 1.977278 correspond à l'absorbance (pour les vibrations amide I et OH, respectivement) du chitosane acylé à 1631 cm ⁻¹ et 3350 cm ⁻¹ , respectivement, et le 0,25 correspond aux groupes d'amines libres. Un degré de N-acylation de 75 % a été obtenu.

ξ Potentiel

Les valeurs de potentiel ont été obtenues pour chaque composite comme suit (tableau 2, colonne « Potentiel  ») : 43,3  mV (CO-AuNPs), 40,2  mV (Acyl-CO-AuNPs), 52,2  mV (COS@1-AuNPs) , 55,3 mV (COS@2-AuNPs), 51,6 mV (COS@3-AuNPs) et 46,3 mV (COS@4-AuNPs). Le potentiel pour tous les nanocomposites était positif en raison des groupes amine du chitosane, car il était prévu afin d'obtenir la formation de complexes d'ADN par des forces électrostatiques. Après la formation du complexe, la réduction des valeurs de potentiel ξ a confirmé l'adhésion réussie de l'ADN (tableau 2, colonne « Potentiel ξ/ADN »).

Microscopie électronique à transmission (MET)

La figure 6 montre les micrographies MET représentatives de chaque nanocomposite, ainsi que des histogrammes de taille de nanoparticules pour le calcul de la distribution des tailles. Les distributions de taille pour chaque nanocomposite ont été obtenues comme suit :trois images MET pour chaque échantillon ont été obtenues et analysées avec un logiciel de traitement d'image fait maison développé avec Matlab® et le nombre de nanoparticules était de 500 pour Acyl-CO-AuNPs, 1000 pour CO-AuNPs , et 100 pour la série COS@n-AuNP. La taille moyenne de chaque échantillon est résumée dans le tableau 2, colonne « Diamètre moyen TEM (nm) ». Il convient de souligner que les AuNP synthétisés avec l'oligosaccharide de chitosane sont sphériques, avec une meilleure distribution de taille par rapport à celles similaires obtenues avec d'autres méthodologies de synthèse verte rapportées dans la littérature [36, 38, 41, 42, 43].

Micrographies MET de a AuNPs de chitosane acylé de 4,7  nm, b AuNPs de chitosane 3,5 nm (0,1 M NaBH₄ ), c AuNPs d'oligosaccharide chitosan de 7,4  nm (COS@1), d AuNPs d'oligosaccharide chitosan de 15,6 nm (COS@2), e 10 nm d'oligosaccharides chitosan AuNPs (COS@3) et f 14 nm oligosaccharide chitosan AuNPs (COS@4)

Formation complexe et degré d'adhésion :Nanocomposite-pDNA

Des électrophérogrammes de tous les complexes d'ADNp et d'ADN pur ont été réalisés, en prenant différentes concentrations du plasmide; les résultats sont présentés sur la figure 7. La figure 7a montre les électrophérogrammes correspondants pour le plasmide pur et tous les complexes portés avec 200 et 300  ng du plasmide. La distribution des échantillons de nanocomposites pour ces électrophérogrammes se déroule comme suit :Acyl-CO-AuNPs (300 et 200 ng) aux pistes 1 et 2, CO-AuNPs (300 ng) à la piste 3, COS@1-AuNPs (300 et 200 ng) à 4 et 5, COS@2-AuNPs (300 et 200 ng) à 6 et 7, COS@3-AuNPs (300 et 200 ng) à 8 et 9, COS@4-AuNPs (300 et 200 ng) à 10 et 11, et 300 ng d'ADNp pur à la piste 12. Pour tous les tests, 10 l de solution complexe ont été utilisés. Cette figure montre que seul l'ADNp se déplace dans le gel (comme évident dans la piste 12) et les autres complexes d'ADNp restent dans leurs puits correspondants, confirmant ainsi l'adhésion de l'ADNp sur tous les complexes. Cela est dû à l'interaction des charges positives des groupes amino du chitosane, qui reste à la surface des nanoparticules d'or, et des charges négatives des groupes phosphate des hélices d'ADN.

un Électrophérogrammes pour les nanocomplexes avec des concentrations d'ADNp de 200 et 300 ng. La piste 12 correspond à l'ADNp pur. b CO-AuNPs et Acyl-CO-AuNPs avec 300 ng d'ADNp, ADNp pur à la piste 3. c Nanocomplexe COS@2-AuNPs avec 300 et 350 ng d'ADN, 400  ng d'ADNp pur sur la piste 3. d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. Al. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). un HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

Disponibilité des données et des matériaux

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

Abréviations

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNP :

Nanoparticules d'or

CO :

Chitosan

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

FTIR :

Infrarouge à transformée de Fourier

PBS :

Phosphate-buffered saline

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

TEM :

Microscopie électronique à transmission