MoSe2 Nanodots@Albumin Nanosphères ciblées sur les tumeurs et biocompatibles en tant qu'agent thérapeutique à double modalité pour la radiothérapie photothermique synergique

Contexte

À l'échelle mondiale, le cancer du sein survient à un taux d'incidence très élevé chez les femmes et est connu pour son faible taux de survie et ses taux élevés de métastases et de rechute [1,2,3]. La résection chirurgicale, la radiothérapie (RT) et la chimiothérapie sont des stratégies de traitement couramment utilisées en pratique même si ces thérapies présentent des inconvénients [4]. La RT est une thérapie très efficace mais également nocive pour les tissus normaux. La RT a été explorée pour un effet thérapeutique amélioré tout en diminuant ses effets nocifs. La RT utilise des rayonnements ionisants (par exemple, rayons , rayons X) pour ioniser les molécules d'eau en radicaux libres réactifs qui endommagent localement l'ADN des cellules cancéreuses, même dans les régions profondes [5]. Étant donné que le microenvironnement tumoral était hypoxique, cela a été considéré comme l'un des principaux obstacles à la RT [6, 7]. Compte tenu de ces inconvénients, la combinaison de la RT avec d'autres stratégies thérapeutiques de modalité s'est avérée efficace pour augmenter les effets thérapeutiques. À ce jour, la thérapie photothermique (PTT) a été largement explorée en tant que traitement anticancéreux peu invasif en raison de moins d'effets secondaires, d'une spécificité élevée et d'effets secondaires minimes sur les tissus normaux [8,9,10,11,12,13,14,15 ]. Cependant, le PTT seul est souvent insuffisant, en raison d'une suppression tumorale incomplète, en particulier pour les tumeurs inaccessibles, ce qui pourrait potentiellement provoquer une rechute tumorale [16,17,18]. Fait intéressant, il a été rapporté que le PTT conduisait à une hyperthermie induite par le proche infrarouge (NIR) augmentant la circulation sanguine intratumorale, et par la suite une augmentation de la disponibilité de l'oxygène dans le microenvironnement tumoral, rendant les cellules plus sensibles à la RT [19,20,21]. La combinaison de la RT et du PTT pourrait combiner les avantages des deux, ce qui est préférable pour améliorer les résultats thérapeutiques du cancer.

Récemment, les dichalcogénures de métaux de transition (TMD) en couches bidimensionnelles (2D), tels que le MoS₂ , WS₂ , ReS₂ , et ainsi de suite, ont été utilisés comme agents adsorbants NIR ou radio-sensibilisateurs pour améliorer l'efficacité du PTT ou de la RT en raison de leurs propriétés physiques [7, 19, 21]. Shen et ses co-auteurs ont rapporté une préparation ascendante de ReS₂ uniforme ultramince nanofeuillets pour PTT et RT hautement efficaces guidés par image [21]. En plus de ces TMD, le séléniure de molybdène (MoSe₂ ) ont été rapportés comme transducteur photothermique NIR pour le PTT [22, 23]. Puisque le PTT seul a son inconvénient, il y a plus de raison pour l'exploitation de MoSe₂ propriétés telles que la radiosensibilisation pour une meilleure thérapie contre le cancer.

Dans ce travail, nous avons d'abord préparé l'ultra-petit MoSe₂ nanodots, qui ont ensuite été assemblés avec de l'albumine sérique bovine (BSA) en nanosphères (NS) et enfin conjugués avec de l'acide folique (FA) molécule ciblant la tumeur via des « ponts » de polyéthylène glycol (PEG). En plus du grand effet photothermique, le FA-MoSe₂ obtenu Les NS @BSA se sont avérées avoir une excellente propriété de radio-sensibilisation. La modification BSA a doté le MoSe₂ nanodots (NDs) avec une excellente stabilité physiologique et biocompatibilité. Des expériences in vitro et in vivo ont démontré que le FA-MoSe₂ Les @BSA NS ont présenté un excellent effet de ciblage des tumeurs, tout en fonctionnant simultanément comme agent photothermique NIR et radio-sensibilisateur pour une radiothérapie photothermique synergique sans toxicité pour les tissus sains.

Méthodes

Matériaux

FA-PEG₅₀₀₀ -NHS et CH₃ -PEG₅₀₀₀ -NHS ont été obtenus auprès de Shanghai Ponsure Biotech. Co. Ltd. Isothiocyanate de fluorescéine (FITC), albumine de sérum bovin (BSA, purifiée 98,0 %), MoSe en vrac₂ et le colorant Calcéine-AM (CA)-iodure de propidium (PI) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA). Le 4′,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été obtenu auprès d'Aladdin (Shanghai, Chine). Les réactifs de culture cellulaire ont tous été fournis par Corning Inc. Le kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) a été fourni par Dojindo Laboratories (Japon). L'anticorps γ-H2AX a été fourni par Millipore (Temecula, CA).

Préparation de FA-MoSe₂ @BSA NS

Premièrement, dans une procédure typique, 50 mg de MoSe₂ la poudre a été ajoutée dans les 25 ml d'eau distillée sous agitation de 20 minutes, puis a été soniquée dans un bain de glace en utilisant une sonication à pointe (Scientz-IID, 950  W, 25 kHz). La sonication a été pulsée pendant 2 s et 3 s d'arrêt pour une durée totale de sonication de 12 h avec une amplitude de 70 %. Après cela, le mélange a été centrifugé à 6 000 tr/min pendant 25 min. Le surnageant a été collecté et centrifugé à nouveau à 12 000 tr/min pendant 30 min, ce qui a donné du MoSe₂ nanopoints (MoSe₂ ND) solution. Ensuite, 25 mg de poudre de BSA ont été ajoutés dans le surnageant ci-dessus avec une légère agitation, formant des coacervats durcis après agitation pendant 6 h sous 25 °C et pH = 7,4, puis ont été traités par réticulation avec 0,5 % de glutaraldéhyde (250 μL). Ensuite, le glutaraldéhyde a été éliminé par dialyse dans l'eau pendant 1 jour, ce qui a donné le MoSe₂ @BSA nanosphères (MoSe₂ @BSA NS). Ensuite, MoSe₂ Les nanosphères @BSA ont été divisées en deux parties, l'une est mélangée avec du FA-PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg), et l'autre a été mélangé avec CH₃ -PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg) solution et agitée pendant 2 h. Enfin, la solution a été dialysée dans de l'eau pour obtenir du FA-MoSe₂ purifié. @BSA NSs et MoSe₂ Solution @BSA NSs. La solution préparée a été conservée à 4 °C. De plus, un spectromètre UV-VIS a été utilisé pour quantifier le FA sur le FA-MoSe₂ @BSA NS. En détail, après avoir mélangé MoSe₂ @BSA nanosphères avec FA-PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg) et en réagissant pendant 2 h, le mélange a été centrifugé pour éliminer le FA non lié. Le surnageant a été collecté pour la détection de l'absorption. La concentration en FA a été détectée par un spectromètre UV-vis à la longueur d'onde du pic d'absorption FA (280 nm). L'efficacité d'encapsulation FA (EE) a été calculée comme décrit dans l'équation suivante :

Caractérisations de FA-MoSe₂ @BSA NS

La morphologie des échantillons a été observée au microscope électronique à transmission (TEM, JEOL JEM2011, Tokyo, Japon) et au microscope électronique à balayage (SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan). Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Royaume-Uni) a été utilisé pour la taille et le potentiel zêta. Les spectres d'absorption ultraviolet-visible (UV-Vis) ont été enregistrés sur un spectrophotomètre ultraviolet-visible UV2550 (Shimadzu, Kyoto, Japon). Les spectres infrarouges à transformée de Fourier (FTIR) ont été détectés par un spectromètre FTIR (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Allemagne). La diffraction des rayons X sur poudre (XRD) des nanosphères a été enregistrée par un diffractomètre à rayons X (Seifert Jso-Debyerex-2002, Allemagne). La teneur en Mo dans les cellules et les tissus a été mesurée par spectrométrie d'émission atomique plasma à couplage inductif (ICP-AES, Hitachi P4010, Japon). Pendant l'irradiation NIR, la variation de la température a été enregistrée toutes les 30 s à l'aide d'un thermomètre à thermocouple (Fluke, États-Unis).

Culture cellulaire et absorption cellulaire

Des cellules de tumeur mammaire de souris 4T1 ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) et cultivées dans des milieux DMEM complétés avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C avec 5 % de CO₂ .

Pour l'absorption cellulaire, le FITC a été utilisé pour marquer les NS par absorption physique. Les cellules 4T1 ont adhéré à des lames de verre dans des plaques à 6 puits et ont été incubées avec du FITC libre, MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA, et FA-MoSe₂ @BSA NS à la même concentration de FITC (0,05 mg/mL) pendant 3 h, respectivement. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS et fixées par 0,2 mL de glutaraldéhyde, suivi d'une coloration au DAPI pendant 10 min. Les images de fluorescence des cellules ont été capturées à l'aide du microscope à balayage laser. Pour observer davantage l'absorption cellulaire, les cellules 4T1 (2 × 10 ⁵ cellules/puits) ont été cultivés dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits pendant 24 h, puis incubés avec du MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA, et FA-MoSe₂ @BSA NSs pour 3 h supplémentaires. Après cela, les cellules traitées ont été doucement lavées avec du PBS trois fois, homogénéisées et traitées avec 1 mL de solution d'eau régale pendant 4 h. ICP-AES a été utilisé pour détecter la teneur en Mo à l'intérieur des cellules. Ratio d'absorption =\( \frac{\mathrm{Ma}}{\mathrm{Mb}} \)× 100 %, où Ma est la masse du Mo à l'intérieur des cellules et Mb est la masse du Mo total ajouté.

Biocompatibilité in vitro

Tout d'abord, du sang total de souris saines a été collecté pour détecter l'hémolyse in vitro du FA-MoSe₂ @BSA NS. Dans le détail, les globules rouges (GR) ont été collectés par centrifugation. En rejetant les surnageants, les globules rouges collectés ont été mélangés avec FA-MoSe₂ @BSA NSs (en PBS, 1:4) à des concentrations prédéterminées (50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL et 400 μg/mL). En tant que contrôle positif ou négatif, les globules rouges ont été incubés avec de l'eau désionisée ou du PBS. Après avoir laissé incuber à 37 °C pendant 1 h, l'ensemble de suspensions ci-dessus a été centrifugé (10 000 tr/min, 1 min) et l'absorbance des surnageants à 541 nm a été contrôlée par un spectromètre UV-Vis. Le taux d'hémolyse a été calculé à l'aide de l'équation suivante.

où A _t , A _pc , et A _nc sont l'absorbance du surnageant à 541 nm de l'échantillon à tester, des contrôles positifs et négatifs, respectivement.

De plus, la cytotoxicité du MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ @BSA NSs a été détecté par un test CCK-8 standard. Cellules 4T1 (1 × 10 ⁵ cellules/mL, 0,5 mL) ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits et cultivées pendant 24 h. Après avoir jeté l'ancien support, un nouveau support contenant 0,01, 0,1, 0,15, 0,3 et 0,4 mg/mL de MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ Les NS @BSA ont été incubées avec des cellules 4T1 pendant 24 h. Du PBS a été utilisé pour laver doucement les cellules trois fois. Une solution de travail de 100 μL de CCK-8 (10 % de CCK-8  +   90 % de DMEM) a ensuite été ajoutée à chaque puits, suivie d'une incubation à 37 °C pendant 1 h. La valeur d'absorbance à 450 nm a été détectée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Labtech, Inc., Durham, Caroline du Nord).

Radiothérapie photothermique in vitro

Premièrement, les performances photothermiques in vitro des NS ont été étudiées. MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ @BSA NS avec les mêmes concentrations de Mo cultivées avec des cellules pendant 3 h puis irradiées par irradiation NIR pendant 5 min (808 nm, 1 W/cm ² ). La température des cellules traitées dans chaque puits a été détectée avec une caméra thermique infrarouge (Fluke TI25, USA), respectivement.

Ensuite, pour la thérapie photothermique in vitro, des cellules 4T1 adhérentes ont été cultivées avec différentes concentrations de MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ @BSA NSs pendant 3 h. Les NS à l'extérieur des cellules ont été retirées. Les cellules ont ensuite été traitées avec ou sans NIR (808 nm, 1 W/cm ² , 5 min) et différentes doses d'irradiation aux rayons X (RT, 0-5 Gy, 0,084 Gy/s). Après une autre incubation de 24 heures, la viabilité cellulaire a été détectée par un test CCK-8 standard. Les cellules traitées ci-dessus ont été encore co-colorées par calcéine-AM/PI pour détecter les cellules vivantes et mortes, puis imagées par un microscope confocal à balayage laser (calcéine-AM :Ex = 488 nm, Em = 515 nm ; PI :Ex =535 nm, Em = 617 nm). De plus, les cellules traitées ont également été analysées par immunofluorescence γ-H2AX. Après le traitement ci-dessus, les cellules ont été fixées par du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min et perméabilisées avec du méthanol pendant 15 min à - 20 °C et lavées avec du PBS. Ensuite, les cellules ont été mélangées avec un tampon de blocage (1% de BSA dans une solution de PBS) pendant 1 h à 25 °C et encore incubées avec l'anticorps monoclonal de souris anti-phospho-histone γ-H2AX (dilution 1:500) pendant une nuit à 4 ° C. Après lavage au PBS, la fluorescence des cellules a été observée au microscope confocal à balayage laser.

Modèle animal

Des souris nudes Balb/c (âgées de 5 à 8 semaines) ont été fournies par Charles River Laboratories (Pékin, Chine). Pour établir un modèle de tumeur 4T1 animal, 150 μL de 10 ⁶ les cellules en suspension ont été injectées par voie sous-cutanée dans le dos de la souris. Les souris ont été nourries en animalerie et observées tous les 2 jours. Toutes les procédures de bien-être et expérimentales de cette étude ont été réalisées conformément aux politiques du ministère national de la Santé et approuvées par le comité d'éthique du premier hôpital populaire de la ville de Shangqiu. Lorsque le volume tumoral a atteint 100 mm ³ , les souris ont été utilisées pour des expériences in vivo.

Biodistribution et circulation sanguine in Vivo

La biodistribution systémique des NS a été étudiée chez des souris porteuses de tumeurs 4T1. À 1 h, 1 jour, 7 jours et 24 jours après l'injection intraveineuse de MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ @BSA (10 mg/kg), la tumeur et les principaux organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) ont été pesés et digérés par une solution d'eau régale pendant 12 h. La teneur en Mo et Se dans ces tissus a été analysée par un ICP-AES. De plus, des souris Balb/c saines ont reçu une injection intraveineuse de FA-MoSe₂ @BSA (10 mg/kg). Environ 10 μL de sang de la queue de souris ont été collectés et analysés par un ICP-AES pour la circulation sanguine.

Radiothérapie photothermique in vivo

Pour la radiothérapie photothermique in vivo, les souris porteuses de tumeurs (n = 5 par groupe) ont été traités avec PBS + NIR, PBS + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, et FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT (avec 5 mg/kg de MoSe₂ ). La dose de radiothérapie était de 5 Gy. 24 h après l'injection intraveineuse, la région tumorale a été irradiée par 5 min d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² ). Pendant l'irradiation, les images thermiques des souris ont été enregistrées par caméra thermique infrarouge. Au cours des 30 jours suivants, la longueur et la largeur de la tumeur ont été surveillées tous les 4 jours. Le volume relatif de la tumeur a été calculé comme V /V ₀ , où V ₀ représente le volume tumoral au début du traitement. Pendant ce temps, le poids corporel de chaque souris a également été surveillé tous les 4 jours.

Biocompatibilité In Vivo

Pour la biocompatibilité in vivo, 150 μL de FA-MoSe₂ @BSA NSs (15 mg/kg) a été injecté par voie intraveineuse à des souris nude Balb/c saines. Avant l'injection et après 30 jours, le sang a été prélevé pour une numération globulaire complète, y compris les globules blancs (WBC), les globules rouges (RBC), l'hémoglobine (HGB), le volume plaquettaire moyen (MPV), l'hémoglobine globulaire moyenne (MCH), l'hématocrite (HCT), la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CMHC), le volume corpusculaire moyen (MCV) et les plaquettes (PLT). Dans le même temps, les souris ont été sacrifiées et le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins ont été collectés. Les organes obtenus ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4% et sectionnés en tranches de 5 μm et colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). Les sections colorées ont été imagées par un microscope numérique.

Analyse statistique

Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD. t de l'étudiant bilatéral test a été utilisé pour analyser la signification statistique de deux groupes. Les différences ont été considérées comme significatives pour *P < 0,05 et hautement significatif pour **P < 0,01.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation de FA-MoSe₂ @BSA NS

La procédure de préparation du FA-MoSe₂ @BSA NSs est représenté sur la Fig. 1a. En bref, MoSe₂ instable les nanodots ont été préparés à partir de MoSe₂ en vrac sous ultrasonication, puis stabilisé et assemblé par la protéine BSA, et conjugué simultanément à la molécule cible FA via des « ponts » PEG. Le MoSe₂ préparé Les ND étaient des nanopoints ultra-petits comme observés en MET (Fig. 1b). Le modèle XRD de MoSe₂ Les ND étaient affichés dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1. Le pic de diffraction à 13,1° appartient au plan (002), correspondant à la position du pic du MoSe en vrac₂ . Le pic distinct (002) indique l'existence de quelques couches dans l'axe c de MoSe₂ ND. Le pic de diffraction du plan (100) pour MoSe₂ Le ND s'élargit considérablement par rapport au MoSe₂ en vrac , qui peut provenir de la réduction de la taille de MoSe₂ ND [23]. Après assemblage et conjugaison avec la protéine BSA et FA, les nanocomposites ont formé des particules sphériques (Fig. 1c). Les spectres FTIR ont montré l'existence de la liaison -CONH- dans FA-MoSe₂ @BSA NSs, indiquant que FA était probablement conjugué sur MoSe₂ par liaison ester (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). De plus, nous avons quantifié l'AF sur le FA-MoSe₂ @BSA nanosphères, qui était de 10,5 ± 0,11%. L'analyse DLS a révélé que les diamètres moyens de MoSe₂ ND et FA-MoSe₂ Les NS @BSA étaient respectivement d'environ 3,8 nm et 139,8 nm (Fig. 1d). Après 7 jours de stockage, la taille de MoSe₂ Les ND sont passés de 3,8 à 63,2 nm, tandis que FA-MoSe₂ Les NS @BSA n'ont montré aucun changement évident de taille (Fig. 1e), indiquant une agrégation et la faible stabilité de MoSe₂ ND en stockage à long terme. De plus, lorsqu'il est dispersé dans différents milieux comme l'eau, le PBS et le milieu cellulaire, FA-MoSe₂ Les NS @BSA affichent une distribution de taille similaire (Fig. 1f). Ces résultats ont indiqué le FA-MoSe₂ @BSA NSs sont stables dans des conditions physiologiques et cette stabilité améliorée de MoSe₂ Les ND sont probablement attribuées à l'assemblage BSA et au revêtement PEG [24, 25]. Comme le montre la figure 1g, les spectres ultraviolet-visible (UV-Vis) de MoSe₂ ND et FA-MoSe₂ @BSA NSs avait des caractéristiques d'absorbance NIR similaires, indiquant que les modifications BSA et FA n'affectaient pas l'absorbance de MoSe₂ .

un Un schéma de FA-MoSe₂ @BSA NSs synthèse. b Image TEM de MoSe₂ ND. L'encart était l'image MET à haute résolution. c Les images MET et SEM de FA-MoSe₂ @BSA NS. d La distribution de taille de MoSe₂ ND et FA-MoSe₂ @BSA NS. e Le changement de taille de MoSe₂ ND et FA-MoSe₂ @BSA NS dans l'eau pendant 7 jours. f La distribution de taille de FA-MoSe₂ @BSA NS dans l'eau, le PBS et le milieu, respectivement. g Les spectres d'absorbance du MoSe₂ ND et FA-MoSe₂ @BSA NS

Effet photothermique de FA-MoSe₂ @BSA NS

La figure 2a montre que la température du FA-MoSe₂ La solution @BSA NSs a augmenté avec l'augmentation des concentrations (0-200 μg/mL). Après irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² ) pendant 5 min, le changement de température de FA-MoSe₂ La solution @BSA NSs à 200 μg/mL a atteint environ 41 °C, alors que la température de l'eau pure n'a augmenté que d'environ 1,5 °C dans les mêmes conditions. De plus, le changement de température de FA-MoSe₂ @BSA NSs irradiés sous différentes intensités de puissance (0,5 à 2,0 W/cm ² ) pendant 5 min a également été enregistré. Comme le montre la figure 2b, la température a augmenté jusqu'à un maximum de 40,6 °C avec l'augmentation de l'intensité de la puissance laser. La figure 2c illustre la photostabilité de FA-MoSe₂ @BSA NSs, ce qui implique que le FA-MoSe₂ @BSA NSs a conservé ses excellents effets photothermiques sans aucune atténuation de l'élévation de température après trois cycles d'irradiation NIR. Ces résultats ont démontré que FA-MoSe₂ @BSA NSs avait une photostabilité significative et d'excellentes propriétés photothermiques. Comme le montre la figure 2d, les valeurs de l'unité Hounsfield (HU) de FA-MoSe₂ Les images @BSA NS obtenues par tomodensitométrie (CT) étaient positivement corrélées avec leurs concentrations, indiquant que les NS pourraient potentiellement être utilisées comme radio-sensibilisateur.

un Courbes de chauffe photothermique du FA-MoSe₂ Solution @BSA NSs à différentes concentrations (0, 50, 100 et 200 μg/mL) sous irradiation laser à 808 nm à une densité de puissance de 1 W/cm ² . b Courbes de chauffe photothermique du FA-MoSe₂ Solution @BSA NSs à 100 μg/mL sous irradiation laser à 808 nm à différentes densités de puissance (0,5, 1, 1,5 et 2 W/cm ² ). c Variations de température du FA-MoSe₂ @BSA NS sous trois cycles d'irradiation laser à 808 nm à une densité de puissance de 1 W/cm ² . d Images CT (en médaillon) et valeurs HU de FA-MoSe₂ @BSA NS avec différentes concentrations

Captation cellulaire et biocompatibilité in vitro

Pour évaluer l'absorption cellulaire, MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ Les NS @BSA ont été étiquetées par le FITC. Comme le montre la figure 3a, une fluorescence FITC beaucoup plus forte a été observée à l'intérieur du cytoplasme dans FA-MoSe₂ Cellules traitées par @BSA NSs, comparées à celles de MoSe₂ @BSA NSs- et cellules traitées au FITC libres. L'analyse quantitative ICP-AES a montré une absorption cellulaire plus élevée de FA-MoSe₂ @BSA NSs que MoSe₂ @BSA NS (Fig. 3b). Ces résultats ont démontré que FA a amélioré l'absorption cellulaire de FA-MoSe₂ @BSA NS. Fait intéressant, après un blocage FA, le FA-MoSe₂ Les cellules traitées par @BSA NSs ont montré une fluorescence FITC verte plus faible à l'intérieur du cytoplasme par rapport à celle sans blocage de FA. Correspondant, le taux d'absorption cellulaire de FA-MoSe₂ @BSA NSs + cellules traitées par FA est inférieur à celui de FA-MoSe₂ Cellules traitées par @BSA NSs. Il indique que le récepteur FA sur la membrane cellulaire est entravé (par FA libre), à ​​son tour, réduit la capacité de ciblage et l'accessibilité de FA-MoSe₂ @BSA NS. Il démontre en outre que le récepteur FA est surexprimé dans les cellules 4T1 et que les NS FA-MoSe2@BSA pénètrent dans les cellules probablement par une voie d'endocytose médiée par le récepteur [26, 27].

un Images de fluorescence confocale de cellules 4T1 après incubation avec FITC libre et MoSe₂ marqué FITC @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + blocage FA, et FA-MoSe₂ @BSA NS. Les couleurs rouge et bleue représentent respectivement la fluorescence FITC et les noyaux cellulaires colorés au DAPI. b Analyse quantitative ICP-AES des cellules 4T1 vers MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + blocage FA, et FA-MoSe₂ @BSA NS

La biocompatibilité in vitro des NS a été évaluée par des analyses d'hémolyse et de cytotoxicité. La figure 4a n'a montré aucune hémolyse évidente pour FA-MoSe₂ @BSA Globules rouges (GR) traités par NSs ou GR traités par PBS. De plus, lorsque des concentrations allant jusqu'à 0,4 mg/mL de MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ Les NS @BSA ont été incubées avec des cellules pendant 24 h, il y avait moins de 10 % de suppression de la viabilité. Ces résultats suggèrent que le FA-MoSe₂ Les NS @BSA ont une excellente biocompatibilité in vitro.

un Taux d'hémolyse des globules rouges après 1 h d'incubation avec FA-MoSe₂ @BSA NS à différentes concentrations. L'encart montre la photographie de globules rouges exposés à de l'eau distillée, du PBS et du FA-MoSe₂ @BSA NS avec différentes concentrations suivies d'une centrifugation. b Viabilité cellulaire des cellules 4T1 après traitement avec vers MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ @BSA NS à différentes concentrations pendant 24 h

Radiothérapie photothermique in vitro

Comme le montre la Fig. 5a, b, cellules traitées avec FA-MoSe₂ Les NS @BSA ont montré la plus forte augmentation de température (ΔT = 23,6 °C) après 5 min d'irradiation NIR (808 nm, 1 W/cm ² ) par rapport à MoSe₂ Cellules traitées par @BSA NSs et PBS. La figure 5c a montré une amélioration de l'efficacité de la RT par l'ajout de FA-MoSe₂ @BSA NS. Avec des doses de rayons X croissantes, l'efficacité RT de FA-MoSe₂ @BSA NSs s'est beaucoup plus amélioré que celui de MoSe₂ @BSA NS. Il a été démontré que FA-MoSe₂ Les @BSA NS pourraient améliorer l'effet de la radiothérapie, probablement en raison de leur capacité d'atténuation des rayons X qui pourrait concentrer l'énergie des rayons X à l'intérieur des cellules tumorales et générer des électrons Auger secondaires, entraînant des dommages à l'ADN et la suppression de la croissance cellulaire [28, 29].

un Images thermiques de PBS, MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ Cellules traitées par @BSA NSs, et b les courbes de changement de température correspondantes sous irradiation continue avec un laser 808 nm (1 W/cm ² ). c Viabilité cellulaire des cellules 4 T1 traitées avec du PBS, MoSe₂ @BSA NSs, et FA-MoSe₂ @BSA NSs combinés avec différentes doses d'irradiation aux rayons X (0-5 Gy). d Viabilité cellulaire des cellules 4T1 traitées avec différents échantillons sous laser NIR 808 nm (5 min, 1 W/cm ² ) et irradiation aux rayons X (5 Gy)

Pour une évaluation plus approfondie de l'effet thérapeutique combiné de la RT et du PTT, les cellules 4T1 ont été traitées uniquement avec NIR ou RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, ou FA-MoSe₂ @BSA NS + NIR + RT. Comme le montre la figure 5d, FA-MoSe₂ Le groupe traité par @BSA NSs + NIR + RT a affiché la mort cellulaire dépendante de la concentration la plus significative, avec un taux de suppression de 92,8%. L'excellent effet thérapeutique du FA-MoSe₂ @BSA NSs était probablement dû à (1) l'ablation photothermique du PTT et des dommages à l'ADN par RT de FA-MoSe₂ @BSA NSs, et (2) le ciblage FA a amélioré l'internalisation cellulaire de FA-MoSe₂ @BSA NSs et donc la génération de plus de chaleur et de rayons X pour tuer les cellules.

Comme le montre la figure 6a, peu de cellules mortes ont pu être observées dans les groupes témoins PBS + NIR et PBS + RT. Même si des cellules mortes ont été trouvées dans FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT ou FA-MoSe₂ @BSA NSs + groupes NIR, mais les cellules vivantes existaient toujours. Inversement, dans le FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT group, plus de 95% des cellules ont été endommagées et ont montré une fluorescence rouge, indiquant que RT et PTT combinés de FA-MoSe₂ Les NS @BSA pourraient améliorer l'efficacité thérapeutique.

un Morts-vivants et b Images de coloration γ-H2AX de cellules 4T1 traitées avec PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, et FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectivement

Depuis FA-MoSe₂ Les NS @BSA ont une absorbance élevée des rayons X, il serait possible d'avoir la capacité d'améliorer la RT. Comme le montre la figure 6b, de très faibles niveaux de signaux γ-H2AX ont été observés dans les groupes traités au PBS, FA-MoSe₂ @BSA NS uniquement, et FA-MoSe₂ @BSA NSs + groupes traités NIR. Pendant ce temps, FA-MoSe₂ Le groupe traité @BSA NSs + NIR + RT a montré des niveaux plus élevés de signaux γ-H2AX, indiquant des dommages plus importants à l'ADN à l'intérieur des noyaux cellulaires. Ces résultats ont démontré que FA-MoSe₂ Les @BSA NS pourraient améliorer l'effet RT grâce à sa capacité d'atténuation des rayons X, qui concentrerait l'énergie des rayons X à l'intérieur des cellules tumorales et générerait des électrons secondaires et Auger pour endommager l'ADN et supprimer la croissance cellulaire [30–32].

Biodistribution et circulation sanguine in vivo

Comme le montrent les Fig. 7a, b, 24 h après l'injection, les éléments Mo et Se se sont accumulés dans la tumeur, à l'exception du foie et des reins. Le contenu des éléments Mo dans le tissu tumoral post-injections de MoSe₂ @BSA NSs et FA-MoSe₂ Les NS @BSA ont également été évaluées. Comme le montre la figure 7c, les niveaux de Mo dans le tissu tumoral pour FA-MoSe₂ Le groupe traité par @BSA NSs a augmenté avec le temps et a atteint le pic 24h après l'injection, ce qui était supérieur à celui de MoSe₂ @BSA NSs-treated group. Figure 7d shows the blood circulation curve of Mo at different time point post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs. The Mo t _1/2 α (blood distribution half-life) and t _1/2 β (blood terminal elimination half-life) of the FA-MoSe₂ @BSA NSs group are 0.91 ± 0.06 h and 16.96 ± 1.3 h, respectively. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe₂ @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.

Le a Mo and b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. c Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. d Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs

In Vivo Photothermal Radiotherapy

As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm ² ) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe₂ @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe₂ was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe₂ @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe₂ @BSA NSs (Fig. 8d).

un In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). b The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectively. **P  < 0.01 vs control group and other groups

In Vivo Biocompatibility

As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe₂ @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.

un H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe₂ @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). b Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe₂ @BSA NSs

Conclusions

In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe₂ @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe₂ @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe₂ NDs, FA-MoSe₂ @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe₂ @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.

Abréviations

BSA :

Sérum albumine bovine

FA:

Folic acid

MoSe₂ :

Molybdenum selenide

NDs:

Nanodots

NIR :

Near infrared

NSs:

Nanospheres

PEG :

Polyéthylène glycol

PTT :

Thérapie photothermique

RT :

Radiotherapy