Nanoalginates via la synthèse de micelles inverses :encapsulation de la doxorubicine et cytotoxicité du cancer du sein

Contexte

L'encapsulation de charges utiles thérapeutiques offre de nombreux avantages par rapport à l'administration systémique de médicaments libres dans la circulation sanguine. L'augmentation du temps de circulation [1,2,3], la protection contre les protéines plasmatiques [4] et la toxicité systémique inférieure [5, 6] obtenues par l'administration de nanocarriers peuvent améliorer considérablement l'efficacité thérapeutique. De plus, la perméabilité et la rétention améliorées des tumeurs solides peuvent être exploitées pour le ciblage passif si les agents thérapeutiques sont encapsulés dans des supports de la taille ou du type approprié [7,8,9]. De nombreux agents thérapeutiques ont été incorporés dans des nanosupports, notamment la doxorubicine (DOX) [6, 10,11,12], le cisplatine [13, 14] et le paclitaxel [15,16,17]. En outre, de nombreuses technologies de support, telles que les liposomes [18,19,20,21], les supports à base de polymères [15, 22,23,24,25] et les nanoparticules lipidiques [26,27,28,29], ont commencé ayant un impact sur les résultats cliniques. Cependant, la traduction de nouvelles formulations est souvent entravée par des défis dans la préparation et le traitement de ces composés. Nous présentons ici une méthode simple, fiable et robuste de production de nanosupports d'alginate biocompatibles capables d'encapsuler des agents chimiothérapeutiques hydrophiles.

Les biopolymères ont été utilisés pour encapsuler des produits thérapeutiques en partie en raison de leur facilité d'utilisation et de leur nature biocompatible [30]. Les polymères utilisés comprennent l'alginate [31, 32], l'héparine [33, 34], le chitosan [35, 36] et le carraghénane [37, 38], entre autres. L'alginate, un polymère d'origine naturelle, est composé de quantités variées de résidus -d-mannuronate et α-1-guluronate liés par des liaisons 1,4-glycosidiques [39] (blocs M et G, respectivement). L'alginate peut être réticulé par addition de cations multivalents, dont le calcium est couramment utilisé [40,41,42]. La présence de calcium peut conduire à la formation de structures emballées plus grandes entre les blocs G liés, appelées structures « boîte à œufs » [43]. La réticulation des brins d'alginate en solution crée un hydrogel. D'autres polymères, tels que le chitosane [43,44,45], influencent les propriétés structurelles de la particule. Les groupes hydroxyle et acide carboxylique sur les chaînes alginate confèrent une charge globale négative aux structures assemblées du polymère [14, 46]. En liant les acides carboxyliques et en formant une matrice tridimensionnelle, les thérapeutiques peuvent être piégées.

La doxorubicine est une chimiothérapie largement utilisée dans le traitement de divers cancers [47]. Le principal mécanisme d'action de la doxorubicine implique l'association avec des enzymes associées à la réplication, ce qui permet l'intercalation dans les brins d'ADN. Il est également capable d'insertion directe dans le brin d'ADN. Il en résulte une perturbation du processus de réplication, qui empêche la prolifération cellulaire, et conduit à l'apoptose [48]. En plus de ce mécanisme, la doxorubicine est associée à la génération d'espèces réactives de l'oxygène dans la cellule [48, 49]. La doxorubicine est très efficace [6, 50], mais a des effets toxiques graves impliquant plusieurs organes, notamment le cœur [51, 52], le cerveau [53], le foie [47] et les reins [54]. L'encapsulation peut entraîner une réduction de la toxicité systémique, le Doxil liposomal devenant un succès bien connu [7].

L'alginate est une substance peu coûteuse, biocompatible, biodégradable et facile à trouver, et est généralement considérée comme non immunogène [55, 56]. Des nanoparticules d'hydrogel formées d'alginate réticulé ont été utilisées pour l'encapsulation de diverses thérapeutiques [56]. Ces processus varient de la formation de micelles inverses induite par les surfactants [39] à des stimuli mécaniques ou à la formation de particules induite par la température [41]. Nous présentons un moyen simple et robuste de produire des nanosupports d'alginate relativement monodispersés. Ce procédé de synthèse est réalisé à température ambiante (contrairement à celui présenté par Machado et al.) et peut être réalisé en quelques heures seulement. Le procédé micellaire inverse incorpore des agents thérapeutiques solubles dans l'eau dans la matrice d'alginate, sans nécessiter de modification chimique. Les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) des nanoparticules d'alginate ont montré des distributions uniformes de particules ~ 80-90 nm. La microscopie électronique a confirmé les tailles et la morphologie sphérique grossière des particules. La doxorubicine encapsulée dans la matrice d'alginate des nanoparticules montre une efficacité in vitro distincte par rapport à la doxorubicine libre, indiquant que de futures études pourraient étudier l'efficacité de la thérapeutique in vivo.

Méthodes

Matériaux

L'alginate de sodium, le chlorure de calcium dihydraté, le cyclohexane (99,9 %) et la dodécylamine (98 %) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Le chlorhydrate de doxorubicine a été acheté auprès de MedChem Express (Monmouth Junction, NJ). Ces réactifs ont été utilisés tels quels, avec dissolution de l'alginate de sodium et des agents thérapeutiques dans l'eau comme indiqué. Toute l'eau était de l'eau filtrée de 18 MΩ provenant d'une source Milli-Q.

Préparation de nanoalginates

L'alginate de sodium a été dissous dans un flacon en verre à 15 mg/mL dans de l'eau et mélangé via une barre d'agitation pendant au moins 30 min avant utilisation. La DOX était dissoute dans cette phase aqueuse si elle devait être incorporée dans le nanosupport. La solution d'alginate a été vérifiée pour la dissolution complète de la poudre d'alginate avant utilisation dans la synthèse. Sans introduction d'un cation multivalent, la phase aqueuse d'alginate reste homogène pendant des semaines. Huit millilitres de cyclohexane ont été pipetés dans un flacon. La dodécylamine, un solide à température ambiante, a été chauffée sous eau chaude pendant quelques minutes, jusqu'à ce qu'une partie du solide ait été convertie en forme liquide. Ensuite, 80 μL de dodécylamine ont ensuite été pipetés dans le cyclohexane. Un barreau d'agitation a été ajouté au flacon en verre, et le mélange a ensuite été agité à 125 tr/min. Après 5 min de mélange, la phase organique a été considérée comme bien mélangée et prête pour l'ajout de la phase aqueuse. Vingt microlitres de la phase aqueuse d'alginate ont été ajoutés à la phase organique cyclohexane/dodécylamine. La vitesse d'agitation a été augmentée à 1200 tr/min. Le mélange s'est produit sous agitation constante pendant 20 min. Trente microlitres d'une solution de chlorure de calcium 50 mM ont ensuite été ajoutés au mélange. Après 25 minutes de mélange/gélification des particules, 2 ml d'eau ont été ajoutés au mélange, créant une couche aqueuse sous la couche organique. Les nanoparticules se sont séparées dans la phase aqueuse et une pipette de 1 mL a été utilisée pour éliminer la couche aqueuse.

Purification de NALG

La couche aqueuse a été centrifugée dans une unité de filtration centrifuge de 100 kDa (Pall) pendant 10 min à 3 200 × g dans une centrifugeuse pour éliminer les gros agrégats, et le perméat a été transféré dans une unité de 10 kDa (Millipore). La solution a ensuite été centrifugée pendant 5 min à la même vitesse pour filtrer les petites impuretés. De l'eau a été ajoutée et centrifugée pendant 5 minutes pour laver le rétentat. Le volume final de 1 mL a été collecté et la caractérisation a été effectuée sur ce produit.

Caractérisation du NALG

La solution filtrée de nanoparticules a été transférée dans une cuvette (Malvern Instruments, DTS 1070 zeta cell) pour une mesure de diffusion dynamique de la lumière. La distribution des tailles a été déterminée en utilisant un Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, Royaume-Uni). Les mesures de taille ont été effectuées à l'aide d'un laser à longueur d'onde de 633 nm à 25 °C avec une méthode de détection d'un angle de rétrodiffusion de 173°. Les mesures du potentiel zêta pour les nanoparticules d'alginate ont été effectuées dans la même cuvette immédiatement après la mesure de la taille. Les mesures de la taille et du potentiel zêta ont été effectuées en triple, et les résultats présentés indiquent la moyenne  ±  déviation standard des trois essais. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour confirmer la taille des nanoparticules et étudier leur morphologie. Les images MET ont été acquises à l'aide d'un microscope électronique à transmission Technai F-20 fonctionnant à 4200 eV. La préparation des grilles TEM impliquait le dépôt goutte à goutte de 10 μL de solution de nanoparticules post-filtrée sur la surface de cuivre de la grille MET à support formavar/carbone (Ted Pella). Des grilles TEM humides ont été placées couvertes dans un dessiccateur pendant la nuit avant l'imagerie pour assurer un séchage approprié.

La doxorubicine a une fluorescence intrinsèque, qui peut être utilisée pour comparer la fluorescence des nanoparticules d'alginate de doxorubicine (NALG-DOX) à une courbe standard de DOX pour estimer sa concentration. Nous avons utilisé des longueurs d'onde d'excitation/émission de 470/550 nm. La libération de doxorubicine à partir de solutions NALG-DOX a été déterminée en dialysant la solution de nanoparticules filtrée finale dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4 ou un tampon citrate à pH 5,5. Deux ensembles de cinq lots de NALG-DOX ont été préparés comme décrit précédemment, avec une concentration initiale de DOX de 1,25 mg/mL dans la phase aqueuse d'alginate. Dix-huit dispositifs de dialyse Slide-A-Lyzer MINI (ThermoFisher) avec un volume interne de 100 μL et un seuil de poids moléculaire de 2 kDa ont été préparés en ajoutant 100 μL de NALG-DOX à chaque dispositif. Chaque dispositif a été placé dans un flacon à scintillation contenant 20 ml de tampon. Une barre d'agitation a été ajoutée à chaque flacon contenant du tampon, et tous les flacons ont été placés sur une plaque d'agitation pour une agitation douce pendant la durée de l'expérience. Les flacons ont été couverts pour réduire la perte de tampon par évaporation et pour les protéger de la lumière. À chaque instant (1, 2, 4, 24, 48, 72 h), trois dispositifs ont été retirés, 100 μL de l'échantillon ont été retirés de chaque dispositif et placés dans un puits séparé, et une mesure de fluorescence a été effectuée sur un Tecan Lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG) à 470/550 nm. Les mesures de fluorescence ont été comparées aux mesures d'une courbe standard et aux aliquotes initiales prises avant l'expérience pour déterminer la concentration et la quantité de perte de DOX dans le tampon.

Culture cellulaire et dosage

Des cellules murines de cancer du sein, la luciférase Bioware Ultra Green Cell Line 4T1/protéine fluorescente verte (4T1-luc2-GFP, adénocarcinome de souris) et aucune cellule rapporteur 4T1 n'ont été obtenues auprès de PerkinElmer (Waltham, MA). Ces cellules ont été maintenues avec du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum bovin foetal (FBS) et de 1 % de pénicilline/streptomycine dans un mélange à 5 % de CO₂ incubateur fonctionnant à 37 °C. Les cellules 4T1 ont été ensemencées à 4000 cellules/puits dans une plaque inférieure transparente à 96 puits à paroi noire. Vingt-quatre heures après l'ensemencement dans les puits, le milieu initial a été aspiré et la formulation médicament/milieu a été introduite.

Imagerie de fluorescence

À 48 h, le milieu a été aspiré, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et du formol a été ajouté aux puits. Après 30 min d'incubation à température ambiante, les cellules ont à nouveau été lavées trois fois avec du PBS, et deux gouttes de réactif ReadyProbes à cellules fixes NucBlue (ThermoFisher) par millilitre de milieu ont été ajoutées aux puits. Après 1 h d'incubation à température ambiante, les cellules ont été à nouveau lavées trois fois avec du PBS. Ensuite, 100 μL de PBS ont été ajoutés aux cellules fixées et les plaques ont été transférées vers un système d'imagerie cellulaire automatique EVOS FL (ThermoFisher). Un objectif × 20 a été utilisé pour imager des parties de certains puits dans chaque plaque. Une image de chaque canal de fluorescence a été enregistrée séparément; une image bleue pour le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), une image rouge pour la DOX (utilisant le canal RFP pour capturer la fluorescence intrinsèque) et une image verte pour la GFP. Les cellules 4T1-luc2-GFP expriment la protéine fluorescente verte, donc aucune coloration supplémentaire n'a été nécessaire pour que les cellules soient visibles dans le canal vert. Le traitement DOX « tache » les cellules et aucun autre réactif n'est nécessaire pour le visualiser dans le canal rouge. Les images ont été ajustées en luminosité/contraste dans ImageJ.

Test de viabilité des cellules vivantes/mortes

L'évaluation qualitative de la viabilité des cellules 4T1 après coincubation avec NALG, DOX et NALG-DOX a été évaluée à l'aide d'un test de viabilité des cellules LIVE/DEAD (ThermoFisher). 72 h après l'introduction du milieu chargé de médicament, le milieu a été aspiré et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Le test LIVE/DEAD a été réalisé en ajoutant deux gouttes de chaque compte-gouttes de NucBlue Live Reagent et NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) par millilitre de milieu. Trois autres lavages avec du PBS ont été effectués après 30 min d'incubation, et du formol a été ajouté aux puits pour fixer les cellules. Trois autres lavages avec du PBS ont suivi le formol, et une quantité finale de 100 μL de PBS a été ajoutée à chaque puits. Une imagerie similaire a été réalisée comme indiqué, mais le canal vert indiquait maintenant la présence de cellules mortes, car les membranes cellulaires compromises permettaient au réactif vert de pénétrer dans la cellule.

Test de viabilité des cellules vivantes/mortes

L'évaluation quantitative de la viabilité des cellules 4T1 après coincubation avec NALG, DOX et NALG-DOX a été évaluée à l'aide du test de viabilité cellulaire Alamar Blue (ThermoFisher). 72 h après l'introduction du média chargé de drogue, le média a été aspiré. Le dosage Alamar Blue a été réalisé en ajoutant 10 μL de réactif Alamar Blue dans chaque puits avec 100 μL de nouveau milieu et incubé pendant 1 h à 37 °C. Après 1 h, la viabilité cellulaire a été déterminée pour chaque puits à l'aide d'un lecteur de microplaques Tecan Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG). Les longueurs d'onde d'excitation/émission ont été réglées sur 560/590, les réglages de gain optimaux ont été déterminés pour la plaque par le logiciel et un protocole de lecture de fond a été utilisé pour lire l'intensité de fluorescence pour chaque puits de la plaque. Le % de viabilité cellulaire peut être déterminé à partir de la lecture de l'intensité de fluorescence via l'équation :

Résultats et discussions

Procédé d'émulsion micellaire inverse

Dans ce travail, un support de médicament nanoalginate, NALG, a été préparé via un processus d'émulsion micellaire inverse, comme illustré sur la figure 1. De l'alginate aqueux a été ajouté à une phase huileuse de cyclohexane/dodécylamine, qui forme les micelles inverses. L'alginate a ensuite été réticulé par addition de chlorure de calcium (CaCl₂ ) Solution. Une fois le temps écoulé pour permettre la réticulation de l'alginate au sein des micelles inverses, les NALG ont été extraites par addition d'eau. Enfin, les filtres centrifuges ont éliminé les contaminants latents et aidé à réduire la distribution de la taille des nanoparticules. Le produit final était une solution colloïdale aqueuse transparente.

Processus de formulation pour la formation de NALG et NALG-DOX. un Représentation schématique du processus de synthèse micellaire inverse. Les chaînes d'alginate aqueux sont réticulées en bain organique (en haut), extraites en phase aqueuse (en bas à gauche), puis filtrées pour purification (en bas à droite). b Interaction moléculaire du Ca ²⁺ réticulation, conduisant à la formation de NALG. c Photographie de synthèse en différents points, de gauche à droite, émulsion avant CaCl₂ addition, émulsion après CaCl₂ addition et séparation lors de l'addition d'eau

Les composants du système d'émulsion micellaire inverse ont été déterminés sur la base de données expérimentales et de la littérature antérieure. Pour réduire les degrés de liberté dans le système, nous avons choisi le cyclohexane pour la phase organique. Dans l'optimisation de ce processus, nous avons testé une gamme de tensioactifs pour leur capacité à former des particules d'alginate à l'échelle nanométrique indiquées par une augmentation de la turbidité du mélange organique lors de l'introduction d'une petite quantité de phase aqueuse tout en agitant. La dodécylamine était un candidat approprié et a été choisie comme tensioactif à utiliser pour l'avenir. L'eau a été choisie comme phase aqueuse dans les expériences présentées ici.

Caractérisation de NALG

Dans les Fig. 2a, b, la distribution des tailles hydrodynamiques des nanoparticules pour NALG et NALG-DOX est montrée. Les nanoparticules, qu'elles soient vides ou chargées thérapeutiquement, ont montré des pics similaires centrés autour de 90 nm. Les diamètres des particules pour NALG et NALG-DOX, respectivement, étaient de 92,2 ± 4,2 nm et 82,8   ± 3,6 nm. L'indice de polydispersité (PDI) pour les particules était de 0,320 ± 0,063 et 0,204 ± 0,044, et les potentiels étaient de − 15,0 ± 0,8 mV et 7,2 ± 4,6 mV.

Distributions dynamiques de diffusion de la lumière de a NALG et b NALG-DOX montre des distributions monodisperses de nanoparticules d'alginate. Images de microscopie électronique à transmission de c NALG et d NALG-DOX montre la morphologie sphérique des particules. Les barres d'échelle indiquent 50 nm dans l'image plus grande et 20 nm en médaillon

Les tailles des particules étaient cohérentes lors de l'incorporation de la DOX dans la matrice d'alginate. Le potentiel ζ était négatif pour le NALG vide, ce qui était cohérent avec d'autres nanoparticules d'alginate liées par le calcium [39]. Les particules chargées de doxorubicine possédaient un potentiel ζ positif. Cela pourrait être dû en partie à un excès d'ions calcium chargés positivement à la surface de la particule, ce qui peut aider à conférer la charge positive à la nanoparticule. De plus, l'amine primaire présente sur les molécules de DOX peut interagir électrostatiquement avec les groupes acides carboxyliques libres de l'alginate, réduisant les charges négatives disponibles à la surface de la particule.

La figure 2c, d montre des images de microscopie électronique à transmission de NALG et NALG-DOX réticulées par le calcium. Les deux types de nanoparticules présentent une morphologie sphérique. La distribution générale des nanoparticules semble être de taille similaire à la distribution DLS. La concentration de la solution finale de NALG-DOX a été évaluée en utilisant la fluorescence intrinsèque de la molécule de doxorubicine. Le volume du produit NALG-DOX filtré a été divisé en trois ensembles de dispositifs de dialyse placés dans des flacons à scintillation remplis de PBS et on a laissé la DOX se libérer plusieurs fois du NALG-DOX. Initialement, la concentration de DOX dans la solution de NALG-DOX était d'environ 4 μg/mL, ce qui indique que l'efficacité d'encapsulation, ou le rapport de la DOX dans la NALG-DOX à la DOX initiale ajoutée à la formulation, pour la NALG-DOX est d'environ 7 %. Bien que cette efficacité d'encapsulation soit considérée comme faible par rapport à des particules similaires [57], cela est probablement dû à la DOX initiale présente dans la phase aqueuse. Nous n'avons pas itéré sur la formulation en abaissant la quantité de DOX présente dans la phase aqueuse initiale et avons émis l'hypothèse que l'efficacité pourrait être améliorée en abaissant la quantité de DOX dans la formulation initiale. La DOX non encapsulée passe probablement par les lavages de filtre de 3 kDa à la fin de la synthèse. Avec la disponibilité et le coût relativement bas de la doxorubicine, nous avons choisi de « saturer » la formulation avec de la DOX, sachant que de grandes quantités de la DOX restante passeraient probablement sans être encapsulée. L'augmentation de l'efficacité d'encapsulation pourrait améliorer cette plate-forme de particules dans les travaux futurs.

La courbe de libération pour le NALG-DOX à pH 5,5 et 7,4 peut être trouvée sur la figure 3. Le NALG-DOX conserve environ 70 % de la charge utile DOX au cours des 4 premières heures, 90 % quittant les particules au bout de 24 h. , à pH 7,4. Ce schéma de libération est courant pour les matériaux polymères [57, 58] et démontre une libération contrôlée au cours des 24 premières heures lorsqu'ils sont exposés au réservoir de PBS. À un pH inférieur de 5,5, plus similaire au pH que les nanoparticules verraient lors de l'absorption cellulaire dans un endosome tardif [59], la DOX est libérée à un rythme plus rapide. C'est un comportement souhaité, car une libération plus lente est nécessaire lors de la circulation générale dans le sang, mais dans le microenvironnement tumoral acide, une libération plus rapide est préférée.

La libération de doxorubicine à partir d'une solution de nanoparticules montre une libération contrôlée au cours des 24 premières heures dans du PBS, pH 7,4. Une libération plus rapide de la doxorubicine se produit à un pH de 5,5. Chaque point représente la moyenne ± écart type de n = 3 mesures

Captation cellulaire de DOX

L'absorption de NALG-DOX par les cellules cancéreuses du sein de souris 4T1 à 48 h est illustrée aux figures 4a, b. Chaque ligne indique un canal de couleur distinct et la ligne du bas montre l'image composite de tous les canaux de couleur. Dans la colonne de gauche, une forte concentration de DOX ou de NALG-DOX est utilisée, ce qui est suffisant pour éliminer la plupart des cellules. La colonne du milieu montre une concentration de 0,31 μg/mL pour la DOX et de 0,28 μg/mL pour la DOX dans le NALG-DOX, ce qui montre un certain potentiel de destruction des cellules, et la colonne de droite montre les cellules non traitées. Les cellules de l'image centrale montrent la doxorubicine (rouge) autour et chevauchant le noyau (bleu) des cellules. Le nombre de cellules est réduit dans les deux premières colonnes des panneaux a et b en raison de la présence de la DOX, qui a inhibé la prolifération cellulaire par rapport aux puits non traités. La doxorubicine fonctionne par intercalation dans l'ADN nucléaire [12], et la colocalisation de la doxorubicine et du noyau pourrait indiquer qu'elle fonctionne par ce mécanisme lors de l'absorption. Sur la figure 4b, la doxorubicine encapsulée est distincte à la périphérie de la zone nucléaire. La colonne de droite montre les cellules non traitées sans signal significatif détecté dans le canal rouge. La DOX libre, bien que puissante, infligerait une toxicité hors cible et aurait des temps de circulation réduits in vivo. L'encapsulation permet une libération plus régulière sur un temps de circulation accru, ce qui rend NALG-DOX potentiellement meilleur in vivo, et pourrait être exploré dans des travaux futurs.

Microscopie à fluorescence d'images de cellules de cancer du sein 4T1-luc2-GFP fixées traitées à la doxorubicine (DOX) (a ) et NALG-DOX (b ) après 48 heures d'exposition. Les barres d'échelle indiquent 100 μm. Coloration nucléaire bleue :DAPI; vert (lignée cellulaire transfectée) :GFP; rouge (fluorescence moléculaire intrinsèque) :DOX

Cytotoxicité du NALG-DOX

En tant que test de base pour le potentiel de destruction cellulaire, les cellules 4T1 non traitées et les cellules traitées avec NALG-DOX ont été colorées avec un test de cellules LIVE/DEAD (ThermoFisher) et fixées après 72 h d'exposition. Un exemple d'image d'un puits non traité, d'un puits traité avec du NALG, d'un puits traité avec 0,078 μg/mL de DOX et d'un puits traité avec 0,20 μg/mL de NALG-DOX, est présenté respectivement sur la Fig. 5a–d. Le chevauchement vert montré sur les figures 5c, d indique que le traitement DOX et NALG-DOX dans ces puits conduit à la mort de nombreuses cellules dans ce puits. Les cellules n'étaient pas capables de proliférer de la même manière que dans les puits traités aux nanoparticules non traités et vides montrés sur les figures 5a, b en raison de la présence de la thérapeutique. La dilution des nanoparticules utilisées pour le dosage dans NALG et NALG-DOX était identique.

Le test de fluorescence LIVE/DEAD montre peu ou pas de mort cellulaire dans les cellules 4T1 non traitées (a ) et dans les cellules traitées par NALG (b ). L'intensité du signal du canal vert (coloration des cellules mortes) est forte dans une grande partie des cellules traitées avec 0,078 μg/mL de DOX (c ) et 0,20 μg/mL de NALG-DOX (d ), indiquant la mort cellulaire. Les barres d'échelle indiquent 100 μm. Les concentrations indiquent la quantité de DOX, libre ou en particules. Dosage de NALG dans (b ) à la même densité de particules que dans NALG-DOX

L'évaluation quantitative de la viabilité cellulaire des cellules 4T1-luc2-GFP après une exposition de 72 heures à la NALG, à la DOX libre et à la NALG-DOX via le test Alamar Blue (ThermoFisher) est illustrée à la Fig. 6. À la Fig. 6a, la doxorubicine libre -les cellules traitées ont montré des cellules moins viables sur toute la plage de concentration que les cellules traitées par NALG-DOX (pour une concentration équivalente de DOX). Ceci est en outre affiché par l'IC₅₀ valeurs ou concentration nécessaires pour montrer un effet inhibiteur de 50 %, qui étaient de 0,093 μg/mL et 0,45 μg/mL, pour la DOX libre et la NALG-DOX respectivement. La valeur de la DOX libre est similaire à celle trouvée à 72 h contre les cellules 4T1 par Du et al. [60]. L'IC₅₀ les valeurs sont similaires à celles trouvées par Eliaz et al. avec de la DOX et de la DOX encapsulée dans des liposomes à 72 h contre des cellules de mélanome B16F10 [61].

Viabilité cellulaire des cellules 4T1-luc2-GFP après 72 h d'exposition à NALG-DOX et DOX (a ) et NALG (b ) à différentes concentrations. Les points de données et les barres d'erreur indiquent la moyenne  ± l'écart type par rapport à n = 3 puits. Les concentrations indiquent la quantité de DOX, libre ou en particules, dans (a ). En b , les puits de NALG ont été dosés à partir des mêmes concentrations de particules que NALG-DOX, indiquant peu ou pas de mort cellulaire due au transporteur de médicament seul

Une concentration plus élevée de doxorubicine est nécessaire pour que le NALG-DOX montre un effet similaire à celui du médicament libre. Ceci devrait être prévu, car le produit thérapeutique encapsulé est plus entravé dans son transport vers son site d'effet. La doxorubicine encapsulée présentait toujours des effets inhibiteurs cellulaires, ce qui signifie que soit le médicament est toujours thérapeutiquement actif, soit la nanoparticule elle-même est toxique pour les cellules. Pour tester cela, la viabilité de NALG a été évaluée d'une manière similaire à NALG-DOX. Le NALG a montré une toxicité minimale à toutes les concentrations, comme le montre la figure 6b, indiquant que le médicament est efficace.

Conclusions

Nous avons développé une plate-forme micellaire inverse capable de produire des nanoparticules d'alginate sphériques d'une taille d'environ 90 nm. L'absorption de NALG-DOX a été examinée dans des cellules de cancer du sein 4T1-luc2-GFP et a montré une absorption distincte à des emplacements proches du noyau lorsqu'elles sont encapsulées dans le support d'alginate. La toxicité cellulaire du médicament libre par rapport au médicament encapsulé a été comparée en examinant l'IC thérapeutique₅₀ valeurs. La doxorubicine encapsulée a montré une toxicité inférieure par rapport à son homologue médicamenteux libre. Ces NALG-DOX peuvent être d'un grand intérêt à des fins d'administration de médicaments, car les effets hors cible de la doxorubicine seraient réduits dans le dosage systémique de la forme encapsulée. Les futures formulations seront optimisées pour des profils de libération contrôlée plus lents et une encapsulation accrue. Ce processus facile fournit une voie de synthèse efficace qui peut être complétée en quelques heures seulement, permettant une caractérisation plus poussée, in vitro et in vivo de procéder rapidement.

Abréviations

4T1-luc2-GFP :

4T1 luciférase/protéine fluorescente verte

CaCl₂ :

Chlorure de calcium

DAPI :

4′,6-Diamidino-2-phénylindole

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

DOX :

Doxorubicine

NALG :

Nanoparticules d'alginate

NALG-DOX :

Nanoparticules d'alginate de doxorubicine

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

PDI :

Indice de polydispersité

TEM :

Microscopie électronique à transmission