Propriétés de préparation et antibiofilm des films composites d'oxyde de zinc/alumine anodique poreuse

Contexte

Comme nous le savons, les bactéries peuvent adhérer aux surfaces solides et former un biofilm glissant dans des environnements appropriés [1]. Habituellement, les biofilms bactériens adhèrent fermement aux surfaces des matériaux, tels que l'acier inoxydable [2], le caoutchouc [3], le verre [4] et le polystyrène [5]. Le biofilm entraînerait la corrosion des équipements [6] et la contamination des aliments [7], entraînant d'énormes pertes économiques. De nombreuses études ont indiqué que l'adhérence du biofilm est affectée par les propriétés de la surface du matériau, telles que la rugosité [8,9,10,11], la microstructure [12, 13], l'hydrophilie [14,15,16,17] et les constituants antibiotiques [18,19,20]. Bohinc et al. [10] ont souligné que l'adhérence bactérienne augmenterait avec la rugosité de surface du verre. Singh et al. [12] ont démontré qu'une rugosité de surface élevée peut améliorer l'adsorption des protéines et accélérer l'adhésion bactérienne et la formation de biofilm. Bonsaglia et al. a découvert que Listeria monocytogenes adhèrent mieux aux surfaces hydrophiles (par exemple, l'acier inoxydable et le verre) qu'aux surfaces hydrophobes (par exemple, le polystyrène) [14]. D'autres études ont également prouvé que la surface hydrophobe n'était pas bonne pour l'adhésion du biofilm [16, 17]. Certaines études ont montré que les constituants antibiotiques pouvaient inhiber la formation de biofilm [18,19,20]. Trois cent quatre surfaces en acier inoxydable contenant du Cu ont d'excellentes propriétés antibactériennes et antibiofilm, tirant parti de l'activité antimicrobienne de l'élément Cu [18]. En bref, les propriétés de surface sont cruciales pour les propriétés antibiofilm des matériaux.

Les matériaux en aluminium ont été largement utilisés et l'alumine anodique poreuse (AAP) a attiré plus d'attention dans les domaines de la fonction électrique légère, de la fonction catalytique et de la fonction de détection ces dernières années [21,22,23,24], et son activité antimicrobienne a été signalé. Ferraz et al. [24] ont rapporté que le PAA peut induire l'activation adhérente des monocytes/macrophages en raison de leur phase matricielle et de leur nanoporosité.

De plus, les films minces d'oxyde de zinc (ZnO) ont été étudiés comme un excellent matériau antibactérien et antifongique. L'adhérence de Pseudomonas aeruginosa aux films de ZnO avec des structures de surface de nanotiges était plus faible que celle du verre et du ZnO pulvérisé, et plus de P. aeruginosa sont tués dans les films de ZnO [25]. Pendant ce temps, une recherche a souligné que les surfaces recouvertes de ZnO limitaient considérablement la formation de biofilm et que la génération de radicaux hydroxyles jouait un rôle clé dans l'activité de l'antibiofilm mais pas l'existence d'ions zinc [26]. De plus, les films composites de ZnO peuvent être utilisés dans de nombreux domaines pour restreindre la formation de biofilms et auront de bonnes perspectives d'application dans la préservation des produits aquatiques [27]. Le ZnO est hydrophile, tandis que les films hydrophobes sont bons pour restreindre l'adhérence du biofilm. Ainsi, il est nécessaire d'améliorer les propriétés hydrophobes du film de ZnO.

Les produits aquatiques sont très périssables en raison de leur détérioration microbienne [28]. Dans des conditions de stockage aérobie, Pseudomonas spp. et Shewanella putrefaciens sont connus comme des organismes d'altération dominants [29]. Shewanella putrefaciens a une nature psychrotrophe et peut réduire la triméthylamine-N -oxyde en triméthylamine [30]. Alors, Shewanella putrefaciens seront utilisées comme bactéries indicatrices dans cet article.

Les microstructures des films de ZnO seraient différentes en raison de leur base PAA, puis les propriétés antibiofilm seraient affectées. Dans ce travail, des films de ZnO ont été préparés sur PAA avec une morphologie différente et modifiés pour améliorer l'hydrophobie. Les propriétés antibiofilm de Shewanella putrefaciens des films composites ZnO/PAA ont été étudiés. Les résultats offrent une valeur potentielle pour les applications dans les emballages alimentaires, les équipements de transformation des aliments et les autres domaines des matériaux fonctionnels antibactériens.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Tous les réactifs utilisés dans cette étude étaient analytiquement purs. L'eau désionisée et stérile a été utilisée pour préparer des solutions avec une conductivité inférieure à 0,5 mS/cm. Shewanella putrefaciens L'ATCC8071 a été acheté auprès de l'American Type Culture Collection. Des feuilles d'aluminium de 0,3 mm d'épaisseur avec une pureté d'aluminium supérieure à 99,99 % ont été achetées auprès de Shengshida Metal Materials Co., Ltd. (Chine).

Préparation de films composites ZnO/PAA

Préparation de films d'alumine anodique poreuse (PAA)

Une feuille d'aluminium de haute pureté a été découpée en petites dimensions de 10 × 30 mm ² et a été poli avec une pâte à polir de 50 nm de silice par un polissoir (WV80, Positec Machinery Co., Ltd., Chine) et a été dégraissé par ultrasons dans de l'acétone à 53 kHz, 280 W pendant 15 min (SK8210HP, Kudos Ultrasonic Instruments Co. Ltd ., Shanghaï). Ensuite, les feuilles ont été lavées deux fois à la fois avec de l'éthanol et de l'eau, respectivement. Les feuilles d'aluminium prétraitées ont été utilisées comme anode, la feuille de graphite de surface égale comme cathode et la solution d'acide oxalique à 0,3 mol/L comme électrolyte. La première anodisation a eu lieu dans les conditions de 30 °C et 40 V pendant 90 min. Après cela, les feuilles d'aluminium ont été immergées dans la solution mélangée de 6,0 % en poids de H₃ Bon de commande₄ et 1,8 % en poids de H₂ CrO₄ à 60 °C pendant 4 h pour éliminer les couches d'alumine. La deuxième anodisation a ensuite été réalisée dans les mêmes conditions mais pendant 0, 40, 60 et 80 min, respectivement. Les films d'alumine anodique poreuse (PAA) avec un modèle de port différent ont été obtenus.

Préparation de films composites ZnO/PAA

Tout d'abord, le volume égal de solution d'éthanol d'acétate de zinc à 0,02 mol/L et de solution d'éthanol de NaOH à 0,04 mol/L ont été mélangés sous agitation rapide à 70 °C pendant 5 min, puis les films PAA (feuilles d'aluminium) ont été immergés dans la solution mélangée. sous un degré de vide de - 0,085 MPa. Ensuite, la solution a été chauffée à ébullition. Après qu'il soit devenu un sol bleu mince, les feuilles d'aluminium ont été retirées et rincées avec de l'eau désionisée. Ensuite, les échantillons ont été séchés sous vide à - 0,085 MPa, 80 °C pendant 6 h, et les films composites ZnO/PAA ont été préparés après calcination à 480 °C pendant 2 h dans une atmosphère d'air. Les poudres d'oxyde de zinc ont été préparées simultanément. Enfin, les films composites ZnO/PAA et les poudres ont été modifiés par une solution d'éthanol à 1,0 % en poids de Si69 à 65 °C pendant 2 h puis séchés sous vide à - 0,085 MPa, 40 °C pendant 12 h.

Caractérisation des films composites ZnO/PAA

La diffraction des rayons X des poudres d'oxyde de zinc a été réalisée à l'aide d'un diffractomètre de poudre à rayons X (Rigaku Ultima IV, Rigaku, Japon) au pas de 0,02° et 2θ plage de 10° à 80° avec un rayonnement CuKa de 40 kV, 50 mA. Les changements thermiques et la perte de poids des échantillons ont été analysés par un analyseur thermique thermogravimétrique/différentiel (TG/DTA, Perkin Elmer Diamond). Les spectres infrarouges à transformée de Fourier (FT-IR) ont été enregistrés avec un spectromètre proche FT-IR Scimitar 2000 (Agilent, américain) dans la plage de 4000 à 400 cm ⁻¹ . Les micrographies de surface des films PAA et des films composites ZnO/PAA ont été imagées par microscopie électronique à balayage à émission de champ (FESEM, S-4800, Hitachi, Japon). Les morphologies des nanoparticules rasées des films composites ZnO/PAA sont mesurées par microscopie électronique à transmission à émission de champ (FETEM, Jem-2100F, JEOL, Japon) et la diffraction électronique à zone sélectionnée (SAED, Jem-2100F, EOL, Japon) de la des échantillons ont été examinés. Les angles de contact avec l'eau (CA) des films composites (avant/après modification) ont été mesurés par la méthode de la goutte sessile à plusieurs positions différentes sur chaque surface d'échantillon en utilisant des gouttelettes de 3,0 μL d'eau déionisée (SL200B, États-Unis).

Les propriétés antibiofilm des films composites ZnO/PAA

Culture de Shewanella putrefaciens Biofilm

La suspension bactérienne d'activation secondaire Shewanella putrefaciens (OD₅₉₅ ≈ 0,5) et de l'eau peptonée alcaline (APW) de 3% (m/v) NaCl ont été mélangés uniformité par le rapport de 1:200 (v /v ). Des films composites ZnO/PAA (0,5 × 0,5 cm) ont été immergés dans les inoculums dilués de 3 mL et incubés à 28 °C pendant un certain temps. Sous cette condition, Shewanella putrefaciens a bien grandi et a montré une forte capacité de prolifération.

Test d'adhérence de Shewanella putrefaciens Biofilms sur films composites ZnO/PAA

Après culture en suspension bactérienne de Shewanella putrefaciens pendant un certain temps, les films composites ZnO/PAA avec biofilm ont été transférés dans d'autres tubes à centrifuger stériles et lavés trois fois avec 1 mL de solution stérile de NaCl à 0,85% (m/v) pour éliminer les bactéries libres. Le biofilm a été coloré avec 1 mL de 0,2 %w/w cristal violet pendant 15 min à température ambiante et a été lavé trois fois avec 1 mL de solution stérile de NaCl à 0,85 % (m/v) pour éliminer le cristal violet redondant. Ensuite, les biofilms colorés ont été dépouillés par ultrasons dans 33 % (v /v ) acide acétique de 200 μL à 53 kHz, 280 W pendant 10 min. L'OD₅₉₅ (densité optique à 595 nm) de la solution ci-dessus a été enregistrée par un lecteur de microplaques VICTOR™ X3 (Perkin Elmer, America) dans les plaques de microtitration à 96 puits. Les résultats ont été présentés sous forme de « moyennes  ±  écarts-types » de l'expérience trois fois parallèle.

Dosage de la numération bactérienne totale de Shewanella putrefaciens Biofilm sur films composites ZnO/PAA

Les films composites ZnO/PAA avec biofilm ont été lavés trois fois avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4 ; 137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂ HPO₄ , et 1,8 mmol/L de KH₂ Bon de commande₄ ) pour déloger les bactéries flottantes, et les biofilms colorés ont été dépouillés par ultrasons dans 10 mL de PBS stérile à 53 KHz, 280 W pendant 10 min. Par la suite, le nombre total de bactéries dans les biofilms a été mesuré par la méthode de comptage sur plaque. Avec l'expérience trois fois parallèle, les résultats ont été présentés sous forme de « moyennes  ±  écarts-types » et la courbe de croissance de la colonie des bactéries du biofilm a été tracée.

La mesure micrographique de Shewanella putrefaciens Biofilms

Après élimination des bactéries flottantes, les films composites ZnO/PAA avec biofilm ont été immergés dans 2,5% (w /v ) glutaraldéhyde à 4 °C pendant 4 h. Par la suite, les échantillons ont été déshydratés toutes les 30 min avec 50, 70, 80 et 90 % (v /v ) éthanol, respectivement. Après avoir été plongés dans l'alcool éthylique absolu pendant 1 h, les échantillons ont été naturellement séchés à l'air sur une paillasse propre. Les micrographies de surface des échantillons ont été imagées par FESEM (S-4800, Hitachi, Japon) après pulvérisation d'or recouverte à 3 kV pendant 40 s.

La mesure CLSM de Shewanella putrefaciens Biofilms

Les films composites ZnO/PAA avec biofilm ont été lavés trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH = 7,4) pour éliminer les bactéries flottantes, et les échantillons ont été colorés à l'obscurité pendant 15 min dans la solution mixte de 0,01 % en poids. orange d'acridine (AO, Sigma, Amérique) et 0,1% en poids d'iodure de propidium (PI, Sigma, Amérique). Après cela, les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS pour déloger la solution de teinture redondante, et l'humidité excessive a été délogée. Dix microlitres d'agents de scellement anti-fluorescence (Biosharp BL701A, Chine) ont été déposés sur les biofilms et les échantillons ont été stockés à 4 °C sans lumière. Les proportions de cellules vivantes et mortes des biofilms ont été observées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (CLSM, TCS-SP5 II, Allemagne Leica Instrument Co., Ltd.) [31, 32].

Résultats et discussion

Caractérisation des films ZnO

Caractérisation XRD des poudres de ZnO préparées par procédé sol-gel

Les propriétés antibactériennes et antibiofilm de l'oxyde de zinc sont affectées par sa structure cristalline [33, 34]. La figure 1 montre que la structure cristalline des échantillons est transformée après calcination. Avant les calcinations, les échantillons sont contenus dans la structure wurtzite hexagonale de ZnO. La diffraction culmine à 31,70°, 34,52°, 36,31°, 47,68°, 56,82°, 62,92° et 67,92° de 2θ correspondent aux plans cristallins (100), (002), (101), (102), (110), (103) et (112) d'oxyde de zinc (PDF # 36-1451, a) = b = 3.250 et c = 5.207), respectivement. Les larges pics de diffraction indiquent une faible cristallinité et de petites particules de ZnO. Pendant ce temps, des pics moins impurs révèlent l'intermédiaire dans l'échantillon. Après calcination à 230 °C, les pics impurs disparaissent et le bruit mesuré diminue, mais la largeur des pics de diffraction est invariable. Cela signifie que l'intermédiaire disparaît et que le degré du cristal augmente. Avec l'augmentation de la température de calcination, les pics de diffraction du ZnO s'accentuent, indiquant que la cristallinité augmente et que les particules cristallines grossissent.

Schémas XRD des poudres d'oxyde de zinc calcinées à différentes températures

Uniquement de l'eau liée à partir de Zn(CH₃ COO)₂ ·2H₂ O est produit dans la solution éthanolique de Zn(CH₃ COO)₂ , et l'hydrolyse de CH₃ COO ⁻ est inhibé. Premièrement, le Zn(CH₃ COO)₂ est hydrolysé et produit le produit intermédiaire.

4Zn(CH₃ COO)₂ ·2H₂ O → Zn₄ O(CH₃ COO)₆ + 2CH₃ COOH + 3H₂ O(1)

Dans le processus de chauffage, le collosol est facilité par la solution éthanolique de NaOH, et l'effet stérique spatial du CH₃ COO ⁻ est d'une grande importance pour la stabilité du collosol de ZnO. Pendant ce temps, la réaction neutre de CH₃ COOH avec NaOH arrive.

5Zn₄ O(CH₃ COO)₆ + 22NaOH + 13H₂ O → 4Zn₅ (OH)₈ (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O + 22CH₃ COONa(2)

CH₃ COOH + NaOH→CH₃ COONa + H₂ O(3)

Spanhel et Anderson [35] ont indiqué que les alcogels d'oxyde de zinc sont formés à partir de grains de ZnO par agrégation et croissance d'Ostwald (vieillissement). Ensuite, l'intermédiaire de Zn₅ (OH)₈ (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O est chauffé et décomposé en phase ZnO [36, 37]. Ainsi, la structure wurtzite hexagonale du ZnO est à la base de la gélatine séchée avant les calcinations.

Zn₅ (OH)₈ (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O → 5ZnO + 2CH₃ COOH + 5H₂ O(4)

Hosono et al. [37] ont confirmé ce mécanisme réactionnel. La solution éthanolique de Zn(CH₃ COO)₂ ·2H₂ O s'est transformé en produits colloïdaux lors du chauffage à 60 °C, et les résultats XRD montrent que le produit sec de la gélatine est un mélange de ZnO cristallin et de Zn5(OH)₈ (CH₃ COO)₂ ·2H₂ O. Après 48 h de reflux, les particules se transforment en wurtzite ZnO.

Analyse TG/DTA

Le résultat TG/DTA de la gélatine à l'oxyde de zinc est illustré à la figure 2 et la courbe TG pourrait être divisée en trois étapes. Dans la première étape, la perte de masse est de 68,6 % de la température ambiante à 100 °C, et un pic endothermique existait à 62 °C. Il correspond au solvant éthanol perdu et à l'eau dans la gélatine d'oxyde de zinc. Dans la deuxième étape, la perte de masse n'est que de 3,8% de 100 à 400 °C. Les résultats XRD montrent que l'impureté a disparu, la cristallinité accrue et la croissance des particules cristallines après calcination à 230, 280 et 360 °C, respectivement. Une petite quantité de perte de masse peut être la perte d'eau interstitielle et la transition de l'impureté. De 400 à 850 °C, il n'y a pas de perte de masse et de pic endothermique, indiquant l'absence de transformation cristalline à ce stade. Pendant ce temps, le résultat XRD montre que le cristal se développe après calcination à 480 °C. Les résultats de TG/DTA sont cohérents avec les résultats XRD.

Graphiques TG/DTA pour la gélatine à l'oxyde de zinc

Caractérisation FT-IR des films d'oxyde de zinc non modifiés/modifiés

La figure 3 montre les spectres FT-IR des films de ZnO modifiés non modifiés et hydrophobes. Les larges pics à 3 600-3 300 cm ⁻¹ sont attribuées à la vibration d'étirement de −OH et au pic à 1651 cm ⁻¹ est attribuée à la vibration de flexion de –OH, respectivement, indiquant l'eau absorbée et l'eau capillaire dans les échantillons [38]. Les pics à 2360 et 2328 cm ⁻¹ sont attribués au dioxyde de carbone dans l'air. Les pics à 2943 et 2864 cm ⁻¹ sont dues à des vibrations d'étirement asymétriques et symétriques de −CH₂ , respectivement. Le pic le plus fort à 1475 cm ⁻¹ est attribuée à la vibration de flexion dans le plan ou à la vibration de cisaillement de −CH₂ groupes [39], et le pic à 895 cm ⁻¹ est attribuée aux vibrations d'étirement des groupes Si-O [40]. Les pics à environ 440 et 414 cm ⁻¹ sont attribuées à la vibration de charpente des groupes Zn-O du ZnO non modifié/modifié [41]. Les résultats indiquent que la modification fait rompre les liaisons –S–S– de Si69 et que le triéthoxysilylpropyle est greffé sur les échantillons, de sorte que les propriétés hydrophobes des films de ZnO augmentent. Wang [42] a rapporté que la dispersion de nano-ZnO pouvait être améliorée par la modification in situ de Si69 et Si69 greffés à la surface de particules de nano-ZnO par réaction chimique. Ceci est cohérent avec nos résultats d'analyse.

Spectres FT-IR des films d'oxyde de zinc non modifiés/modifiés

Analyse des micromorphologies des films PAA

Les morphologies des films PAA sont affectées par le deuxième temps d'oxydation anodisé. Comme le montre la figure 4, après avoir retiré les couches d'alumine de la première anodisation, le film PAA est un cadre en nid d'abeille hexagonal serré avec des nanopores de 5 à 10 nm (Fig. 4a). Après une anodisation en deux étapes pendant 40 min, les nanopores sont transformés en cadres de coques multicouches (Fig. 4b). Après une anodisation en deux étapes pendant 60 min, les cadres de la coque multicouche s'estompent et le diamètre des nanopores est agrandi à 20-40 nm, tandis qu'il y a des crêtes à la surface (Fig. 4c). En prolongeant le temps d'anodisation en deux étapes à 80 min, les nanopores sont agrandis à 60-70 nm et les crêtes disparaissent (Fig. 4d).

Images SEM de l'alumine anodique poreuse (PAA) avec différents temps de seconde durée d'anodisation a 0 min, b 40 min, c 60 min, et j 80 minutes

Selon la théorie de la dissolution assistée par champ acide (AFAD) [43], au cours du processus d'anodisation, les films d'oxyde de la couche barrière sont devenus non uniformes et les crêtes se sont formées. À ces points, la formation et le développement du microporeux sont favorisés par l'AFAD aggravée. Avec le prolongement du deuxième temps d'anodisation, les trous ordonnés et traversants se forment progressivement à la surface, puis les cadres et les arêtes de la coque multicouche ont disparu (Fig. 4b–d). Le résultat est similaire à celui de Reddy, qui a préparé du PAA via un processus d'anodisation en deux étapes dans 0,3 mol/L d'acide oxalique [44].

Analyse des micromorphologies des films de ZnO

Les propriétés d'antobiofilm des surfaces des matériaux sont affectées par leur morphologie et leurs substances [12]. Comme le montre la figure 5, les morphologies des films de ZnO sont significativement différentes qui sont préparées sur les films PAA avec différents temps de deuxième durée d'anodisation. Sur les surfaces du film PAA avec des nanopores de 5 à 10 nm, les grosses particules agglomérées de 20 à 30 nm sont densément attachées et ont formé des films de ZnO épais (Fig. 5a). Sur la surface du film PAA qui est préparé par une durée d'anodisation en deux étapes pendant 40 min, les cadres de coque multicouches sont restés sur le film ZnO (Fig. 5b). Comme le montre la figure 5c, les particules de ZnO ont été attachées au squelette du film PAA et ont formé des trous plus grands. Sur l'échantillon avec des nanopores de 60 à 70 nm, les particules de ZnO de 10 à 20 nm sont fixées au bord des trous du PAA, et une partie des particules est entrée dans les nanopores (Fig. 5d). Cela peut être le collosol entrant dans les plus grands trous sous vide et former ensuite les particules de ZnO. Les résultats ci-dessus indiquent que plus le diamètre des nanopores du PAA est petit, plus le taux de collage du ZnO est élevé. Wu et al. [45] considèrent que les particules de collosol se forment facilement sur la paroi des trous en raison du négatif des particules de sol et du positif des parois des pores de PAA. Le résultat est également conforme à l'étude de Bousslama et al. [46]. Le collosol se fixe juste à la paroi des trous lorsque le film PAA est immergé dans le sol de zinc pendant 24 h, puis les trous sont pleins pendant 48 h, indiquant que les particules de collosol se fixent préférentiellement à la paroi des trous.

Images SEM des films ZnO préparés sur PAA avec différents temps de durée d'anodisation en deux étapes a 0 min, b 40 min, c 60 min, et j 80 minutes

Les résultats ci-dessus montrent que les particules de collosol pénètrent facilement dans de grands trous et se fixent à la surface interne sous vide ; cependant, les particules de collosol ne se fixent qu'aux squelettes des surfaces extérieures du PAA avec les petits trous.

Les images MET du film de ZnO rasé du film composite ZnO/PAA sont illustrées à la Fig. 6. Sur la surface de PAA préparée uniquement par anodisation en une étape, les particules de ZnO délaminées mesurent environ 10 nm, mais les particules de 20-30 nm sont montrés dans l'image SEM (Fig. 5a), indiquant que les particules de ZnO sont agglomérées. Sur la surface PAA préparée par anodisation en deux étapes, les particules de ZnO délaminées mesurent environ 20 nm et une partie des particules est agglomérée aux emplacements individuels. Il se manifeste que les particules de ZnO sont d'abord fixées au bord des trous du PAA (Fig. 6c, e, f).

Images TEM (a , c , e , f ) et modèles SAED (b , d ) des films ZnO préparés sur PAA avec différents temps de durée d'anodisation en deux étapes a , b 0 min c , d 40 minutes ; e 60 minutes ; et f 80 minutes

Les plans de réseau (100), (101), (102), (110) et (103) de la structure de wurtzite hexagonale ZnO sont représentés dans les motifs SAED (Fig. 6b, d), indiquant que ZnO est une wurtzite hexagonale. Les résultats coïncident avec l'analyse XRD.

Caractérisation de l'hydrophobie-hydrophilie de la surface du film de ZnO

Pour diminuer l'adhérence bactérienne des matériaux, les films de ZnO préparés avec une micromorphologie différente sont traités pour améliorer l'hydrophobie, et l'angle de contact avec l'eau de la surface du film mince avant et après modification est indiqué dans le tableau 1.

Avant modification, les films de ZnO sont hydrophiles en raison des groupes hydroxyles de surface sur les particules de ZnO. L'hydrophilie est la meilleure en raison de sa structure poreuse préparée sur une surface PAA avec une durée d'anodisation en deux étapes de 40 min. Pour les autres échantillons avec une durée d'anodisation en deux étapes de 60 et 80 min, les hydrophilies diminuent progressivement en raison de la faible quantité d'adhésif de ZnO. Pour l'échantillon avec une durée d'anodisation en une étape, la faible hydrophilie est due à sa structure non poreuse.

Après modification, les films de ZnO sont traduits en hydrophobes. D'après l'analyse FT-IR, le triéthoxysilylpropyle est greffé sur les échantillons après rupture des liaisons –S–S– de Si69. Pendant ce temps, cela pourrait être le résultat de sa structure poreuse et de plus de particules de ZnO; le film a la plus haute hydrophobie avec une durée d'anodisation en deux étapes de 40 min.

Caractérisation de Shewanella putrefaciens Biofilms

Chi et al. [47] ont rapporté que l'aluminium anodisé n'a aucune activité antibactérienne contre les bactéries Gram-négatives (Escherichia coli et P. aeruginosa ) et des bactéries Gram-positives (Streptococcus faecalis et Staphylococcus aureus ). Cependant, le ZnO a une excellente activité antibactérienne et antibiofilm [25,26,27], et il existe une corrélation positive entre l'activité antibactérienne et antibiofilm [48, 49]. De plus, les propriétés antibactériennes du ZnO sont affectées par sa microstructure [50, 51]. Afin d'obtenir une excellente surface d'activité antibiofilm, les films ZnO avec différentes microstructures ont été préparés sur des films PAA avec différents temps de deuxième durée d'anodisation, et les propriétés antibiofilm ont été mesurées.

L'adhérence des biofilms et les courbes de croissance des bactéries du biofilm

La formation et le développement du biofilm bactérien peuvent être conclus en cinq étapes :l'adhésion réversible des bactéries à la surface initialement; le passage de l'adhésion réversible à l'adhésion irréversible; la formation initiale du biofilm; le développement du biofilm mûri; et la dégénérescence du biofilm et le retour des bactéries à l'état planctonique [52].

Comme le montre la figure 7(1), en 2 heures, l'adhérence de Shewanella putrefaciens le biofilm sur les films de ZnO augmente rapidement, illustrant la conversion de l'adhésion réversible des bactéries à l'adhésion irréversible. De 2 à 12 h, l'adhérence du biofilm augmente progressivement, ce qui est le stade de croissance du biofilm. De 12 à 24 h, l'adhérence du biofilm augmente ou diminue légèrement, manifestant le stade de maturité du biofilm. Après 24 h, l'adhérence du biofilm diminue et les biofilms entrent dans la phase de dégénérescence. La figure 7(2) montre que la tendance à la variation des bactéries du biofilm s'accorde avec l'adhérence du biofilm, indiquant que le développement du biofilm dépend des bactéries du biofilm.

L'adhésion de Shewanella putrefaciens biofilm (1 ) et courbe de croissance des colonies des bactéries du biofilm (2 ) sur les films ZnO préparés sur PAA avec différents temps de durée d'anodisation en deux étapes (a) 0 min, (b) 40 min, (c) 60 min et (d) 80 min

De plus, pour le film de ZnO préparé sur la surface du PAA avec une durée d'anodisation en deux étapes pendant 80 min, l'adhérence du biofilm et la quantité totale de bactéries du biofilm sont les plus élevées parmi les quatre échantillons. Cependant, pour le film de ZnO préparé sur la surface PAA avec une durée d'anodisation en deux étapes pendant 40 min, la propriété antibiofilm est optimale. Cela pourrait être dû à l'adhérence du biofilm qui est inhibée par l'hydrophobie la plus élevée, puis à moins d'exopolysaccharides (EPS) et à l'autre nutriment contre la croissance du biofilm bactérien. Pour le film de ZnO préparé sur la surface PAA avec une durée d'anodisation en deux étapes pendant 80 min, son hydrophilie est bonne pour l'adhérence initiale du biofilm, et moins de particules de ZnO n'inhibent pas la croissance des bactéries du biofilm. Pendant ce temps, davantage de matériaux adhésifs de biofilm nourrissent les bactéries du biofilm, et les bactéries du biofilm se multiplient rapidement. Conformément à nos recherches, l'adhérence du biofilm est inhibée par l'hydrophobie plus élevée du film de ZnO au stade initial de la formation du biofilm [49]. L'adhérence des biofilms est affectée par les propriétés hydrophobes et hydrophiles des matériaux [14, 53, 54]. Bonsaglia et al. [14] ont rapporté que L. monocytogenes adhèrent plus facilement à la surface hydrophile qu'à la surface hydrophobe. De nombreuses études ont montré que l'adhésion bactérienne est réduite ou inhibée par la surface hydrophobe [47, 54]. Shaer et al. [54] indicated that the biofilm colonization on the functionalizing orthopedic hardware could be prevented by hydrophobic polycations. Chen et al. [55] also suggested that the biofilm could be inhibited by low surface free energy. The results matched those from us.

The Morphological Characteristics of Shewanella putrefaciens Biofilm

The microtopographies of Shewanella putrefaciens biofilm at various stages are shown in Fig. 8.

SEM images of the biofilms on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

After cultivated for 2 h, there are less adhesive materials on the ZnO film prepared on PAA without two-step anodization (a) and with two-step anodization duration for 40 min (b), but more adhesive materials and a few bacteria on the other two (c, d). It is indicated that the anti-adhesive properties of the former two are better than the latter two, it is consistent with Fig. 7. After cultivated for 12 h, more and more EPS and bacteria are attached to ZnO films, signifying the rapid growth of the biofilm. At 24 h, the EPS films are thickened gradually and biofilm bacteria grew well, indicating mature biofilms. At 36 h, the deciduous EPS films and dead bacteria illustrate the biofilm degenerating stage.

According to the antibacterial mechanisms of dissolved metallic ions, the dissolved zinc ions are combined with active proteinase of bacteria, make proteinase lose its bioactivity, and damage its bacterial cells to death [34, 56]. Thus, the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to the latter two (c, d) due to their plentiful ZnO particles on the films. Xie [57] and Jones [58] also thought that the antibacterial abilities strengthened with the dosage increasing of ZnO particles. Meanwhile, the adhesive materials and bacteria on the sample (d) are all more than the others, according to the analysis of adhesion of Shewanella putrefaciens biofilm and colony growth curve of the biofilm bacteria (Fig. 7). Feng et al. [59] found that the hypha of Escherichia coli easily reached into the PAA pores with diameters of 50 and 100 nm, and the biofilm accumulated and adhered to the surface of PAA. However, there is no hypha of Shewanella putrefaciens could be observed in our study. It can be inferred that the optimal antibiofilm properties are ascribed to the lower hydrophobicity of ZnO film in the initial stage of the biofilm formation.

The CLSM Characteristics of the ZnO/PAA Composite Biofilms

As shown in CLSM images, the live Shewanella putrefaciens bacteria are green, and the dead ones are red (Fig. 9). The black images indicate that the counts of live bacteria on the surfaces are few after biofilm cultivation for 2 h. Biofilm bacteria multiply rapidly, and the counts of live bacteria are significantly increased with the cultivation time. More dead bacteria are observed in the former two (a, b) at 24 h and in all samples at 36 h. The counts of dead bacteria of the latter two (c, d) are less than that of the former two (a, b). The results indicate that the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to that of the latter two (c, d), which is according to the previous analysis.

CLSM images biofilms formed on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

Conclusions

In this work, the PAA films with different microstructures were prepared by two-step anodic oxidation first, and then the ZnO/PAA composite films are prepared by sol-gel. The ZnO films are hydrophilic due to the surface hydroxyl group on the ZnO particles. After being modified by Si69, the ZnO films translate to hydrophobicity because of its hydrophobic group. The antibiofilm properties of the ZnO films are affected by the hydrophobicity and amount of ZnO particles. The hydrophobicity inhibits the initial adherence of the biofilm and less EPS and the other nutrient against the growth of biofilm bacteria. So, the antibiofilm properties of the ZnO/PAA film are optimal which are prepared on the PAA surface with two-step anodization duration for 40 min because of its super-hydrophobicity and plenty of ZnO particles.

Abréviations

AO:

Acridine orange

CA:

Water contact angle

EPS:

Exopolysaccharides

FT-IR :

Fourier transform infrared spectrometer

PAA:

Porous anodic alumina

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

PI:

Propidium iodide

SAED :

Diffraction électronique à zone sélectionnée

SEM :

Microscopie électronique à balayage

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TG/DTA:

Thermogravimetric/differential thermal analyze

XRD :

X-ray diffusion