Comparaison entre l'acide folique et la fonctionnalisation à base de peptide gH625 de nanoparticules magnétiques Fe3O4 pour une internalisation cellulaire améliorée

Contexte

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une interface dynamique entre le sang et le cerveau qui joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie du système nerveux central (SNC). Les principaux composants de la BHE sont les cellules endothéliales (c'est-à-dire les astrocytes et les péricytes), qui forment une feuille continue recouvrant la surface interne des microvaisseaux du cerveau. Ils sont interconnectés par des jonctions serrées, qui sont essentielles à la fois au contrôle de la perméabilité vasculaire de la BHE [1] et à la protection du cerveau contre diverses toxines circulantes et autres molécules nocives [2, 3]. Les neurones et la microglie, qui sont d'autres composants de l'unité neurovasculaire, jouent un rôle différent dans la BHE [4, 5].

En raison de la feuille continue de cellules endothéliales, 98 % des médicaments à petites molécules et 100 % des médicaments à grosses molécules ne traversent pas la BHE, échouant ainsi à délivrer les médicaments au tissu cérébral [6]. Par conséquent, afin de développer des systèmes d'administration efficaces pour le traitement de nombreuses maladies du cerveau, il est crucial d'étudier la capacité des porteurs à traverser la BHE [7].

Au cours de la dernière décennie, les systèmes à base de nanoparticules ont été largement étudiés en tant qu'agents thérapeutiques efficaces pour le ciblage et la thérapie du cancer. Dans ce contexte, les nanoparticules de fer magnétiques organiquement fonctionnalisées (MNPs) ont suscité beaucoup d'intérêt car elles combinent la polyvalence de la fonctionnalisation de surface avec les propriétés magnétiques et la nature biocompatible non toxique de leur noyau. Les MNP sont largement adoptées pour les applications théranostiques (diagnostiques et thérapeutiques) telles que le tri et la manipulation des protéines et des cellules [8, 9], le marquage cellulaire [10, 11], l'administration de médicaments contrôlés magnétiquement [12, 13], l'imagerie par résonance magnétique (IRM) [14, 15] et hyperthermie [16,17,18,19]. Pour être efficacement utilisées pour des applications biomédicales, les MNP doivent être capables de traverser les membranes cellulaires et, en particulier, de traverser les différentes barrières biologiques. La modification de la surface des MNPs avec des molécules fonctionnelles a souvent été utilisée pour améliorer leur internalisation cellulaire, mais dans de nombreux cas, le croisement de la BHE reste un problème.

Dans ce contexte, l'utilisation de peptides pénétrant dans les cellules (CPP), un groupe de peptides relativement courts (5 à 40 acides aminés) provenant soit de sources naturelles, soit de constructions synthétiques, qui peuvent facilement traverser la bicouche membranaire, peut être observée. comme une approche prometteuse. Parmi les nombreux CPP disponibles, le peptide à 20 résidus gH625, dérivé de la glycoprotéine H (gH) du virus Herpes simplex 1, a récemment été développé et utilisé pour traverser la BHE afin d'améliorer l'absorption d'une variété de cargaisons [20, 21] dans le cytosol.

Dans la présente étude, les MNP ont été fonctionnalisés avec deux classes différentes de revêtements de ciblage basés à la fois sur une couche de couplage d'acide 3-aminopropylphosphonique (NH₂ -PENNSYLVANIE). Les deux revêtements ont été obtenus en se connectant au NH₂ -MNP modifiés par PA (NH₂ @MNPs) soit le peptide de pénétration cellulaire gH625 (gH625@MNPs) ou les molécules de PEG et d'acide folique (PEG,FA@MNPs). En particulier, l'introduction d'acide folique (AF) dans les nanoparticules pégylées vise à améliorer à la fois l'absorption cellulaire dans les cellules tumorales via l'internalisation médiée par les récepteurs FA [22] et la biocompatibilité du nanosystème global [23]. Les effets des deux revêtements de surface sur l'absorption intracellulaire de MNP dans les cellules endothéliales microvasculaires primaires du cerveau humain (HBMEC) ont été évalués par microscopie confocale à balayage laser. À cette fin, des sondes luminescentes ont été incorporées dans les deux systèmes. En particulier, gH625 a été marqué avec la sonde 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD), tandis qu'un carboxy-X -une sonde rhodamine (rhod) a été ajoutée à la coque de PEG,FA@MNPs.

L'étude de l'absorption intracellulaire des MNP modifiés par gH625 dans les cellules endothéliales et leur comparaison avec les MNP modifiés par FA, à notre connaissance, n'ont jamais été rapportées auparavant.

Outre la capacité de traverser la BHE, le ciblage des cellules tumorales cérébrales est une autre exigence importante pour les agents thérapeutiques des tumeurs cérébrales. Par conséquent, l'internalisation cellulaire des deux MNP à revêtement différent dans l'un des gliomes malins humains les plus courants, le glioblastome A-172, a également été évaluée.

Notez que bien que des nanoparticules de fer fonctionnalisées par gH625 aient été récemment préparées par Perillo et al. [24], dans le présent travail, nous rapportons une stratégie de synthèse différente basée sur une plate-forme d'acide phosphonique très polyvalente. En particulier, la chimie de l'acide phosphonique permet la formation de liaisons fortes entre les MNP et les monocouches phosphoniques dont la stabilité est comparable à celle du MNP silanisé. De plus, comme l'auto-condensation P-O-P est négligeable, l'utilisation de lieurs phosphoniques permet de pallier les inconvénients de formation d'oligomères qui sont souvent rencontrés lors de l'utilisation de silanes [25].

Méthodes

Matériaux

Tous les réactifs utilisés pour la synthèse et la fonctionnalisation des MNP, FeCl₂ ·4H₂ O, FeCl₃ ·6H₂ O, acide 3-aminopropylphosphonique, acide méthoxypolyéthylène glycol acétique N -succinimidyl ester (PEG-NHS) avec un poids moléculaire de 5000 Da, acide folique, N -hydroxysuccinimide (NHS) et carboxy-X -rhodamine N -succinimidyl ester (Rhod-NHS) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich et utilisés sans autre purification. Les acides aminés protégés par le 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) utilisés pour la synthèse peptidique ont été achetés par Romil Del Chimica, Chemicals, et ont été utilisés sans autre purification. L'eau était de qualité Milli-Q (18,2 MO cm) et a été filtrée à travers un filtre de 0,22 μm.

Synthèse des MNP

Les MNP d'oxyde de fer nu ont été synthétisés par co-précipitation alcaline de Fe ³⁺ et Fe ²⁺ , selon le protocole décrit dans la littérature [26]. En bref, FeCl₂ ·4H₂ O et FeCl₃ ·6H₂ O (rapport molaire 1:2) ont été dissous dans de l'eau (50 ml) sous un N₂ atmosphère sous agitation vigoureuse. NH₃ 25% en H₂ O (5 ml) a été ajouté à la solution à 80 °C et la réaction a été poursuivie pendant 30 min. La suspension résultante a été refroidie à température ambiante et lavée avec de l'eau ultrapure. Les nanoparticules magnétiques nues obtenues (MNP nues) ont été isolées du solvant par décantation magnétique.

Synthèse de gH625

Le peptide a été préparé comme indiqué précédemment [27] en adoptant la méthode standard au 9-fluorénylméthoxy carbonyle (Fmoc) en phase solide. Brièvement, 50 µmoles du peptide ont été synthétisées sur une résine Wang (0,75 mmol/g) par des cycles consécutifs de déprotection et de couplage. Le peptide lié à la résine a ensuite été mis à réagir avec du 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl); la réaction a été effectuée une nuit en présence de DIPEA. Le peptide a été clivé de la résine et déprotégé par traitement avec un mélange d'acide trifluoroacétique (TFA) et de piégeurs et après précipité dans de l'éther éthylique glacé. Le peptide a été dissous dans de l'eau et lyophilisé. La caractérisation des peptides bruts a été réalisée par ionisation électrospray (ESI) LC-MS en adoptant un gradient linéaire d'acétonitrile (0,1 % de TFA) dans l'eau (0,1 % de TFA) de 20 à 80 % en 15 min. Il a ensuite été purifié par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC) préparative.

Synthèse de N -Ester d'hydroxysuccinimide d'acide folique (FA-NHS)

FA-NHS a été préparé par la méthode publiée suivante [28]. Cinq cents milligrammes d'acide folique (AF) ont été dissous dans 10 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) avec 240 ml de triéthylamine. NHS (260 mg) et N ,N -dicyclohexylcarbodiimide (470 mg) ont été ajoutés et le mélange a été mis à réagir pendant une nuit à température ambiante dans l'obscurité. Le sous-produit, la dicyclohexylurée, a été éliminé par filtration. La solution de DMSO a ensuite été concentrée sous pression réduite, et le FA-NHS a été précipité dans l'éther diéthylique. Le produit a été lavé plusieurs fois à l'éther anhydre et séché à l'air.

Synthèse des MNP fonctionnalisés

Synthèse de NH₂ @MNP

Les MNP (200 mg) ont été dispersés dans H₂ O (25 ml) à l'aide d'un bain à ultrasons pendant 30 min. NH₂ Du PA (100 mg) a été ajouté et la suspension a été agitée pendant 2 h à température ambiante. Les particules ont été séparées magnétiquement et lavées quatre fois avec H₂ O puis à l'éthanol et séché à l'air.

Synthèse de gH625@MNPs

NH₂ Les @MNP (300 mg) et le gH625 (1,2 mg) ont été dispersés dans du DMSO (20 ml). La solution a été mélangée pendant une nuit à 25°C. Les particules obtenues ont été séparées magnétiquement; lavé au DMSO, H₂ O, et éthanol; et séché à l'air.

Synthèse de PEG,FA@MNPs

NH₂ @MNPs (300 mg), PEG-NHS (30 mg), FA-NHS (3 mg) et Rhod-NHS (3 mg) ont été dispersés dans du DMSO (15 ml) et la solution a été mélangée pendant une nuit à 25 °C . Les particules obtenues ont été séparées magnétiquement; lavé au DMSO, H₂ O, et éthanol; et séché à l'air.

Exemples de caractérisations

Les mesures de diffraction des rayons X sur poudre (XRD) ont été effectuées avec un θ –θ 5005 Diffractomètre Bruker-AXS (Zeiss, Oberkochen, Allemagne) utilisant le rayonnement Cu Kα fonctionnant à 40 kV et 30 mA. La spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) a été réalisée avec un spectromètre ESCA-Auger multi-technique PHI 5600 avec une source de rayons X Al-Kα standard. Les analyses ont été réalisées avec un angle photoélectronique de 45° (par rapport à la surface de l'échantillon) avec un angle d'acceptation de ± 7°. L'échelle de l'énergie de liaison XPS (B.E.) a été calibrée en centrant le pic C 1s dû aux fractions hydrocarbures et au carbone adventice à 285,0 eV. Les mesures UV/Vis ont été effectuées avec un spectrophotomètre UV/Vis JASCO V-560 et les spectres ont été enregistrés avec une résolution de ± 0,2 nm. La diffusion dynamique de la lumière (DLS) et les mesures du potentiel zêta des MNP ont été effectuées à 25 °C avec un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) équipé d'un laser He-Ne (633 nm) et d'un détecteur de rétrodiffusion (173° ). Les mesures de transmission FT-IR ont été enregistrées avec un spectromètre JASCO FTIR 430, en utilisant la technique des pastilles KBr, avec 100 balayages collectés par spectre (plage de balayage 560-4000 cm ^− 1 , résolution 4 cm ^− 1 ).

Culture cellulaire

Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) et la lignée cellulaire de glioblastome humain A-172 ont été cultivées jusqu'à confluence dans des flacons de culture tissulaire recouverts de collagène de type I de queue de rat, selon la méthode rapportée [29]. Brièvement, les HBMEC ont été cultivées dans le milieu de cellules endothéliales additionné de 5 % de sérum bovin foetal (FBS) et de 1 % de supplément de croissance de cellules endothéliales. La lignée cellulaire A-172 a été cultivée dans du DMEM contenant 2 mM de glutamine et 10 % de FBS comme décrit précédemment [30]. Dans les deux cas, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine ont également été ajoutés aux cultures.

Test de viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été déterminée avec le [3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2H test au bromure de tétrazolium] (MTT) [31]. Dans toutes les conditions expérimentales, la concentration de FBS a été réduite à 1% (milieu affamé). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à 7000 cellules/puits pour obtenir une densité cellulaire optimale tout au long de l'expérience. Dans tous les tests, les cellules ont d'abord été incubées à 37 °C avec du MTT pendant 3 h ; ensuite, de l'isopropanol avec du HCl 0,04 M a été ajouté et l'absorbance a été mesurée à 1 h dans un lecteur de plaques (Synergy 2-BioTek) avec une longueur d'onde de test de 570 nm [32].

Microscopie confocale

La microscopie confocale a été réalisée sur des cellules de glioblastome HBMEC et A-172 cultivées sur des lamelles de microscope placées dans une plaque à 24 puits. Après des incubations avec ou sans MNP, les cellules ont été fixées en ajoutant 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS et traitées pour l'immunocytochimie comme décrit précédemment [33]. Les analyses en microscopie confocale ont été réalisées avec un microscope confocal à balayage laser (LSM) Olympus FV1000 équipé des sources d'excitation suivantes :laser à diode (405 nm), laser multiligne Ar (457, 488 et 515 nm), laser HeNe(G) ( 543 nm) et le laser HeNe(R) (633 nm). Un objectif à immersion dans l'huile (60xO PLAPO) a été utilisé, et la lumière émise a été détectée en mode séquentiel grâce à un système de filtrage spectral. Le gain du détecteur a été fixé à une valeur constante et des images ont été prises pour tous les échantillons à des emplacements aléatoires dans toute la zone du puits. Les paramètres d'acquisition suivants ont été utilisés :λ ex/em = 405/425 − 475 nm (canal bleu, coloration nucléaire par DAPI) ; λ ex/em = 488/500 − 530 nm (canal vert, étiquetage gH625@MNPs par NBD) ; et λ ex/em = 633/650 − 700 nm (canal rouge, marquage PEG,FA@MNPs par rhod). L'analyse quantitative de la fluorescence a été réalisée en utilisant le logiciel ImageJ (version 1.50i, NIH).

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des MNP

La stratégie globale mise en œuvre pour préparer gH625@MNPs et PEG,FA@MNPs à partir de Fe₃ O₄ Les nanoparticules, obtenues par co-précipitation, comportent deux étapes comme illustré sur la Fig. 1. La première étape, qui est la même pour les deux classes de nanoparticules, est basée sur la fonctionnalisation des MNP avec un acide phosphonique porteur d'un groupement aminé (NH₂ -PENNSYLVANIE). Dans la deuxième étape, le NH₂ -MNPs préfonctionnalisés en PA (NH₂ @MNPs) sont en outre conjugués avec des molécules fonctionnelles spécifiques via des réactions de couplage NHS. En particulier, le N -La forme activée par l'hydroxysuccinimide de gH625 marquée avec NBD a été utilisée pour la préparation de gH625@MNPs, et N Les formes activées par -hydroxysuccinimide de PEG, FA et Rhod ont été utilisées pour obtenir PEG, FA@MNPs. Notez que gH625@MNPs et PEG,FA@MNPs ont été marqués avec des sondes luminescentes (c'est-à-dire NBD et Rhod, respectivement) afin de réaliser des études de microscopie confocale à balayage laser.

Schéma de réaction. Étapes de réaction pour la préparation de MNPs fonctionnalisés

La caractérisation par diffractométrie des rayons X (XRD) des MNP nues obtenues après l'étape de co-précipitation est similaire à celle rapportée dans nos articles précédents [34, 35]. En bref, un motif typique (Fig. 2a) montre quatre pics de diffraction (2θ = 30,16°, 35,48°, 43,10° et 57,04°) ce qui est cohérent avec la présence de magnétite, de maghémite ou de toute composition intermédiaire entre les deux phases. La constante de réseau, a , qui s'est avéré être 8,389(4) Å en bon accord avec le paramètre de maille de la magnétite en vrac (8,396 Å), ainsi que la taille moyenne des cristaux de 11,2, déterminée en appliquant l'équation de Debye-Scherrer, sont comparables aux valeurs précédemment rapporté [34, 35].

Spectres XRD et XPS typiques des MNP. Modèle XRD de a) MNP nus et Fe 2p _3/2 haute résolution Régions spectrales XPS de b) MNPs nus et c) NH₂ @MNP

Notez que puisque la structure cristalline de Fe₃ O₄ la magnétite est très similaire à celle de γ-Fe₂ O₃ maghémite, il est très difficile de distinguer les deux phases par XRD. Pour cette raison, la spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) a été utilisée pour analyser davantage les MNP. La figure 2b montre Fe 2p_3/2 spectres XPS haute résolution de MNP nus. Le centroïde de la bande, observé à 710,9 eV, correspond au Fe 2p_3/2 Pic. Cette valeur est inférieure à celle rapportée pour Fe ³⁺ soit dans des trous octaédriques de α-Fe₂ O₃ (711.6 eV) [36, 37] ou dans des trous mixtes tétraédriques et octaédriques de γ-Fe₂ O₃ (711.4 eV), et il est cohérent avec l'état d'oxydation mixte de Fe dans Fe₃ O₄ [37, 38].

Enfin, une caractérisation magnétique détaillée de MNP similaires est rapportée dans nos articles précédents [34, 35].

Le processus de fonctionnalisation a été évalué par FT-IR et XPS. Après fonctionnalisation par des monocouches phosphoniques, le Fe 2p_3/2 (Fig. 2c) ne montre pas de modifications pertinentes, confirmant ainsi que le Fe₃ O₄ phase est conservée. Cependant, un léger décalage (0,4 eV) du Fe 2p_3/2 centroid vers une énergie de liaison inférieure (B.E) a été observée, ce qui était associé à l'ancrage de la monocouche phosphonique. Des déplacements similaires ont en fait été observés dans l'adsorption de phosphate de divers oxydes ferriques [39] et peuvent être attribués à un certain transfert de charge de l'adsorbat aux atomes de Fe. Le Fe 2p_3/2 la position de 710,5 eV a été maintenue après toutes les étapes de fonctionnalisation pour l'ancrage du PEG et du FA.

La figure 3 présente la comparaison des régions spectrales P2p, N1s et C 1s de NH₂ @MNPs, PEG,FA@MNPs et gH625@MNPs, respectivement. La position de crête P2p (133,2 eV) de NH₂ @MNPs est typiquement associé à la présence de l'acide phosphonique ancré à la surface de manière bidentée [40,41,42,43]. La position de la bande P2p dans les spectres de gH625@MNPs et PEG,FA@MNPs est la même que celle observée dans NH₂ Spectre @MNPs, révélant ainsi que les molécules phosphoniques ne sont pas éliminées lors des réactions de couplage pour l'immobilisation du peptide et de l'acide folique.

Caractérisation XPS des MNP fonctionnalisés. Régions spectrales XPS P 2p, C 1s et N 1s haute résolution de a) NH₂ @MNPs, b) PEG,FA@MNPs, et c) gH625@MNPs

La forme et la position du pic des spectres N1s de NH₂ @MNPs sont cohérents avec la présence du NH₂ ancré -PENNSYLVANIE. La bande est constituée de deux composants distincts :le premier à 399,9 eV est associé aux groupes -NH de l'aminopropylphosphate ancré, et le second composant centré à 401,5 eV est dû aux groupes aminés interagissant avec la surface de Fe₃ O₄ par protonation ou formation de liaisons -H.

Après l'ancrage du peptide gH625 ou du FA, du PEG et de Rhod, le composant N1s à 399,8 eV augmente par rapport au composant à 401,8 eV lié aux fragments amino protonés de NH₂ @MNPs. Cette augmentation est due aux signaux superposés des atomes N impliqués dans la liaison amidique (400,2 eV) entre l'aminopropylphosphate ancré et les molécules conjuguées (par exemple, gh625, FA, PEG et Rhod) ainsi que des atomes N de gh625 et FA (à 399,1 et 400,6 eV).

La bande C 1s de NH₂ Le spectre @MNPs consiste en un seul pic à 285,0 eV attribué aux carbones aliphatiques, comme indiqué précédemment [40].

Dans les spectres C1s de gH625@MNPs et PEG,FA@MNPs, la présence d'un composant C1s à 288,3 eV est due aux groupes carboxyliques et amidiques des molécules gh625, FA et Rhod.

Spectres FT-IR de NH₂ @MNPs, gH625@MNPs et PEG,FA@MNPs sont rapportés dans la Fig. 4. Dans tous les échantillons, les spectres ne montrent pas les bandes à 1250 cm ^− 1 en raison de P=O et des pics aigus dans les 900–1050 cm ^− 1 plages dues à l'étirement P–O–H [44,45,46], mais une bande large et forte à 1040 cm ^− 1 , qui est associée aux vibrations du PO₃ ²⁻ groupe lié à la surface du fer. Cette bande indique, selon les résultats XPS, que les acides phosphoniques sont déprotonés et sont ancrés à la surface par des liaisons P–O–Fe comme indiqué précédemment [34, 40, 41]. La région spectrale IR entre 1500 et 1700 cm ^− 1 montre que les bandes appartenaient aux groupes amino et amide de gH625 et FA. En particulier, spectre de NH₂ @MNPs montre un pic pointu autour de 1650 cm ^− 1 associé au NH₂ flexion [47]. Après ancrage PEG, Rhod et FA, 1700–1500 cm ^− 1 région de PEG,FA@MNPs montre des bandes plus larges en raison de la convolution des vibrations de NH₂ n'ayant pas réagi , groupes amide et cycles benzéniques de FA et Rhod (1630–1600 cm ^− 1 ) [35]. De manière analogue, après ancrage peptidique, les larges bandes à environ 1650-1600 cm ^− 1 peut être dû à la contribution de plusieurs vibrations dues au NH₂ n'ayant pas réagi et des fractions aminiques des chaînes latérales peptidiques et au tronçon C=O des liaisons amidiques peptidiques [48]. De plus, un composant à environ 1540 cm ^− 1 en raison de la combinaison δ Les vibrations (N–H)/ν(C–N) du peptide [48] sont également présentes.

Caractérisation FT-IR de MNP fonctionnalisés. Région spectrale FT-IR comprise entre 850 et 1900 cm ⁻¹ plage  de a) NH₂ @MNPs, b) gH625@MNPs, et c) PEG,FA@MNPs

L'ancrage FA sur les MNPs a également été prouvé par les spectres UV/Vis d'une solution colloïdale de PEG,FA@MNPs. La figure 5 compare les spectres de NH₂ @MNPs et PEG,FA@MNPs dispersions colloïdales. Le spectre d'une solution FA (5 μM) a été ajouté comme référence. Une bande évidente à 274 nm typique de l'AF est clairement visible à la fois dans la solution colloïdale de référence et dans la solution colloïdale de PEG,FA@MNPs, confirmant ainsi la présence d'AF dans les MNP. Notez que le léger décalage entre l'absorption FA-NHS à 280 nm et la valeur de 274 nm après l'ancrage est probablement dû au changement d'environnement entre le FA-NHS libre et le FA ancré aux nanoparticules. La présence de décalages variables de la bande d'absorption à 280 nm après ancrage en surface de l'AF ou conjugaison avec d'autres molécules a déjà été observée dans la littérature [49,50,51].

Caractérisation UV/Vis de MNP fonctionnalisés. Spectres UV/Vis d'une solution FA-NHS 5 μM et de NH₂ @MNPs et dispersions colloïdales PEG,FA@MNPs. A noter que le bruit de fond élevé observé dans les spectres de NH₂ @MNPs et PEG,FA@MNPs est due à la diffusion de la dispersion colloïdale des nanoparticules

Le diamètre hydrodynamique moyen, l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta des MNP fonctionnalisés ont été déterminés par DLS dans du tampon PBS à pH 7,4 sur des dispersions de MNP telles que préparées et après 72 h de vieillissement (tableau 1). Les diamètres hydrodynamiques de NH₂ -PA@MNPs, gH625@MNPs et PEG,FA@MNPs étaient respectivement de 73,0 ± 3,0 nm, 104,0 ± 4,0 nm et 51 ± 2 nm, et les valeurs PDI indiquent une distribution suffisamment étroite de la taille des particules. Comme attendu, la conjugaison avec gH625 a augmenté la taille des nanoparticules, tandis que la diminution de la taille du PEG,FA@MNPs est due à une meilleure dispersion que le NH₂ @MNPs, liés à la présence des chaînes PEG.

Dans tous les cas, notez qu'un potentiel zêta très négatif (< − 30 mV) a été observé pour tous les systèmes. De telles valeurs de potentiel zêta négatives assurent une stabilité à long terme et évitent une agrégation importante des particules [52, 53]. En effet, la charge de surface négative ne dépendait que légèrement du revêtement mais résultait principalement de la combinaison du noyau chargé négativement de Fe₃ O₄ nanoparticules [54] et l'effet des groupes acide phosphonique observés pour des systèmes similaires [52, 34]. Par conséquent, par rapport à d'autres stratégies de synthèse utilisées pour fonctionnaliser les MNP, l'utilisation de monocouches d'acide phosphonique comme lieurs permet non seulement la formation d'une liaison stable entre la surface et les groupes fonctionnels, mais induit également un potentiel zêta très négatif. Après 72 h de vieillissement, la taille et le potentiel zêta de NH₂ -PA@MNPs, gH625@MNPs et PEG,FA@MNPs restent approximativement les mêmes, suggérant que toutes les surfaces décorées sont stables dans le temps.

Viabilité de la cellule

La viabilité des cellules HBMEC et A-172 incubées avec gH625@MNPs et FA,PEG@MNPs a été évaluée en utilisant le test MTT à différents temps d'incubation et en présence de différentes concentrations de nanoparticules (10 et 20 μg/ml). Comme le montre la figure 6, aucun effet cytotoxique dépendant de la concentration et/ou du temps (24-48-72 h) des systèmes décorés sur les cellules HBMEC et A-172 n'a été observé.

Viabilité cellulaire. Viabilité cellulaire de a HBMEC et b Cellules A-172 incubées pendant 24, 48 et 72 h avec gH625@MNPs 10 μg/ml (barre noire), gH625@MNPs 20 μg/ml (barre rouge), PEG,FA@MNPs 10 μg/ml (barre bleue) ) et PEG,FA@MNPs 20 μg/ml (barre magenta)

Captation intracellulaire

Afin de déterminer si la capacité de pénétration cellulaire du peptide gH625 est conservée après son immobilisation à la surface des nanoparticules, et de comparer la capacité de gH625 et de FA à traverser la BHE, l'internalisation dans les cellules endothéliales du cerveau humain de gH625@MNPs marqué au NBD et le PEG,FA@MNPs marqué par Rhod a été étudié par microscopie confocale à balayage laser.

Après 24 h d'incubation, l'absorption de PEG-FA@MNPs n'est pas évidente, tandis que l'internalisation de gH625@MNPs est clairement visible (Fig. 7). La conjugaison avec gH625 conduit à une absorption plus rapide et à une intensité presque deux fois plus élevée de la fluorescence intracellulaire (Fig. 8).

Micrographies de fluorescence LSM de HBMEC. Micrographies de fluorescence LSM de HBMEC incubées pendant 24 h (b , f ) et 72 h (j , h ) avec gH625@MNPs marqué NBD 15 μg/ml (b , d ) et leurs contrôles (a , c ) ou PEG,FA@MNPs marqué au rhodium 15 μg/ml (f , h ) et leurs contrôles (e , g ). Barre d'échelle = 20 μm

Intensités normalisées de fluorescence intracellulaire. Analyse quantitative de la fluorescence intracellulaire après incubation HBMEC à 24 et 72 h avec gH625@MNPs marqué NBD et FA,PEG@MNPs marqué Rhod

Pour des durées d'incubation plus longues (72 h), les différences entre l'internalisation des deux systèmes sont réduites. Ce comportement n'est pas inattendu car pendant de longues périodes d'incubation, des processus d'internalisation non spécifiques de FA,PEG@MNPs peuvent se produire et nos résultats confirment davantage ce que nous avons précédemment rapporté pour l'absorption de nanoparticules de polystyrène fonctionnalisées et non fonctionnalisées [55].

Pour explorer davantage la possibilité d'utiliser gH625@MNPs comme agent thérapeutique pour les tumeurs cérébrales, les absorptions cellulaires de gH625@MNPs et FA,PEG@MNPs ont été étudiées à l'aide de la lignée cellulaire de glioblastome A-172. Le glioblastome est l'une des tumeurs cérébrales primitives les plus courantes et aussi l'un des cancers les plus mortels.

Les absorptions cellulaires de gH625@MNPs et FA,PEG@MNPs après 24 h d'incubation sont comparables, comme le montre la figure 9.

Micrographies de fluorescence LSM de cellules de glioblastome. Micrographies de fluorescence LSM de cellules de glioblastome. Images bleu-vert fusionnées :cellules de contrôle (a ) et des cellules incubées avec 15 μg/ml de gH625@MNPs marqué NBD (b ). Images bleu-rouge fusionnées :cellules de contrôle (c ) et des cellules incubées avec 15 μg/ml de PEG,FA@MNPs marqué au rhod (d ). Barre d'échelle = 20 μm

This behavior suggests that the gH625 is capable of targeting brain tumor with the same efficiency of the more often adopted FA targeting unit.

Conclusions

Fe₃ O₄ nanoparticles have been functionalized with the gH625 viral cell penetrating peptide adopting a versatile route based on MNP prefunctionalization with a monolayer consisting of a bifunctional phosphonic linker, 3-aminopropylphosphonic acid. The cell internalization capabilities of this system have been evaluated by comparing them with those of a reference system based on MNPs functionalized with PEG, rhodamine, and folic acid, obtained adopting the same NH₂ -PA-based platform. The uptake of the two differently decorated MNPs was assessed in primary microvascular endothelial cells from human brain, which are the main components of the BBB and simulate an in vitro model of the BBB. These surface modifications influence the internalization of MNPs in HBMEC and, therefore, their capability to cross the BBB. In fact, conjugation with the gH625 peptide upgraded the delivery of nanoparticles across the in vitro BBB, leading to significant higher cell uptake in HBMEC after 24 h compared with that of FA bearing MNPs (FA,PEG@MNPs). Note that also other strategies have been used to enhance nanoparticle uptake across the BBB. A common approach is to attach targeting ligands in order to activate receptor-mediated endocytosis. As examples, transferrin-coupling nanoparticles can penetrate into the BBB through a transferrin receptor-mediated process [56]. Analogously, the linkage of the apolipoprotein E to the nanoparticles enhances the BBB penetration [57]. Besides, nanoparticles having a surface charges modified with polyethylenimine (PEI) has been reported to cross the BBB by absorptive-mediated transcytosis [58]. Finally, the ability of MNPs to pass through human brain microvascular endothelial cells, used as an in vitro BBB model, can be also facilitated by an external magnet [59]. In our work, we studied a different approach which use a cell penetrating peptide, the gh625, to improve internalization capabilities of Fe₃ O₄ nanoparticules. These results are in accordance with those previously obtained by D. Guarnieri et al. using different kinds of MNPs [55, 60] confirming that the gH625-decorated magnetic nanoparticle has a relevant role in crossing the BBB and could be used as a safe and effective drug delivery system.

Abréviations

A-172:

Human glioblastoma cell line

B.E.:

Binding energy

BBB:

Blood-brain barrier

CNS:

Central nervous system

CPPs:

Cell-penetrating peptides

DIPEA:

N ,N -Diisopropylethylamine

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

FA:

Folic acid

FA-NHS:

Activated form of FA with NHS

FBS:

Fetal bovine serum

Fmoc:

9-Fluorenylmethoxycarbonyl

FT-IR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

gh625:

20-Residue peptide derived from the glycoprotein H (gH) of the Herpes simplex virus 1

gH625@MNPs:

NH₂ @MNPs functionalized with gh625

HBMECs:

Microvascular endothelial cells from human brain

MNPs:

Magnetic iron nanoparticles

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H -tetrazolium bromide

NBD:

4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole

NH₂ @MNPs:

MNPs modified with NH₂ -PA

NH₂ -PA:

3-Aminopropylphosphonic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

PBS:

Phosphate-buffered saline

PDI :

Indice de polydispersité

PEG:

Polyethylene glycol

PEG,FA@MNPs:

NH₂ @MNPs functionalized with FA, Rhod and PEG

PEG-NHS:

Methoxypolyethylene glycol acetic acid N -succinimidyl ester

PEI:

Polyethylenimine

Rhod:

Carboxy-X -rhodamine

Rhod-NHS:

Carboxy-X -rhodamine N -succinimidyl ester

TFA:

Trifluoroacetic acid

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

XRD :

Diffraction des rayons X sur poudre