La toxicité potentielle pour le foie, le cerveau et l'embryon des nanoparticules de dioxyde de titane sur des souris

Contexte

Dioxyde de titane à l'échelle nanométrique (nano-TiO₂ ) est largement utilisé dans l'industrie alimentaire. Il a été utilisé pour la production de bonbons enrobés, de fruits en conserve, de chewing-gum, de boissons gazeuses, de boissons en poudre (sous forme posologique non sucrée ou concentrée), de lait et de produits laitiers et d'autres catégories d'aliments [1, 2]. La concentration de nano-TiO₂ dans les aliments atteint jusqu'à 0,5-9 g/kg [1, 3], et de nombreux produits alimentaires prétendument exempts de nano-TiO2 contiennent du nano-TiO2 [2]. Nano-TiO₂ a également été largement utilisé dans la biomédecine, le traitement des polluants organiques, l'ingénierie des matériaux et les cosmétiques [4,5,6]. Cependant, la sécurité du nano-TiO₂ l'exposition reste floue.

Des études ont montré que le nano-TiO₂ peut devenir enrichi et toxique dans plusieurs organes après avoir pénétré dans le corps par plusieurs méthodes, telles que l'administration par la cavité abdominale ou l'inhalation [7, 8]. Nano-TiO₂ peut être toxique pour plusieurs types de cellules, telles que les cellules lymphoblastoïdes humaines et les cellules d'hépatome [9, 10]. Il peut induire une réaction de stress aiguë dans les cellules gliales du cerveau de souris, entraînant des dommages et un dysfonctionnement des neurones [11]. Le taux de survie des lignées cellulaires de neurones exposées au nano-TiO₂ particules est significativement réduite d'une manière typique en fonction du temps et de la dose [12].

Des études ont révélé plusieurs mécanismes par lesquels ces nanoparticules provoquent une toxicité. Nano-TiO₂ les particules peuvent provoquer une toxicité génétique en modifiant la structure du complexe moléculaire et la perméabilité de la membrane cellulaire [13,14,15]. Nano-TiO₂ peut produire un stress oxydatif. Au cours du stress oxydatif, des espèces réactives de l'oxygène (ROS), telles que les radicaux hydroxyles, sont générées et provoquent l'oxydation de l'ADN, générant du 8-OHG, entraînant des erreurs et des mutations dans la réplication de l'ADN [16, 17]. De plus, les ROS peuvent induire une inflammation et une interaction mutuelle entre le stress oxydatif et l'inflammation, entraînant des dommages à l'ADN et l'apoptose cellulaire [18, 19]. Cependant, les données systématiques complètes sur la toxicité des nano-TiO₂ reste limité. Notre objectif était de révéler l'effet et le mécanisme sous-jacent du nano-TiO₂ exposition sur la santé humaine.

Dans cette étude, nous avons évalué l'effet et le mécanisme sous-jacent du nano-TiO₂ exposition à l'aide de modèles de souris. Nos résultats ont montré que le nano-TiO₂ peut être enrichi et provoquer une toxicité dans plusieurs organes tels que le foie, les reins, la rate, le cœur, les poumons et le cerveau en générant un déséquilibre d'oxydo-réduction et des troubles de l'expression des gènes. Cela peut également endommager le développement embryonnaire. Notre étude peut fournir des données pour évaluer le risque potentiel pour la santé humaine des nano-TiO₂ exposition.

Méthodes

Produits chimiques et réactifs

TiO à micro-échelle₂ (micro-TiO₂ ) et 5 nm de TiO₂ sous forme d'anatase ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine), et 10, 60 et 90 nm de TiO₂ (anatase) ont été achetés auprès de Run He Ltd. (Shanghai, Chine). Le formaldéhyde, l'acide nitrique, le peroxyde d'hydrogène et l'héparine sodique étaient de qualité réactif et ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine). Le tampon phosphate (PBS), la pénicilline et la streptomycine ont été achetés auprès de Gibco (San Diego, USA). Des kits d'extraction d'ARN total ont été achetés auprès de Takara (Dalian, Chine). Des kits d'analyse d'espèces réactives de l'oxygène ont été achetés auprès de Jianchen Ltd. (Nanjing, Chine). Stock TiO₂ suspension (1%) dans la solution de Hank a été stérilisée à 121 °C pendant 30 min. La suspension a été soniquée et diluée à la concentration souhaitée juste avant utilisation.

Animaux et modèles

Pour l'étude de la toxicité hépatique et cérébrale, des souris ICR (région de contrôle d'empreinte) (22 ± 3 g, moitié mâle et moitié femelle) ont été achetées au centre animalier de l'Université médicale de Chine. Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été pré-approuvées par le comité d'éthique institutionnel de l'Université des sciences et technologies de Tianjin et ont été menées conformément aux directives internationales pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Pour l'étude de la toxicité de l'embryon de souris, des souris ICR (45 femelles, 20-35 g ; 15 mâles, 35-40 g) ont été achetées auprès de Beijing Weitong Lihua Ltd. (Pékin, Chine). Toutes les souris étaient saines et sexuellement matures. Cinq jours avant le traitement, les souris ont été élevées dans des cages séparées dans une maison avec une bonne ventilation, un cycle lumière/obscurité de 12 h, 20 ± 2 °C, 60 ± 10 % d'humidité relative et un accès à volonté à la nourriture et à l'eau.

Le schéma posologique 1 a été conçu pour un test de toxicité générale et de toxicité cérébrale. Les souris ont été réparties au hasard en six groupes et un groupe témoin supplémentaire, avec 10 souris/groupe. Un TiO₂ nanométrique (nano-TiO₂ ) la suspension a été injectée (par voie intrapéritonéale (i.p.), 5, 10, 50, 100, 150 et 200 mg/kg) une fois par jour pendant 14 jours. Une solution saline a été injectée aux souris du groupe témoin. Les souris ont été observées tous les jours et aucun animal n'est mort au cours de l'étude. Le 15ème jour, des échantillons de sang ont été prélevés dans le sinus orbitaire. Toutes les souris ont été pesées individuellement, ont été anesthésiées avec du phénobarbital à 2 % (60 ml/kg, i.p.), puis ont été sacrifiées par dislocation cervicale. Tous les échantillons de tissus ont été collectés (tissu cérébral isolé du cortex et de l'hippocampe) et ont été conservés à -80 °C. Chaque cœur, foie, rate, poumon et rein a été coupé en deux parties. Une portion a été trempée dans une solution de formol (10 %) à 4 °C pour un examen pathologique. L'autre portion a été conservée à −20 °C pour la détermination de la teneur en titane.

Le schéma posologique 2 a été conçu pour le test de toxicité hépatique. Les souris ont été divisées en trois groupes expérimentaux et un groupe témoin. Nano-TiO₂ (5, 10, 50 mg/kg) a été administré une fois par jour par gavage pendant 60 jours. Les souris du groupe témoin ont reçu 0,5 % de CMC (carboxyméthylcellulose). Les souris ont été observées tous les jours et aucun animal n'est mort au cours de l'étude. Le 60e jour, les souris ont été anesthésiées avec du phénobarbital à 2 % (60 ml/kg, ip), puis ont été sacrifiées par dislocation cervicale, les foies ont été immédiatement collectés et traités pour examen par microscopie électronique, détermination des ROS et oxydation des lipides. , et l'analyse de l'expression des gènes.

Détermination de la teneur en titane dans les tissus cibles

Un morceau d'échantillon de tissu congelé de 0,1 à 0,5 g a été coupé et décongelé à température ambiante, puis a été digéré dans HNO₃ (0,5 mL) et H₂ O₂ (0,5 mL) à 160 °C. Après avoir été diluée à 3 mL avec de l'acide nitrique à 3 %, la concentration de titane dans la solution a été déterminée par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). La teneur en titane dans les tissus cibles a ensuite été calculée.

Tests de biochimie sanguine et calcul du rapport organe/poids corporel

Les niveaux des enzymes dans les échantillons de sérum ont été analysés par un analyseur de biochimie automatique (TBA-2000FR, Toshiba, Tokyo, Japon). Ces enzymes sont des biomarqueurs liés à la fonction du foie et des reins.

Le rapport poids organe/poids corporel a été calculé sur la base des poids de l'organe et du corps. Les poids corporels ont été mesurés avant l'anesthésie et le sacrifice. Les organes ont été pesés après isolement à partir de souris anesthésiées et sacrifiées.

Examen pathologique et microscopie électronique à transmission

L'examen pathologique du foie ou des tissus cérébraux imbibés de formol a été réalisé au microscope optique après coloration à l'hématoxyline. Pour la microscopie électronique à transmission (MET), les tissus hépatiques ont été noyés dans de la résine époxy EPON 812 et ont été coupés en sections aussi minces que <500 μM après fixation au glutaraldéhyde et à l'acide osmique. Les coupes ont été colorées avec une solution saturée d'acide acétique et d'uranium (pH 3,5) et du citrate de plomb (pH 12) pendant 1 à 2 h. Les coupes colorées ont été examinées par MET.

Détermination des niveaux d'espèces réactives de l'oxygène, des activités de leurs enzymes métaboliques et des niveaux de neurotransmetteurs

Pour les tissus hépatiques, l'anion superoxyde (O₂ ^– ) les niveaux ont été déterminés à l'aide de XTT. L'activité de la catalase (CAT) a été déterminée en utilisant des valeurs de DO à 240 nm, selon les procédures publiées [20]. Les niveaux de peroxydation lipidique ont été déterminés par la teneur en malondialdéhyde (MDA) selon les procédures publiées [21].

Les tissus cérébraux ont été homogénéisés avec une solution de polyvinylpolypyrrolidone à 1 % pré-refroidie (50 mM dans du PBS à pH 7,6) après isolement. Les surnageants ont été collectés après centrifugation à 15 000 tr/min pendant 20 min (Eppendorf 5418, Hambourg, Allemagne) et ont été utilisés pour l'analyse ultérieure des activités de l'enzyme superoxyde (SOD), de la CAT, de l'ascorbate peroxydase (APX) et de la glutathion peroxydase (GSHPx). L'activité SOD a été déterminée à l'aide du NBT (test au bleu au chlorure de nitro-tétrazolium). L'activité catalase a été déterminée en utilisant un kit (kit d'analyse CAT, A007-2, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). L'activité de l'APX a été mesurée à l'aide d'un kit (Kit d'analyse APX, A123, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). L'activité GSHPx a été déterminée en utilisant un kit (kit d'analyse GSHPx, A005, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). Les activités de l'oxyde nitrique synthase constitutive (cNOS), de l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) et de l'acétylcholinestérase (AChe) ont été déterminées à l'aide de kits commerciaux (kit de dosage AChe, A024, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine).

Les niveaux de ROS dans les tissus cérébraux ont été déterminés en ajoutant du diacétate de dichlorofluorescine 2′, 7′ à une concentration finale de 10 μM dans un homogénat de tissu cérébral et en incubant à 37 °C pendant 30 min ; les tissus ont ensuite été soumis à une analyse par cytométrie en flux.

Détermination des niveaux relatifs d'ARNm

L'ARN total a été extrait d'échantillons de tissus hépatiques à l'aide d'un kit commercial (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767, Takara, Dalian, Chine). L'ADN complémentaire a été synthétisé en utilisant la transcription inverse avec une amorce aléatoire. Les niveaux relatifs d'ARNm de SOD, CAT, GSHPx, MT, HSP70, CYPA, P53, GST et TF ont été déterminés à l'aide d'un kit de PCR quantitative en temps réel (qPCR) (Kit One Step SYBR® PrimeScript™ RT-PCR, PR066A, Takara, Dalian, Chine). Toutes les amorces (tableau 1) ont été synthétisées et achetées auprès de Shanghai Sangon Ltd.

Test de toxicité embryonnaire ex vivo

Des embryons de 8,5 jours embryonnaires ont été isolés de souris femelles après dislocation cervicale, puis ont été cultivés dans 50,0 mL de solution de Hank contenant 3 mL de sérum immédiatement centrifugé (ICS) de rat, micro-TiO₂ , ou nano-TiO₂ (0,0, 50,0, 100,0 et 200,0 μg/mL) avec 3 embryons dans chaque flacon pendant 48 h.

Pour déterminer l'effet du micro-TiO₂ ou nano-TiO₂ temps d'exposition sur les embryons, les embryons ont été cultivés dans 50,0 mL de solution de Hank contenant 3 mL d'ICS de rat, micro-TiO₂ , ou nano-TiO₂ (200,0 μg/mL) avec 3 embryons dans chaque flacon pendant 16, 26 et 48 h, puis ont été lavés pendant 48 h avec une solution de Hank préchauffée à 37 °C et cultivés dans 50,0 mL de solution de Hank contenant 3 mL d'ICS de rats.

Le développement embryonnaire a été évalué à l'aide du score de Maele-Fabry Van [22]. Le diamètre du sac vitellin, la longueur de la couronne et du croupion embryonnaire, la longueur de la tête et le nombre de sections du corps ont été examinés au microscope à dissection. Le taux de malformation des embryons en développement a été évalué sur la base des scores de changements morphologiques du cerveau antérieur, du mésencéphale, du cerveau postérieur, du bourgeon des membres antérieurs, du bourgeon des membres postérieurs, des systèmes auditif et visuel et du cœur. Plus de 10 embryons de 2 souris ICR au jour embryonnaire 10,5 ont été isolés pour le contrôle.

Analyse statistique

Les données ont été analysées à l'aide de SPSS 13 (IBM, Illinois, États-Unis). La différence entre le groupe de traitement et le groupe témoin a été analysée à l'aide d'un t de Dunnett. test. La différence entre les groupes a été analysée par ANOVA. La comparaison entre deux échantillons multiples a été analysée à l'aide des tests LSD et SNK. Les données catégorielles ont été analysées à l'aide du test du chi carré et du test de la somme des rangs. Si P < 0,05, la différence a été considérée comme significative.

Résultats

Répartition tissulaire du titane chez la souris après une exposition au dioxyde de titane à l'échelle nanométrique

Nous avons traité des souris avec du nano-TiO₂ (i.p., 5, 10, 50, 100, 150 et 200 mg/kg) pendant 14 jours et déterminé les teneurs en titane dans les organes de souris. Les résultats ont révélé que le titane s'était accumulé dans les organes de souris traitées avec différentes doses de nano-TiO₂ (Fig. 1). L'ampleur de l'accumulation était dose-dépendante (Fig. 1). Le foie était l'organe le plus enrichi en titane, suivi du rein. L'ampleur de l'accumulation de titane était approximativement la même dans la rate, les poumons, le cerveau et le cœur (Fig. 1). Les résultats suggèrent que le nano-TiO₂ peut être absorbé par la voie gastro-intestinale et distribué dans les tissus via le système circulatoire et déposé dans les organes foie, rein, rate, poumon, cerveau et cœur.

Du titane s'est accumulé dans les organes de souris exposées au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ suspension ou solution saline comme indiqué par injection intrapéritonéale une fois par jour pendant 14 jours. * par rapport au témoin, P < 0,05, # par rapport au témoin, P < 0,01

Toxicité générale du dioxyde de titane à l'échelle nanométrique chez la souris

Nous avons traité des souris avec différentes doses de nano-TiO₂ pendant 14 jours et a constaté qu'il n'y avait aucune différence dans les gains de poids corporel entre les groupes de souris traitées avec différentes doses (données non présentées). De faibles doses de nano-TiO₂ (5 et 10 mg/kg) n'a pas modifié le rapport poids organe/poids corporel du foie, des reins, de la rate, des poumons, du cœur et du cerveau chez la souris après une injection i.p. exposition pendant 14 jours (Fig. 2). Cependant, les fortes doses de nano-TiO₂ (50, 100, 150 et 200 mg/kg) ont significativement augmenté le rapport poids organe/poids corporel du foie, des reins, de la rate et du cœur et diminué ceux des poumons et du cerveau chez la souris d'une manière dose-dépendante (Fig. 2 ).

Rapport poids organe/poids corporel chez la souris exposée au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ suspension ou solution saline comme indiqué par injection intrapéritonéale une fois par jour pendant 14 jours. * par rapport au témoin, P < 0,05 ; # par rapport au témoin, P < 0,01

Des doses plus faibles (5, 10, 50 et 100 mg/kg) de nano-TiO₂ n'a modifié aucun indice de biochimie sanguine (Fig. 3). De fortes doses de nano-TiO₂ (150 à 200 mg/kg) biomarqueurs élevés de la fonction hépatique phosphatase alcaline (ALP) et alanine aminotransférase (ALT), albumine (ALB), leucine aminopeptidase (LAP), butyrylcholinestérase (PChe), bilirubine totale (TBIL) et protéines totales ( TP) (Fig. 3). Des doses élevées ont diminué les taux sériques d'acide urique (UA) et d'azote uréique du sang (BUN), qui sont des biomarqueurs de la fonction rénale. Ils ont augmenté les taux sériques d'aspartate aminotransférase (AST), de créatine kinase (CK), de lactate déshydrogénase (LDH) et d'alpha hydroxybutyrate déshydrogénase (HBDH), qui sont des indices de lésions myocardiques (Fig. 3).

Indice de biochimie sanguine chez la souris exposée au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ suspension ou solution saline comme indiqué par injection intrapéritonéale une fois par jour pendant 14 jours. * par rapport au témoin, P < 0,05 ; # par rapport au témoin, P < 0,01. un Indice de biochimie pour les biomarqueurs de la fonction hépatique. b Indice de biochimie pour les biomarqueurs de la fonction rénale. c Indice de biochimie pour le biomarqueur des lésions myocardiques

Ces résultats suggèrent que des doses élevées de TiO₂ peut causer de graves dommages au foie, aux reins, au cœur et à d'autres organes de manière dose-dépendante.

Toxicité hépatique du Nano-TiO₂ chez les souris

Nous avons en outre évalué la toxicité hépatique du nano-TiO₂ . En utilisant la microscopie optique, nous avons constaté qu'il n'y avait pas de changement significatif dans le foie des souris exposées à de faibles doses (i.p. pendant 14 jours, 5 mg/kg) de nano-TiO₂ (Fig. 4a, b). Nous avons observé une obstruction et une dilatation vasculaires marquées (Fig. 4c, 50 mg/kg), une augmentation des basophiles (Fig. 4d, 100 mg/kg), une ischémie partielle dans le foie (Fig. 4e, 150 mg/kg) et une obstruction des veines centrales (Fig. 4f, 200 mg/kg) chez des souris exposées au nano-TiO₂ (i.p.).

Histologie des foies de souris traitées au nano-TiO₂ exposé au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ suspension ou solution saline comme indiqué par injection intrapéritonéale une fois par jour pendant 14 jours. un Contrôler. b TiO₂ , 5 mg/kg. c TiO₂ , 50 mg/kg. d TiO₂ , 100 mg/kg. e TiO₂ , 150 mg/kg. f TiO₂ , 200 mg/kg

Cependant, en utilisant la MET, nous avons trouvé un léger gonflement des mitochondries dans les hépatocytes et la présence de chromatine condensée et de cellules apoptotiques dans les tissus hépatiques chez les souris exposées à de faibles doses de nano-TiO₂ (gavage pendant 60 jours, 5 mg/kg) (Fig. 5a, b). Nous avons observé des nano-TiO₂ dans les mitochondries des hépatocytes, gonflement des mitochondries et vacuoles dans les mitochondries des cellules hépatiques de souris traitées avec 10 mg/kg de nano-TiO₂ (gavage pendant 60 jours, Fig. 5c). Nous avons en outre observé un effondrement du nucléole, une chromatine dispersée, une apoptose évidente et/ou des corps apoptotiques dans les cellules hépatiques de souris traitées avec 50 mg/kg de nano-TiO₂ (gavage pendant 60 jours, fig. 5d). Les résultats ont indiqué que le nano-TiO₂ peut entraîner des dommages pathologiques dans les cellules hépatiques aux niveaux subcellulaire et cellulaire.

Structure ultramicroscopique des hépatocytes chez la souris exposée au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ comme indiqué par gavage une fois par jour pendant 60 jours. Les souris du groupe témoin ont reçu 0,5 % de CMC (carboxyméthylcellulose). un Contrôle (×8000). b TiO₂ (5 mg/kg) (×8000). c TiO₂ (10 mg/kg) (×10 000). Les flèches indiquent les mitochondries et les vacuoles dans les mitochondries. d TiO₂ (50 mg/kg) (× 10 000)

Le traitement des souris avec 5 mg/kg de nano-TiO₂ pendant 60 jours n'a pas modifié les niveaux de ROS tels que O ²⁻ , H₂ O₂ , monoxyde d'azote (NO) et MDA (Fig. 6), ou les niveaux d'ARNm des gènes SOD, CAT, GSHPx, MT, GST, HSP70, P53 et TF dans les tissus hépatiques (Fig. 7). Traitement des souris avec 10 ou 50 mg/kg de nano-TiO₂ pendant 60 jours a entraîné une augmentation significative des niveaux d'O ²⁻ , H₂ O₂ , NO et MDA (Fig. 6), diminution des niveaux d'ARNm des gènes SOD, CAT, MT, GST, HSP70, P53, TF et GSHPx, et augmentation des niveaux d'ARNm des gènes CYP1A dans le foie des souris ( Fig. 7). Les résultats ont montré que des doses élevées de nano-TiO₂ -stress oxydatif induit et modifications de l'expression des gènes protecteurs dans le foie des souris exposées.

Taux de production de ROS et niveaux de peroxydation lipidique dans le foie de souris exposées au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ comme indiqué par gavage une fois par jour pendant 60 jours. Les souris du groupe témoin ont reçu 0,5 % de CMC (carboxyméthylcellulose). * par rapport au témoin, P < 0,05, normalisé par rapport aux protéines totales

Niveaux d'expression relatifs des gènes dans le foie de souris exposées au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ comme indiqué par gavage une fois par jour pendant 60 jours. Les souris du groupe témoin ont reçu 0,5 % de CMC (carboxyméthylcellulose). * par rapport au témoin, P < 0,05 ; # par rapport au témoin, P < 0,01, normalisé en β-actine

Toxicité cérébrale du dioxyde de titane à l'échelle nanométrique chez la souris

Nous avons également évalué la toxicité cérébrale du nano-TiO₂ . Nous avons d'abord examiné les rapports poids cerveau/poids corporel chez les souris exposées au nano-TiO₂ (i.p. pendant 14 jours). De faibles doses (5, 10, 50 mg/kg) n'ont pas modifié les rapports poids cerveau/poids corporel, et des doses plus élevées (100, 150, 200 mg/kg) ont significativement diminué les rapports poids cerveau/poids corporel d'une manière dose-dépendante. manière (Fig. 2). La concentration de Ti dans les tissus cérébraux a été significativement augmentée de manière dose-dépendante (Fig. 1).

Nous avons également examiné les changements histologiques dans le cerveau de souris exposées au nano-TiO₂ (i.p. pendant 14 jours) par coloration à l'hématoxyline. Nous avons observé que de faibles doses de nano-TiO₂ (50 mg/kg) n'a pas modifié l'histologie du tissu cérébral chez la souris après une injection i.p. exposition pendant 14 jours (Fig. 8a, b). Traitement de souris avec 100 mg/kg de nano-TiO₂ a entraîné des cellules nerveuses rompues et fissurées dans le tissu cérébral (Fig. 8c). Traitement de souris avec 150 mg/kg de nano-TiO₂ a entraîné une invasion de cellules inflammatoires dans le tissu cérébral (Fig. 8d). Les résultats ont montré que des doses élevées de nano-TiO₂ peut causer des dommages morphologiques au tissu cérébral, entraînant une réaction inflammatoire.

Modifications pathologiques du tissu cérébral de souris exposées au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ suspension ou solution saline comme indiqué par injection intrapéritonéale une fois par jour pendant 14 jours. un Contrôler. b 50 mg/kg. c 150 mg/kg. d 200 mg/kg

Nous avons déterminé les effets du nano-TiO₂ sur l'état redox et les molécules signal dans le tissu cérébral de souris exposées au nano-TiO₂ (i.p. pendant 14 jours). Nous avons observé qu'une faible dose (5 mg/kg) de nano-TiO₂ n'a pas changé O ²⁻ , H₂ O₂ et les niveaux de MDA, n'ont pas modifié les activités des enzymes antioxydantes APX, CAT, GSHPx et SOD, ni les niveaux d'antioxydants non enzymatiques ASA/DASA et GSH/GSSG. Il n'a pas non plus modifié l'activité de l'oxyde nitrique synthase (NOS) et les niveaux de NO dans les tissus cérébraux (figures 9 et 10). Des doses plus élevées de nano-TiO₂ augmenté O ²⁻ , H₂ O₂ , et les niveaux de MDA, ont diminué les activités des enzymes antioxydantes APX, CAT, GSHPx et SOD, ont diminué les niveaux des antioxydants non enzymatiques ASA/DASA et GSH/GSSG, ont augmenté les niveaux de NO et les activités de NOS, et ont diminué les niveaux d'AchE et de glucose sanguin (GLU) dans les tissus cérébraux (Figs. 9 et 10). Ces résultats suggèrent que le nano-TiO₂ peut causer des dommages au cerveau chez la souris après une injection i.p. exposition.

Ratios ASA/DASA et GSH/GSSG du cerveau chez les souris exposées au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ suspension ou solution saline comme indiqué par injection intrapéritonéale une fois par jour pendant 14 jours

Modifications des activités des ROS, des enzymes antioxydantes, de la signalisation du NO, du glutamate et de l'AchE dans le cerveau de souris exposées au nano-TiO₂ . Les souris ont été traitées avec du nano-TiO₂ suspension ou solution saline comme indiqué par injection intrapéritonéale une fois par jour pendant 14 jours. N = 10, * par rapport au témoin, P < 0,05 ; # par rapport au témoin, P < 0,01. un Modification des ROS (O2-, H2O2 et MDA) dans le cerveau de souris exposées au nano-TiO2. b Modification des enzymes antioxydantes (SOD, CAT, APX et GSHPx) dans le cerveau de souris exposées au nano-TiO2. c Modification des composants de signalisation du NO (cNOS, iNOS et NO) dans le cerveau de souris exposées au nano-TiO2. d Modification de la teneur en glutamate et de l'activité AchE dans le cerveau de souris exposées au nano-TiO2

Effet toxique du Nano-TiO₂ sur les embryons de souris Ex Vivo

Évaluer la toxicité développementale du nano-TiO₂ , nous avons d'abord comparé la croissance et le développement d'embryons in vivo et d'embryons ex vivo. Les résultats ont montré que la croissance et le développement des embryons ex vivo étaient similaires à ceux des embryons in vivo (données non présentées). Par conséquent, nous avons utilisé des embryons ex vivo pour étudier les effets toxiques du nano-TiO₂ sur les embryons.

Nous avons étudié les effets de différentes doses (concentrations finales 0,0, 50,0, 100,0 et 200,0 μg/mL) et différents temps d'exposition de micro-TiO₂ /nano-TiO₂ sur la croissance et le développement embryonnaires ainsi que sur la morphologie des tissus et des organes en examinant le diamètre VXY embryonnaire, la longueur de la couronne au croupion, la longueur de la tête et le nombre de sections du corps. Les résultats ont montré que le micro-TiO₂ n'a modifié ces indicateurs à aucune dose (tableau 2).

Pour différentes tailles de nano-TiO₂ , traitement des embryons de 5-10 nm, 60 nm, 90 nm avec 50,0 μg/mL TiO₂ n'a eu aucun effet sur le diamètre VXY de l'embryon, la longueur de la couronne et du croupion, la longueur de la tête et le nombre de sections du corps (tableau 2). Des doses plus élevées (100,0 et 200,0 μg/mL) ont diminué le diamètre VXY, la longueur de la couronne et du croupion, la longueur de la tête et le nombre de sections du corps, et ont augmenté le taux de malformations (tableau 2). Pour la même dose, il n'y avait pas de différence évidente entre les groupes traités avec différentes tailles de nano-TiO₂ , 50,0 ou 100 μg/mL. Traitement des embryons avec 200 μg/mL de nano-TiO₂ diminution significative du diamètre VXY, de la longueur de la couronne et du croupion, de la longueur de la tête et du nombre de sections du corps des embryons de souris avec l'augmentation de la taille du nano-TiO₂ particules (tableau 2).

Traitement d'embryons de souris avec du micro-TiO₂ (200,0 μg/mL) pendant 16, 24 et 48 h n'ont pas modifié le diamètre VXY, la longueur de la couronne et du croupion, la longueur de la tête et le nombre de sections du corps (tableau 3). Traitement d'embryons de souris avec du nano-TiO₂ (5-10 nm et 60 nm, 90 nm, 200,0 μg/mL) pendant 16 h n'ont pas non plus modifié le diamètre VXY, la longueur de la couronne et du croupion, la longueur de la tête et le nombre de sections du corps (tableau 3). Cependant, le traitement des embryons de souris avec des nano-TiO₂ (5-10 nm et 60 nm, 90 nm, 200,0 μg/mL) pendant 24 et 48 h ont diminué le diamètre VXY, la longueur de la couronne et du croupion, la longueur de la tête, le nombre de sections du corps et ont augmenté le taux de malformation (tableau 3). Pour le même temps d'exposition, il n'y avait aucune différence dans le diamètre VXY, la longueur de la couronne et du croupion, la longueur de la tête, le nombre de sections du corps ou le taux de malformation entre les groupes de différentes tailles de nano-TiO₂ particules (tableau 3).

En résumé, ces résultats indiquent que le nano-TiO₂ had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO₂ particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO₂ particles.

Discussion

Nano-TiO₂ has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO₂ exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO₂ , using mice models. We find that nano-TiO₂ accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO₂ significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO₂ significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO₂ do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO₂ may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.

In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO₂ , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO₂ in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO₂ generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO₂ can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO₂ liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.

In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe₂ O₃ nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO₂ on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO₂ may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.

We find that the micro-TiO₂ and low doses of nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO₂ (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO₂ in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO₂ does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO₂ . This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO₂ , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO₂ may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO₂ concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO₂ is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO₂ particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles (Table 2).

In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO₂ . This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO₂ is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO₂ in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO₂ can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO₂ can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO₂ . Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO₂ .

Conclusions

Ingested nano-TiO₂ can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO₂ causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO₂ has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO₂ particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particules. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO₂ exposure on human health.

Abréviations

ALB:

Albumin

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

BUN:

Blood urea nitrogen

CK:

Creatine kinase

cNOS:

Constitutive nitric oxide synthases

HBDH:

Hydroxybutyrate dehydrogenase

ICR:

Imprinting control region

iNOS:

Inducible NOS

LAP:

Qleucine aminopeptidase

LDH:

Lactate dehydrogenase

Nano-TiO₂ :

Nanoscale titanium dioxide

PChe:

Butyrylcholinesterase

ROS:

Reactive oxygen species

TBIL:

Total bilirubin

TP:

Total protein

UA :

Acide urique