Nanosystème GAL-GNR-siBRAF : silencage ciblé du gène BRAF et photothermie pour stopper la croissance de l'hépatome

Résumé

Le cancer du foie est l'une des tumeurs les plus courantes dans le monde. Les inhibiteurs de la kinase RAF sont efficaces dans le traitement du carcinome hépatocellulaire (CHC) ; l'inhibition de la voie BRAF/MEK/ERK est donc devenue une nouvelle stratégie thérapeutique. Cependant, les systèmes de délivrance ciblée spécifiques aux tumeurs restent un obstacle majeur aux applications cliniques. Le galactose (GAL) peut cibler le récepteur asialoglycoprotéique (ASGPR) fortement exprimé sur les cellules cancéreuses du foie. Dans cette étude, nous avons conçu un nanomatériau multifonctionnel GAL-GNR-siBRAF composé de trois parties : le GAL comme moiety de ciblage du cancer du foie, les nanobâtonnets d'or (GNR) offrant une capacité photothermique sous lumière proche infrarouge, et l'ARNi ciblant spécifiquement BRAF (siBRAF). Le nanovecteur GAL-GNR-siBRAF a montré une grande capacité de chargement d'ARNi et a inhibé la dégradation de l'ARNi dans le sérum. Comparé aux nanobâtonnets d'or nus, GAL-GNR-siBRAF possède une biotoxicité plus faible et une efficacité de silencage génique plus élevée. Le traitement par GAL-GNR-siBRAF a significativement diminué l'expression de BRAF et altéré la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses du foie. De plus, les effets photothermiques combinés et l'invalidation de BRAF par GAL-GNR-siBRAF ont efficacement entraîné la mort des cellules tumorales. Notre étude a développé un nouveau type de nanomatériau multifonctionnel ciblé pour le traitement du cancer du foie, ouvrant des pistes pour de nouvelles méthodes thérapeutiques cliniques.

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un problème majeur de santé mondiale. C'est le sixième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. La plupart des cas surviennent en Asie de l'Est et en Afrique subsaharienne, mais l'incidence augmente dans certains pays développés. Le traitement standard du CHC précoce est la résection chirurgicale, avec un taux de survie à 5 ans de 89-93 %. Malheureusement, seulement 20-30 % des patients sont diagnostiqués précocement ; plus de 70 % sont découverts à un stade avancé et ne peuvent pas bénéficier de chirurgie. Les autres options incluent la transplantation hépatique, la chimioembolisation transartérielle (TACE) et la chimiothérapie systémique, mais elles sont limitées par la disponibilité des donneurs, l'embolisation incomplète, les effets secondaires significatifs et un pronostic global médiocre. De nouvelles méthodes de traitement du CHC sont donc cliniquement très demandées.

La voie de signalisation RAS/RAF joue un rôle essentiel dans le développement du cancer du foie, et BRAF est l'un des gènes cancéreux essentiels de cette voie. Les altérations génétiques de ces gènes entraînent souvent deux cascades de désordres. L'activation anormale de la voie RAS/RAF est associée à un mauvais pronostic. BRAF est le gène le plus fréquemment muté dans la famille RAF, et le ciblage de la voie RAS/RAF est une stratégie thérapeutique novatrice pour le CHC. Depuis que l'inhibiteur de kinase RAF sorafénib s'est avéré utile dans le traitement du CHC, les mutations de BRAF sont devenues une cible privilégiée. Plus spécifiquement, elles sont une cible désirable pour le CHC avancé, le développement clinique du sorafénib ayant été validé en Asie, Europe et USA. Comparé au placebo, le sorafénib augmente la survie globale. Cependant, le sorafénib a une faible capacité de ciblage tumoral, entraînant des effets secondaires comme l'hypertension, la perte de cheveux et les nausées. Des médicaments ciblant le cancer du foie avec une haute spécificité et bloquant RAF restent à explorer.

Le récepteur asialoglycoprotéique (ASGPR), aussi appelé récepteur galactose du foie, est une lectine de type C exprimée à la surface sinusoïdale des hépatocytes. L'ASGPR est une cible essentielle pour les nanostructures hépatiques car il lie, internalise et élimine les substances à résidus galactose terminaux. Plusieurs monosaccharides (galactose, mannose, lactose, N-acétylgalactosamine, acide sialique) interagissent avec l'ASGPR, le galactose montrant la plus haute affinité. Comme l'ASGPR est fortement exposé à la surface des cellules parenchymateuses hépatiques, le récepteur a une forte affinité pour le galactose et les prodrogues ou systèmes de délivrance galactosylés ciblant le foie. Les nanoparticules, micelles et liposomes de galactose ont été identifiés comme systèmes de délivrance ciblant spécifiquement les cellules carcinoïdes hépatocellulaires.

Les nanobâtonnets d'or (GNR) sont des nanoparticules d'or en forme de bâtonnet avec des avantages significatifs comme nanovecteurs. Ils ont une excellente biocompatibilité et peuvent délivrer稳定 l'ARNi ; leur grande surface spécifique permet une modification flexible avec des adaptateurs de ciblage tumoral ; leur résonance de plasmon de surface localisée (LSPR) offre une haute efficacité de conversion photothermique sous irradiation proche infrarouge, en faisant d'excellents matériaux anti-tumoraux photothermiques. L'efficacité photothermique maximale est atteinte en ajustant le rapport d'aspect des GNR. La toxicité in vitro et in vivo des nanoparticules d'or dépend de leur taille, charge de surface et revêtement. Cependant, le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), agent essentiel dans la synthèse des GNR, a une cytotoxicité apparente limitant les applications biologiques.

L'interférence par ARN (RNAi) est devenue une approche prometteuse pour le traitement du cancer car elle inactive ou silence efficacement les gènes cibles par de petits ARNi (siRNA). Récemment, des molécules d'ARNi sont entrées en phase d'essais cliniques et sont considérées comme prometteuses pour traiter les cancers à gènes multiples mutés. Cependant, l'application de l'ARNi fait face à d'énormes défis : instabilité sérique (dégradation par les nucléases), effets hors-cible, et charge négative empêchant la liaison aux membranes cellulaires également négatives. L'ARNi lui-même ne peut donc pas être délivré directement aux cellules. La stabilité de l'ARNi peut être améliorée par modification chimique ou insertion dans des matériaux vecteurs protecteurs.

Dans cette étude, nous avons construit un nouveau nanovecteur multifonctionnel GAL-GNR-siBRAF. Le système utilise des nanobâtonnets d'or à capacité thermique optique comme cœur interne et du GAL (D-galactose) modifié en externe pour le ciblage spécifique des tumeurs hépatiques. Ce système a réduit la toxicité biologique du CTAB à la surface des GNR, a montré une grande capacité de chargement d'ARNi et peut silencer efficacement le gène BRAF dans le cancer du foie. L'application de GAL-GNR-siBRAF a significativement atténué la prolifération, l'invasion et la migration des cellules cancéreuses du foie. De plus, GAL-GNR-siBRAF a simultanément induit le silencage de BRAF et des effets photothermiques, réalisant une efficacité synergique dans la capacité de destruction des cellules tumorales, offrant une nouvelle voie de réflexion pour le développement clinique du traitement du cancer du foie.

Matériaux et méthodes

Lignée cellulaire

La lignée de carcinome hépatocellulaire murin Hepa1-6 a été achetée auprès de la Banque de cellules souches, Académie chinoise des sciences. Les cellules étaient cultivées en milieu DMEM (Life Technologies) contenant 10 % de FBS à 37 °C avec 5 % de CO₂.

Synthèse de l'ARNi BRAF

La séquence de l'ARNi ciblant le gène BRAF est 5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′, synthétisée par Dharmacon, Inc. L'ARNi ciblant la luciférase (siGL2) disponible commercialement a servi de contrôle négatif.

Synthèse des GNR-CTAB

Les nanobâtonnets d'or solubles dans l'eau ont été synthétisés par une méthode de croissance assistée par germes. La solution germe : 1 mL de CTAB (0,2 M) mélangé à 1 mL de HAuCl₄ (0,5 mM), agité à 28 °C, puis 0,12 mL de NaBH₄ froid (0,01 M) ajouté jusqu'à ce que la solution devienne brune. La solution de croissance : 50 mL de CTAB (0,2 M) et 50 mL de HAuCl₄ (1 mM), 2,5 mL d'AgNO₃ (4 mM) mélangés à 28 °C. Après mélange, 670 μL d'acide ascorbique (0,079 M) ajouté (couleur passe de jaune foncé à incolore). 120 μL de solution germe ajoutés sous agitation douce à 28 °C, la couleur devient progressivement transparente de pourpre à pourpre-noir. Après 24 h d'agitation à température constante, centrifugation à 12 000 tr/min pendant 10 min pour éliminer l'excès de CTAB et lyophilisation en poudre de GNR.

Synthèse de MUA-PEI et GAL-PEI-MUA

L'acide mercaptoundécanoïque (MUA, 654 mg) dissous dans 30 mL de chloroforme, incubé avec 100 mmol d'EDC et 100 mmol de NHS pendant 15 min à température ambiante. Puis 100 mmol de polyéthylèneimine (PEI) ajoutés. Après 24 h à température ambiante, extraction par volume égal d'eau déionisée pour obtenir PEI-MUA hydrosoluble. Même méthode pour l'activation du D-galactose en solution aqueuse. Ensuite, excès de D-galactose activé (500 mmol) ajouté à la solution PEI-MUA, réaction 24 h à température ambiante pour obtenir le complexe hydrosoluble GAL-PEI-MUA.

Synthèse de GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) et PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

Poudre de CTAB-GNR lyophilisée (10 mg) suspendue dans 10 mL de complexe PEI-MUA ou GAL-PEI-MUA hydrosoluble. Le CTAB remplacé par liaison Au-S sous agitation à température ambiante pendant 24 h. Centrifugation à 12 000 tr/min pendant 15 min, surnageant éliminé, précipité lavé 3 fois à l'eau distillée. Poudres PEI-GNR ou GAL-GNR préparées par lyophilisation, pesées, dissoutes dans l'eau sans ribonuclease, et effet de résonance plasmonique observé par analyseur multifonctionnel (Spectra Max M5e).

Microscopie électronique à transmission

GNR ou GAL-GNR suspendus dans l'eau distillée, redéposés sur grille de cuivre. Après séchage 30 min à l'air, imagerie par MET (LIBRA 120, Carl Zeiss).

Analyse UV-Visible

GNR, PEI-GNR ou GAL-GNR suspendus dans l'eau distillée. Effet de résonance plasmonique de surface des nanomatériaux dans la gamme 600-900 nm examiné par lecteur de microplaques multifonctionnel (SpectraMax M5e).

Analyse du potentiel zêta et diamètre hydrodynamique

GNR, PEI-GNR ou GAL-GNR suspendus dans l'eau distillée, potentiel zêta et diamètre hydrodynamique mesurés sur Zetasizer Nano ZS.

Analyse par résonance magnétique nucléaire

Poudre de GAL-GNR lyophilisée dissoute dans eau lourde (99 %, Sigma) pour suspension homogène, transférée dans tube RMN. Composition de GAL-GNR déterminée par RMN (Bruker, 600 MHz).

Test de retard sur gel

GAL-GNR et siBRAF mélangés selon rapports massiques (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Après incubation 30 min à température ambiante, tampon de chargement ADN ajouté. Tous échantillons déposés sur gel d'agarose 2 % contenant 0,01 % Goldview et électrophorés à 90 V pendant 30 min. Degré d'enrobage du siBRAF visualisé sur système d'imagerie de gel.

Stabilité de l'ARNi dans le sérum

Mélange GAL-GNR-siBRAF (6:1) incubé dans sérum murin frais à 37 °C pendant 0, 3, 6, 12, 24, 48 h. Groupe siBRAF nu + sérum murin frais traité dans mêmes conditions. Volume égal de SDS 2 % ajouté à la solution GAL-GNR-siBRAF. Après incubation 30 min à température ambiante, tampon de chargement ADN ajouté, tous échantillons déposés sur gel d'agarose 2 % (0,02 % Goldview) et électrophorés à 90 V pendant 30 min. Intensité des bandes du siBRAF visualisée sur système d'imagerie de gel.

Test d'inhibition compétitive de GAL-GNR-siBRAF

2 × 10⁵ cellules Hepa1-6 cultivées en plaques 12 puits overnight. Cellules pré-traitées par acide lactobionique pendant 12 h puis transféctées avec GAL-GNR-siBRAF (Cy3 marqué) pendant 30 min. Intensité de fluorescence intracellulaire déterminée par microscopie à fluorescence (barre d'échelle = 200 μm).

Capacité de délivrance ciblée du cancer du foie par GAL-GNR-siBRAF

1 μg de siBRAF marqué Cy3 incubé avec PEI-GNR (30 μg/mL) ou GAL-GNR (30 μg/mL) pendant 20 min à température ambiante, puis ajouté au milieu des cellules Hepa1-6. Après incubation 30 min, cellules lavées 3 fois avec 50 % FBS, intensité de fluorescence mesurée au microscope à fluorescence.

Effets photothermiques

20, 40, 60, 80, 100 μg de GAL-GNR et 100 μg de poudre de GNR lyophilisée dissous dans 1 mL d'eau distillée. Solution ajoutée en plaque 24 puits et irradiée en continu par laser proche infrarouge 803 nm (2 W/cm²) pendant 15 min. Température enregistrée par thermomètre infrarouge toutes les 0,5 min pendant 5 premières min, puis toutes les 1 min.

Test MTT

200 μL de cellules (3,5 × 10⁴/mL) cultivées en plaques 96 puits 24 h, puis incubées avec différentes concentrations de GNR ou GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/mL). Après 24 ou 48 h, 20 μL MTT ajoutés, incubation 4 h supplémentaire. Cristaux pourpres dissous dans 150 μL DMSO, analyse spectrophotométrique à 490 nm (référence 650 nm) sur lecteur de microplaques (SpectraMax M5e).

Test de coloration Calcein-AM et PI

Cellules Hepa1-6 (1,5 × 10⁵) maintenues overnight en plaque 12 puits, traitées avec PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL : 1 μg), GAL-GNR-siGL2 (30 μg/mL : 1 μg) + laser ou GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL : 1 μg) + laser pendant 4 h, puis irradiées par lumière proche infrarouge (808 nm, 2 W/cm²) pendant 15 min. Cytotoxicité de GAL-GNR détectée par coloration Calcein-AM (cellules vivantes) et PI (cellules mortes). Fluorescence verte Calcein-AM et rouge PI photographiées au microscope à fluorescence.

PCR quantitative en temps réel

ARN total extrait par Trizol, utilisé comme matrice pour synthèse d'ADNc. Q-PCR réalisée avec amorces spécifiques (0,5 μL × 10 μM chacune) sur système Stratagene Mx3000P (Agilent Technologies). SYBR Green PCR MasterMix (Life Technologies) utilisé selon protocole. Gène de référence β-actin. Séquences amorces : β-actin : 5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′ (forward) et 5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′ (reverse) ; BRAF : 5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (forward) et 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (reverse). Différence d'expression calculée par méthode 2⁻ΔΔCt.

Western Blot

Protéines totales extraites par tampon RIPA (Cell Signaling), quantifiées par acide bicinchonique (BCA). Protéines séparées en SDS-PAGE 12 % et transférées sur membrane PVDF. β-actin comme référence interne pour détecter l'expression de la protéine BRAF. Bandes protéiques détectées par chimiluminescence ECL.

Test de griffure

Cellules Hepa1-6 transféctées (1,7 × 10⁵/mL) ensemencées en plaques 12 puits overnight. Cellules adhérentes griffées avec pointe de pipette 10 μL. Lavées 2 fois au PBS, milieu remplacé par milieu 2 % FBS. Largeur moyenne de la ligne de griffure observée au microscope après 0, 24, 48 h. Chaque test en triplicat.

Test Transwell pour migration et invasion

Chambres Transwell 8 μm (Corning Life Science) utilisées. Cellules Hepa1-6 en 200 μL milieu sans sérum ajoutées chambre supérieure à 1,7 × 10⁵ cellules/mL/puits, 500 μL milieu 12 % FBS en chambre inférieure. Après incubation 24-48 h, cellules fixées 30 min avec paraformaldéhyde 4 %, colorées 30 min avec violet de cristal 1 %. Cellules photographiées et comptées au microscope inversé. Pour test d'invasion, revêtement gel ECM requis, étapes restantes identiques.

Statistiques

Toutes expériences en triplicat. Données exprimées comme moyenne ± écart-type, test t de Student (bilatéral) pour différence entre deux méthodes. ANOVA à un facteur pour comparaison de multiples groupes. Significativité statistique à p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Résultats

Synthèse et caractérisation du nanovecteur GAL-GNR-siBRAF

Nous avons conçu un nouveau nanovecteur GAL-GNR capable de délivrer de l'ARNi aux cellules hépatiques tout en conservant l'effet photothermique des nanobâtonnets d'or. La procédure de synthèse de GAL-GNR est montrée dans le Schéma 1. Ce système ciblé hépatique contient trois composants fonctionnels. Premièrement, la base de GAL-GNR est un squelette GNR d'environ 30 nm de long et 10 nm de diamètre, comme le montre l'image MET (Fig. 1a) et les GNR chimiquement conjugués (GAL-GNR) ne montrent pas de changement dimensionnel significatif et conservent une bonne dispersibilité (Fig. 1b). Les données de taille particulaire montrent une taille moyenne de GNR de 30,23 nm (cohérence avec MET), et la taille de GAL-GNR (50 nm) et PEI-GNR (42,35 nm) est plus grande que GNR car la conjugaison de GAL et PEI augmente l'hydratation inter-particulaire (Fig. 1c). Deuxièmement, le CTAB biologiquement toxique à la surface des GNR a été remplacé par du MUA-PEI chargé positivement qui peut charger l'ARNi chargé négativement. La mesure du potentiel zêta montre que la charge de surface des GNR augmente de 35,6 à 42,7 mV ou 41,8 mV lors de la modification par PEI ou GAL-PEI, indiquant que GAL-GNR possède une forte capacité de liaison à l'ARNi (Fig. 1d). Troisièmement, nous avons utilisé GAL comme molécule guide pour conjuguer les nanovecteurs GNR, permettant l'homing spécifique du carcinome hépatocellulaire. La spectroscopie d'absorption UV-Vis a été utilisée pour détecter préliminairement la structure des GNR modifiés. La longueur d'onde d'absorption initiale des GNR non modifiés était 763 nm ; un décalage de 7 nm observé initialement avec la modification MUA-PEI, et un autre décalage de 8 nm à la fin de la synthèse lors de la modification réussie des GNR par GAL (Fig. 1e). Pour confirmer GAL dans le nanosystème, l'image RMN a analysé les groupes chimiques. Les résultats montrent que le signal H du galactose n'a été trouvé que dans le spectre GAL-GNR sur le spectre RMN proton, à δ : 3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53. Les spectres RMN confirment la structure chimique de GAL, prouvant sa conjugaison réussie à la surface des GNR (Fig. 1f).

Capacité d'encapsulation de l'ARNi et stabilité de GAL-GNR

Le nanosquelette GAL-GNR modifié par PEI chargé positivement peut se combiner à l'ARNi chargé négativement par interaction électrostatique. Nous avons utilisé le test de retard sur gel pour évaluer la capacité de liaison de l'ARNi par GAL-GNR. L'ARNi libre migre dans le gel tandis que l'ARNi lié est ralenti ou totalement arrêté. De plus, l'ARNi lié ne se lie plus efficacement au bromure, et l'intensité de fluorescence diminue. Le résultat d'électrophorèse sur gel montre que le rapport optimal pour saturer GAL-GNR avec siBRAF est 6:1 (p/p) (Fig. 2a).

L'ARNi nu est très dégradable, surtout in vivo. Une fonction importante du système de délivrance est de protéger l'ARNi de la dégradation. Nous avons testé l'effet protecteur du nanovecteur GAL-GNR sur l'ARNi dans du sérum frais. Comparé à l'ARNi nu, l'ARNi lié persiste plus longtemps dans le sérum. Comme montré Fig. 2b, l'ARNi nu existe jusqu'à 12 h dans le sérum tandis que l'ARNi lié reste abondant après 48 h. Cela démontre que GAL-GNR empêche efficacement la dégradation de l'ARNi dans le sérum, assurant une délivrance ciblée in vivo.

Cytotoxicité des nanomatériaux

La faible toxicité biologique est une propriété importante des nanomatériaux pour le traitement du cancer. Pour évaluer la biocompatibilité de ce nouveau nanostructure GAL-GNR, nous avons testé sa cytotoxicité. Comme montré Fig. 3, des cellules mortes Hepa1-6 sont observées dans le groupe GNR non modifié dès 30 μg/mL. Après incubation avec 75 μg/mL GNR pendant 24 h, le taux de mortalité atteint 56,09 %, et 75,5 % après 48 h. À l'inverse, la modification par GAL réduit significativement la cytotoxicité. Après 48 h d'incubation avec GAL-GNR, plus de 80 % des cellules restent vivantes même à haute concentration (105 μg/mL). Ces données suggèrent que le nanovecteur GAL-GNR a une haute biocompatibilité comparé aux GNR, assurant la sécurité d'application.

Délivrance ciblée d'ARNi aux cellules d'hépatome et silencage du gène BRAF in vitro

La capacité de délivrer l'ARNi dans les cellules cancéreuses est une fonction cruciale des nanomatériaux. Pour étudier le potentiel de GAL-GNR dans la délivrance d'ARNi, nous avons détecté l'efficacité du silencage génique en utilisant siBRAF chargé par GAL-GNR dans les cellules Hepa1-6. Comparé au groupe témoin, l'expression de BRAF dans les cellules transféctées avec GAL-GNR-siGL2 (contrôle négatif) ne change pas, tandis que les cellules transféctées avec GAL-GNR-siBRAF montrent une diminution significative (Fig. 4a). L'effet de silencage est dose-dépendant, corrélé à l'augmentation de la concentration de GAL-GNR. Les résultats qPCR démontrent que la concentration idéale de transfection de GAL-GNR-siBRAF est 30 μg/mL, avec une efficacité de silencage atteignant 90,29 %, similaire au groupe lipofectamine 2000 (contrôle positif). Le résultat de Western blot est cohérent avec le qPCR, l'expression protéique de BRAF étant diminuée après 48 h de transfection (Fig. 4b).

L'acide lactobionique, structuralement similaire au GAL, peut se lier compétitivement à l'ASGPR exprimé à la surface des cellules de carcinome hépatocellulaire. Pour confirmer l'efficacité de ciblage spécifique de GAL-GNR, les cellules Hepa1-6 ont été pré-incubées avec l'acide lactobionique puis transféctées avec GAL-GNR-siBRAF. Cellules non traitées comme témoin, lipofectamine 2000 comme contrôle positif. Comme montré Fig. 4c, l'intensité de fluorescence rouge des cellules transféctées avec GAL-GNR était similaire au contrôle positif, tandis que celle des cellules transféctées avec PEI-GNR était significativement réduite. D'autre part, les cellules transféctées avec GAL-GNR-siBRAF seules montraient une fluorescence rouge Cy3 plus forte que les cellules Hepa1-6 pré-traitées avec l'acide lactobionique (Fig. 4c), et le résultat qPCR était cohérent avec la fluorescence (Fig. 4d). Ces résultats illustrent que GAL favorise efficacement l'endocytose de l'ARNi par les cellules Hepa1-6 et peut servir de moiety de ciblage pour le CHC.

Impact de GAL-GNR-siBRAF sur la prolifération, migration et invasion des cellules Hepa1-6

BRAF joue un rôle important dans la voie MAPK, qui régule la prolifération, migration et invasion cellulaires. Pour évaluer l'impact de GAL-GNR-siBRAF sur les cellules de carcinome hépatocellulaire, nous avons analysé la prolifération par test MTT. Comme montré Fig. 5a, la prolifération des cellules Hepa1-6 transféctées avec GAL-GNR-siBRAF était significativement diminuée comparée aux cellules GAL-GNR-siGL2 (contrôle négatif) ou traitées PBS. Ensuite, nous avons étudié l'effet sur la migration par tests de griffure et Transwell. Comparées aux cellules témoins négatifs, la capacité de migration des cellules Hepa1-6 transféctées avec GAL-GNR-siBRAF était évidenteument réduite (Fig. 5b-d).

Pour étudier l'invasion, des tests Transwell ont été effectués. Les résultats montrent que les cellules Hepa1-6 transféctées avec GAL-GNR-siBRAF ont significativement diminué l'invasion comparées à GAL-GNR-siGL2 ou PBS (Fig. 5e-f). Ces résultats impliquent que l'invalidation du gène BRAF par les complexes GAL-GNR-siBRAF réduit efficacement la migration et l'invasion des cellules de carcinome hépatocellulaire.

Traitement combiné effet photothermique et silencage génique de GAL-GNR-siBRAF

Nos études antérieures ont démontré que les nanomatériaux d'or génèrent de l'énergie thermique sous rayonnement proche infrarouge ; ce phénomène est appelé effet photothermique dû aux propriétés LSPR des GNR. Nos résultats montrent qu'avec l'augmentation de la concentration de GAL-GNR, la capacité de production de chaleur augmente. À 100 μg/mL, la température monte rapidement de 24 à plus de 60 °C. De plus, il n'y a pas de différence significative de capacité thermique entre GNR et GAL-GNR (Fig. 6a).

Le nouveau nanosystème GAL-GNR-siBRAF possède trois caractéristiques : ciblage spécifique du cancer du foie, silencage génique de BRAF par ARNi, et effets photothermiques par GNR. Nous avons étudié l'effet thérapeutique synergique dans le traitement anti-tumorale. Les cellules Hepa1-6 sans GAL-GNR conservent une viabilité élevée même sous rayonnement proche infrarouge, suggérant que le laser seul n'a pas d'effet significatif. Une fois l'irradiation laser réalisée sur la base du traitement GAL-GNR-siGL2, l'effet photothermique montre une puissante capacité de destruction des cellules Hepa1-6. Bien que le silencage de BRAF seul induise la mort cellulaire, l'effet n'est pas concluant. Le traitement par GAL-GNR-siGL2 plus irradiation laser a entraîné une capacité de destruction cellulaire beaucoup plus forte que le silencage de BRAF seul (Fig. 6b). Ces données indiquent que le silencage de BRAF et l'effet photothermique peuvent augmenter synergiquement le potentiel de destruction des cellules tumorales.

Discussion

Les difficultés de délivrance ciblée aux tumeurs sont des obstacles majeurs au traitement clinique des tumeurs. Cette étude a démontré pour la première fois le développement d'un nouveau nanovecteur multifonctionnel GAL-GNR-siBRAF, doté de nombreux avantages. Le GAL-GNR modifié possède non seulement une bonne biocompatibilité mais maintient aussi les phénomènes LSPR du squelette GNR et une excellente capacité de conversion photothermique. Les GNR modifiés par GAL peuvent cibler les cellules de carcinome hépatocellulaire via l'ASGPR, avec un grand potentiel en thérapie moléculaire ciblée du CHC. Des études supplémentaires ont montré que le silencage du gène BRAF inhibe la prolifération, migration et invasion des cellules d'hépatome. Il est notable que GAL-GNR-siBRAF montre une capacité de destruction cellulaire plus forte dans la combinaison de l'effet photothermique et du silencage de BRAF.

L'interférence par ARN (RNAi) a attiré beaucoup d'attention pour son rôle crucial dans l'expression et la régulation génique. L'utilisation d'ARNi pour inactiver des gènes spécifiques en séquence dans les cellules cancéreuses pour la thérapie génique est une thérapie génique ciblée efficace et spécifique, devenue un nouvel outil thérapeutique pour de nombreuses maladies dont le cancer. Cependant, la faible stabilité dans le sérum et la faible internalisation cellulaire limitent l'ARNi en application clinique. D'autre part, l'ARNi possède une charge négative l'empêchant de se lier aux membranes cellulaires négatives, et l'ARNi lui-même ne peut être délivré directement dans les cellules. De plus, il y a des problèmes de faible efficacité de transfection et de mauvaise internalisation cellulaire en thérapie ARNi. Ces barrières entravent la délivrance de l'ARNi aux cellules cibles. Pour améliorer la stabilité de l'ARNi et renforcer l'efficacité du silencage génique, nous avons synthétisé un nouveau nanovecteur GAL-GNR-siBRAF avec trois composants (Schéma 1). Ce nanovecteur a une faible taille moléculaire (environ 30 nm longueur, 10 nm diamètre) et une bonne dispersibilité (Fig. 1). De plus, GAL-GNR-siBRAF peut charger efficacement de grandes quantités d'ARNi à faible concentration (Fig. 2a) et protéger l'ARNi de la dégradation par les RNases dans le sérum ; l'ARNi était stable pendant au moins deux jours à 37 °C en présence de sérum murin frais (Fig. 2b).

La bonne biocompatibilité est essentielle pour les nanomatériaux en biothérapie. Le CTAB est un réactif essentiel dans la synthèse des nanobâtonnets d'or bien qu'il ait une cytotoxicité apparente limitant son application biologique. Pour réduire la cytotoxicité, nous avons modifié les GNR par PEI chargé positivement et l'adaptateur de ciblage GAL (D-galactose). Nos résultats montrent que, comparé aux GNR non fonctionnalisés, les GNR modifiés par GAL ont une meilleure biocompatibilité. La viabilité cellulaire reste > 80 % même à très haute concentration (105 μg/mL) de GAL-GNR pendant 48 h (Fig. 3). De plus, la petite taille moléculaire et la forme cylindrique du nanobâtonnet facilitent sa pénétration à travers la membrane cellulaire. Ce phénomène est particulièrement évident en thérapie ciblée des cellules cancéreuses. La nano-construction modifiée par les moieties de ciblage galactose a entraîné une forte accumulation de GAL-GNR-siBRAF dans les cellules tumorales, induisant une downregulation efficace de l'expression du gène BRAF (Fig. 4). Selon les expériences d'inhibition compétitive, GAL-GNR pénètre dans les cellules principalement via les récepteurs de surface ASGPR des cellules Hepa1-6 (Fig. 4c).

Il a été rapporté que le CHC avec forte expression de BRAF et RAF1 tend à avoir une prolifération et croissance rapides. B-Raf et Raf1 agissent principalement en aval de la voie ERK/MAPK, régulant les facteurs nucléaires par amplification en cascade. L'activation de cette voie accélère anormalement la prolifération et la différenciation des cellules CHC. Le gène RAF peut aussi promouvoir l'expression des métalloprotéinases matricielles (MMP), modifiant l'adhésion des cellules tumorales, dégradant la matrice extracellulaire (ECM) et la membrane basale, favorisant l'invasion et la métastase. La kinase BRAF régule la voie RAS-RAF-MEK-ERK, favorisant prolifération, invasion, métastase des cellules tumorales et permettant la mort cellulaire par apoptose. Dans un travail antérieur, nous avons trouvé que le gène BRAF était fortement exprimé dans les cellules Hepa1-6. Nous supposons que l'invalidation de BRAF dans Hepa1-6 bloquera la voie RAS-RAF-MEK-ERK et entraînera des changements biologiques. Pour vérifier, nous avons transfécté des cellules de carcinome hépatocellulaire avec GAL-GNR-siBRAF et trouvé qu'il restreint significativement prolifération, migration et invasion (Fig. 5), offrant une nouvelle stratégie pour le traitement clinique du CHC.

Un autre avantage important des GNR est leur résonance de plasmon de surface localisée (LSPR), qui convertit l'énergie lumineuse absorbée en énergie thermique sous irradiation proche infrarouge, détruisant les cellules. Nous avons exploré la capacité de conversion lumière-chaleur de GAL-GNR, les résultats montrant que GAL-GNR modifié induit efficacement l'énergie thermique sous irradiation proche infrarouge (Fig. 6a). Ensuite, nous avons étudié les effets synergiques de GAL-GNR-siBRAF. Alors que le silencage de BRAF montrait une cytotoxicité limitée, le traitement GAL-GNR-siGL2 + laser avait une capacité de destruction tumorale beaucoup plus forte. Simultanément, la combinaison d'hyperthermie photothermique et de silencage de BRAF pouvait causer plus de 85 % de mort cellulaire (Fig. 6b), indiquant que la synergie de GAL-GNR-siBRAF et des effets photothermiques pourrait être une stratégie idéale pour inhiber le cancer du foie.

Conclusion

Cette étude a montré que GAL-GNR-siBRAF surmonte l'obstacle de la dégradation de l'ARNi, augmentant efficacement sa stabilité dans le sérum in vitro. De plus, GAL-GNR-siBRAF peut délivrer ciblé l'ARNi aux cellules de carcinome hépatocellulaire et réduire l'expression de BRAF, inhibant significativement prolifération, invasion et migration cellulaires. Plus important, GAL-GNR-siBRAF, comme nouveau nanovecteur multifonctionnel, augmente grandement la capacité de destruction des cellules tumorales lorsqu'il est combiné à la lumière proche infrarouge. En conclusion, GAL-GNR-siBRAF a un grand potentiel dans le traitement du carcinome hépatocellulaire et offre de nouvelles idées pour l'application clinique du cancer du foie.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées et matériaux utilisés dans cette étude sont inclus dans le manuscrit et fichiers additionnels correspondants.

Abréviations

GAL :

D-galactose

GNR :

Nanobâtonnets d'or

siBRAF :

Petit ARNi spécifique pour BRAF

CHC :

Carcinome hépatocellulaire

ASGPR :

Récepteur asialoglycoprotéique

TACE :

Chimioembolisation transartérielle

LSPR :

Résonance de plasmon de surface localisée

CTAB :

Bromure de cétyltriméthylammonium

MUA :

Acide mercaptoundécanoïque

EDC :

1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride

NHS :

N-hydroxysuccinimide

PEI :

Polyéthylèneimine

MET :

Microscopie électronique à transmission

RMN :

Résonance magnétique nucléaire

FBS :

Sérum fœtal bovin

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

BCA :

Acide bicinchonique

PVDF :

Fluorure de polyvinylidène