Complexes avancés PAMAM-points quantiques pour immunoessais cliniques rapides

Résumé

Nous rapportons un groupe de complexes utilisés en immunoessais cliniques. Les complexes incluent un anti-IgG lapin de chèvre conjugué PAMAM et un anti-IgG souris de chèvre conjugué points quantiques (QDs). Lorsque des anticorps anti-antigène lapin et souris sont ajoutés, l'antigène correspondant est détecté. L'expérience utilisant ces complexes est simple, commode, courte en temps et en étapes. Elle s'applique aussi à différentes méthodes expérimentales, comme FCM (cytométrie de flux), ICC (immunocytochimie) et IHC (immunohistochimie) pour détecter de nombreux types d'antigènes.

Introduction

Les points quantiques (QDs) sont largement utilisés comme luminophores grâce à leurs rendements quantiques de fluorescence élevés, haute photostabilité et faible photoblanchiment. Ils sont aussi utilisés comme fluorophores organiques en imagerie cellulaire et applications biotechnologiques. En particulier, les QDs contenant du cadmium (CdSe, CdTe) ont des avantages significatifs : sous irradiation même longueur d'onde (430–660 nm), ils ont un spectre d'émission électromagnétique taille-dépendant [1, 2]. Les QDs conjugués anticorps sont donc les sondes les plus prometteuses pour l'imagerie moléculaire.

Le dendrimère polyamidoamine (PAMAM), l'un des macromolécules dendritiques les plus étudiées, a les caractéristiques : grand nombre groupes fonctionnels surface, nombreuses cavités internes, taille nanométrique, haute biocompatibilité. Conjugués avec médicaments et anticorps, ces dendrimères améliorent solubilité et circulation systémique du médicament sans entraver son activité biologique [3]. Les anticorps modifiés PAMAM sont souvent utilisés en immunisation clinique.

Les immunoessais cliniques incluent de nombreuses méthodes : WB, ELISA, IHC, ICC, FCM. Parmi elles, FCM utilisant sondes anticorps spécifiques effectue analyse rapide cellule unique ou particules biologiques au niveau cellulaire/moleculaire. FCM est l'un des immunoessais les plus utilisés. Si criblage cellulaire, sonde anticorps correspondante suffit ; mais si criblage petites molécules biologiques (petite protéine, virus, cytokine), méthode CBA (cytometric bead array) nécessaire car FCM ne détecte pas directement petites cytokines. CBA utilise billes marquées colorant avec anticorps capture spécifiques surface. Mélange billes CBA + échantillon + anticorps marqués colorant → complexes sandwich comme ELISA, petit antigène détecté par FCM.

Cette étude présente un groupe de complexes : anti-IgG lapin chèvre conjugué PAMAM et anti-IgG souris chèvre conjugué QDs. Utilisables pour FCM, ICC, IHC. Ajout anticorps anti-antigène lapin et souris → détection antigène correspondant. Ce modèle détecte nombreux types antigènes, incluant petites protéines, virus, cytokines avec anticorps souris/lapin correspondants. Schéma 1 montre complexes utilisés FCM, exemple HSP27. HSP27 (HSPB1) protéine importante impliquée résistance médicaments, croissance cellulaire, apoptose, tumeur, métastase [4, 5]. Dans ce modèle, PAMAM-anti-IgG lapin chèvre agit comme support et capture, similaire billes CBA, permettant détection petites molécules antigènes par FCM. QDs-anti-IgG souris chèvre agit comme sonde fluorescente. Si antigènes protéines membranaires/intracellulaires, méthode FCM traditionnelle détecte antigènes : seulement ajout QDs, pas PAMAM. Pour protéines intracellulaires/membranaires, cellules = cibles détectables directement FCM ; pas besoin PAMAM pour constituer pseudocellule. Donc complexes peuvent être séparés et utilisés individuellement.

Résultats et discussion

Le groupe de complexes comprend deux parties : partie PAMAM et partie QDs. Partie PAMAM = PAMAM-anti-IgG lapin chèvre. Utilisation dendrimères PAMAM génération 5 amino-terminés (G5 PAMAM) comme agent stabilisant surface pour caractéristiques solubilité idéales milieux aqueux, mais charge positive forte nuisible liaison anticorps. Neutralisation charge positive : PAMAM dissous DMSO + anhydride succinique (dihydro-2,5-dikétotétrahydrofurane) pour neutraliser groupes amino PAMAM. Groupe amino PAMAM réagit anhydride succinique → liaisons amide [6–10]. Après réaction, dialyse, lyophilisation, pesée, redissolution, produit quasi neutre = « N-PAMAM », capable conjugaison anti-IgG lapin chèvre. PAMAM, surtout G5, contient nombreuses cavités, IgG peut être encapsulé dans espaces vides G5 PAMAM [11]. Anti-IgG lapin chèvre dissous tampon MES (0,1 mol/L, pH 6,0), puis EDC et sulfo-NHS (ratio molaire 1:1) ajoutés, incubation 15 min. Enfin N-PAMAM ajouté, incubation 4 °C shaker overnight. Auto-assemblage polymère en solution aqueuse → micelles polymères encapsulant hôtes hydrophobes bas poids moléculaire [12] ; dialyse pour éliminer réactifs non réactifs. Lyophilisation, pesée, redissolution tampon conservation → N-PAMAM-anti-IgG lapin chèvre obtenu.

Spectres fluorescence et UV-Vis N-PAMAM-IgG (anti-lapin chèvre) en MES Fig. 1. Comparé N-PAMAM et IgG, pic émission fluorescence N-PAMAM-IgG intensité la plus faible. Spectre UV-Vis : comparé IgG, tampon MES, PAMAM, N-PAMAM, seul N-PAMAM-IgG pic absorption 200 nm. Spectre fluorescence ou UV-Vis, N-PAMAM-IgG caractéristiques différentes vs N-PAMAM et IgG, prouvant indirectement combinaison N-PAMAM et IgG pas simple mélange. Activité anticorps N-PAMAM-IgG testée ELISA. Fig. 2 : résistance anticorps IgG (anti-lapin chèvre) non perdue couplage N-PAMAM.

Partie QDs = QDs-anti-IgG souris chèvre. Anticorps-QDs formés par réactions couplage croisé, anticorps se lient groupes fonctionnels (carboxyle, amino) surface QDs [13, 14]. Cette étude : QDs cœur/coquille CdSe/ZnS hydrosolubles stabilisés ligands carboxyle + réaction couplage carbodiimide EDC (chlorhydrate 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide). Méthode populaire conjugaison anticorps surface QDs [15–17]. Micelles QDs CdSe/ZnS incubées EDC + sulfo-NHS tampon borate (5 mM BS, pH 7,2). Puis anti-IgG souris chèvre ajouté, incubation 4 °C shaker overnight obscurité. Enfin 10 % BSA (albumine sérique bovine) ajouté bloquer QDs non réactifs, purification centrifugations successives/redissolution éliminer réactifs non réactifs. Activité anticorps QDs-IgG (anti-souris) se maintient 3 mois stockage 4 °C obscurité.

Taille particule QDs-IgG (anti-souris) et QDs tampon conservation (2,5 mM BS, pH 8,0, 0,1 % BSA) Fig. 3a. Après couplage, diamètre produits augmente nettement, bonne homogénéité et stabilité. Clés pour utilisation sonde détection. Spectres fluorescence QDs-IgG et QDs Fig. 3b : pic émission QDs-IgG = QDs, indiquant couplage IgG/QDs n'altère pas caractéristiques optiques QDs, utile immunoessais. Activité anticorps QDs-IgG testée ELISA membrane PVDF. Anticorps souris anti-AKT dilué 1, 10, 100, 200 μg/ml, quatre gradients concentration hybridés QDs-IgG (anti-souris) même concentration 0,1 mg/ml. Après hybridation 40 min 37 °C obscurité, lavage membrane PVDF PBST (pH 6,0, 0,1 % Tween 20) ×3, irradiation UV. Intensité fluorescence Fig. 3c : augmente avec concentration antigène → QDs-IgG haute activité anticorps.

Utilisation groupe complexes FCM. Détection nombreux antigènes : petites protéines, virus, cytokines [18], exemple HSP27. HSP27 cytoplasme, sécrété grandes quantités cellules tumorales (poumon, pancréas, urinaire, rein, sein, mélanome). Partie HSP27 extracellulaire → lyse cellule extraire protéine. Deux lignées : MCF-7 (cancer sein humain) test, L02 (foie normal humain) témoin. Cellules lysées extraire protéines intracellulaires. Protéines totales collectées, puis anti-HSP27 lapin et souris ajoutés selon concentration protéine, incubation 37 °C 50 min. Puis N-PAMAM-IgG ajouté, incubation 37 °C 30 min, division deux groupes égaux : test et PAMAM. Enfin QDs-IgG ajouté groupe test, incubation 37 °C 30 min obscurité. Fig. 4 : analyse fluorescence deux groupes cellules cytométrie flux. Intensité fluorescence courbe test >> courbe PAMAM groupe MCF-7 ; groupe L02 courbes quasi superposées. Si HSP27 présent extraits cellulaires, N-PAMAM-IgG et QDs-IgG se lient indirectement formant combinaison sandwich présence anti-HSP27 lapin/souris. Si HSP27 absent, seulement faible quantité QDs-IgG lie N-PAMAM-IgG adsorption non-spécifique. Si intensité fluorescence courbe test > courbe témoin PAMAM → HSP27 présent échantillon. Fig. 4 : cellules MCF-7 sécrètent plus HSP27 que L02.

Complexes détectent protéines intracellulaires sécrétées FCM ; principe applicable tout antigène. Deux parties utilisables séparément. Si antigène cellule ou surface cellulaire → seulement partie QDs. Exemple β-actine : composant principal cytosquelette cellules, large existence eucaryotes. Fig. 5a : analyse fluorescence seule partie QD β-actine cellules HeLa FCM. Cellules HeLa lavées, traitées méthanol augmenter perméabilité membrane, divisées deux groupes égaux. Groupe β-actine incubé anti-β-actine souris 37 °C 30 min, groupe témoin BSA. Lavage PBS, incubation QDs-IgG (anti-souris chèvre) 37 °C 30 min. Lavage PBS ×2, détection FCM. Intensité fluorescence courbe β-actine >> courbe témoin → cellules HeLa contiennent β-actine.

Fig. 5b : images microscopie fluorescence cellules HeLa irradiation UV-Vis. DAPI noyau → fluorescence bleue ; QDs-IgG combiné indirectement β-actine → fluorescence rouge. Barre échelle 20 μm.

Complexes aussi applicables ICC. Condition : antigène cible cellule/surface cellule, présent grandes quantités [19] ; sinon cible difficile distinguer fond. Exemple β-actine : cellules HeLa ensemencées plaque 10 cm, lamelle microscope placée, méthanol immobiliser cellules. Incubation anti-β-actine souris (PBS, 1 % BSA) 37 °C 1 h, lavage PBST ×2, incubation QDs-IgG (anti-souris chèvre) 37 °C 1 h obscurité. Lavage PBST ×2, coloration noyau DAPI, détection fluorescence microscopie [20, 21]. Fig. 5b : images microscopie fluorescence cellules HeLa. Avantage QDs colorant fluorescent : signaux QDs et DAPI observables simultanément irradiation canal ultraviolet ; donc selon noyau, cible localisable évidemment. β-actine = protéines cytosquelette autour noyau, observables évidemment.

Conclusions

En conclusion, nous avons démontré l'application des complexes en immunoessais cliniques : FCM, ICC. Groupe complexes = PAMAM-anti-IgG lapin chèvre + QDs-anti-IgG souris chèvre. Ajout anticorps anti-antigène lapin/souris → détection antigène correspondant. Avantages : large spectre, haute biocompatibilité, haute stabilité lumière, faible toxicité biologique. Modèle universel : seulement changer anticorps primaires correspondants. Article : détection HSP27 et β-actine, mais théoriquement applicable tout antigène. Choix méthode détection selon caractéristiques antigènes ; séparation complexes utilisation individuelle selon besoins. Méthode permet détection petites molécules (protéines, virus) par cytométrie flux. Avec améliorations appropriées, applicable autres méthodes : immunofluorescence (IF), western blot (WB), bande immunochromatographique latérale (LCS).

Méthodes / Expérimental

Matériaux

QDs CdSe/ZnS (hydrosolubles groupes carboxyle, cas no. N/A) achetés NEPQD, Chine. PAMAM (génération 5 amino-terminé, lot CYD-150A) CYD, Chine. Anti-IgG lapin chèvre (ab6702), anti-β-actine souris (ab8226) Abcam, UK ; anti-HSP27 souris (BF0624), anti-HSP27 lapin (AF6082) Affinity, USA ; anti-IgG souris chèvre (bs0296G) Bioss, Chine ; EDC, sulfo-NHS Thermo Fisher ; DMEM, FBS Gibco ; membranes PVDF (0,2 μm) Millipore. Autres réactifs grade analytique.

Préparation N-PAMAM-IgG (anti-lapin chèvre)

1. a) Préparation N-PAMAM (PAMAM neutre) : PAMAM (G5 amino-terminé, PM moy. 28826) (60 mg, 2,081 mM) dissous DMSO (2 ml), anhydride succinique (0,266 g, 2,66 mM) ajouté neutraliser groupes amino. 1 mole G5 PAMAM = 128 moles groupes amino → 60 mg PAMAM = 0,266 mM groupes amino, ratio molaire groupes amino PAMAM / anhydride succinique ~1:10. Mélange shaker 100 rpm 4 h, dialyse membrane 3500 PMCO 24 h, lyophilisation → N-PAMAM.
2. b) Préparation N-PAMAM-IgG (anti-lapin chèvre) : tampon MES formulé (100 mM, pH 6,0), 100 μl tampon MES dans tube, ajout 20 μM EDC, 20 μM sulfo-NHS agitation vortex vitesse faible. Ajout 35,7 μl IgG (pH, 0,5 μM) agitation vortex, puis 19 μg N-PAMAM incubation 4 °C overnight, dialyse membranes 3500 et 8000 PMCO 3 jours, lyophilisation → N-PAMAM-IgG.

Préparation QDs-IgG (anti-souris chèvre)

1. a) Formulation tampon BS :
   1. 1. Tampon borax (50 mM) : 19,07 g borax dissous 1 L eau ultrapure.
   2. 2. Tampon acide borique (50 mM) : 3,09 g acide borique dissous 1 L eau ultrapure.
   3. 3. Tampons BS pH 8,0 et pH 7,2 préparés mélange deux solutions.
   4. 4. Tampon lavage (aussi tampon conservation) : dilution tampon BS pH 8,0 → 5 mM + 0,1 % Tween 20.
   5. 5. Solution activation : dilution tampon BS pH 7,2 → 5 mM + 0,1 % Tween 20.
   6. 6. Tampon EDC : 0,27 g EDC dissous 5 ml solution activation ; tampon sulfo-NHS : 0,378 g sulfo-NHS dissous 5 ml solution activation.
2. b) Préparation QDs-IgG (anti-souris chèvre) : 450 μl QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) dissous 2,25 ml solution activation, ajout 150 μl tampon EDC + 150 μl tampon sulfo-NHS, sonication glace 5 min. Centrifugation 12000 rpm 5 min éliminer surnageant, précipité dissous 1,2 ml tampon lavage. Mélange ultrasonique 30 min, ajout 100 μg anticorps IgG, incubation overnight shaker 4 °C. Ajout 150 μl BSA 10 % incubation 30 °C 30 min, centrifugation 12000 rpm 2 min éliminer surnageant. Précipité redissous 1 ml tampon lavage, centrifugation 12000 rpm 2 min, étape répétée, enfin précipité dissous 1 ml tampon conservation. Ajout 10 % BSA, mélange choc ultrasonique complet, centrifugation 820 g/min éliminer précipité, surnageant = QDs-IgG. Stockage 4 °C obscurité 3 mois. Ne pas congeler même avec glycérol → agrégation QDs en amas, précipitation non lavable PBST → fluorescence fond sérieuse.

Analyse FCM protéine HSP27

HSP27 cytoplasme, sécrété grandes quantités cellules tumorales. Expérience : deux lignées MCF-7 (cancer sein) test, L02 (foie normal) témoin. Cellules ensemencées plaque 10 cm, DMEM + 10 % FBS 37 °C. 80 % confluence → trypsine digestion, lavage PBS ×2. Resuspension 1 ml PBS. Comptage hémocytomètre, tampon lyse T-PER ajouté selon concentration cellules, extraction protéines intracellulaires lysat. Centrifugation 14000 rpm 10 min surnageant, concentration protéine méthode BCA. Selon concentration, anti-HSP27 lapin/souris ajoutés incubation 37 °C 50 min. Concentration protéine L02 ~0,2 mg/ml, MCF-7 ~0,25 mg/ml, volume 500 μl. Anticorps anti-HSP27 lapin/souris ajoutés cellules (0,625 μl MCF-7, 0,5 μl L02).

Puis 1 mg/ml N-PAMAM-IgG ajouté mélanges incubation 37 °C 30 min ; 6,25 μl MCF-7, 5 μl L02. Après incubation, production divisée deux groupes égaux : test et PAMAM. Enfin QDs-IgG ajouté groupe test, incubation 37 °C 30 min obscurité. Deux groupes analysés cytométrie flux.

Analyse FCM protéine β-actine

β-actine protéine intracellulaire, composant principal cytosquelette, large existence eucaryotes. Cellules HeLa ensemencées plaque 10 cm, DMEM + 10 % FBS 37 °C 2 jours, surnageant éliminé, lavage PBS ×2. Trypsine digestion, centrifugation 800 rpm 3 min éliminer surnageant, 1 ml méthanol froid resuspension cellules. 5 min, centrifugation 800 rpm 3 min éliminer surnageant, resuspension 1 ml PBS. Répétition, division cellules HeLa deux groupes égaux. Groupe test incubé anti-β-actine souris 37 °C 30 min, groupe témoin BSA. Anti-β-actine souris dissous PBST (1 % BSA, 5 μg/ml), 100 μl IgG ajouté 300 μl groupe test, BSA équivalent groupe témoin. 30 min incubation, groupes incubés QDs-IgG (anti-souris chèvre) 37 °C 30 min. Lavage PBS ×2, détection FCM.

Analyse ICC protéine β-actine

Cellules HeLa ensemencées plaque 10 cm, DMEM + 10 % FBS 37 °C 1 jour. Lamelles stérilisées placées plat, culture 2 jours supplémentaires. Lamelles retirées, lavage PBS ×2, incubation 400 μl méthanol 20 min température ambiante. Lavage PBS ×3. Tampon blocage : PBST (0,1 % Tween 20), glycine 22,52 mg/ml, 10 % BSA. Lamelle dans tampon blocage 30 min température ambiante. Tampon blocage retiré, incubation anti-β-actine souris (PBS, 1 % BSA) 37 °C 1 h, lavage PBST ×2, incubation QDs-IgG (anti-souris chèvre) 37 °C 1 h obscurité. Lavage PBST ×2, coloration noyau DAPI 2 min, rinçage PBS ×1, eau ×1, visualisation microscopie fluorescence.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes données disponibles sans restriction.

Abréviations

CBA :

Cytometric bead array

DMEM :

Dulbecco's modified Eagle's medium

FBS :

Fetal bovine serum

FCM :

Flow cytometry

ICC :

Immunocytochemistry

N-PAMAM :

Neutral PAMAM

PAMAM :

Polyamidoamine dendrimer

QDs :

Quantum dots