Nanocomplexes de fullerène C₆₀ potentialisant la doxorubicine contre les cellules leucémiques in vitro

Résumé

La chimiothérapie traditionnelle échoue souvent en raison d'effets secondaires graves et de l'émergence rapide de multirésistance aux médicaments. Nous avons étudié le fullerène C₆₀ comme transporteur nanoscopique pour la doxorubicine (Dox) afin d'améliorer la délivrance du médicament spécifiquement aux cellules leucémiques. Des complexes non-covalents C₆₀-Dox (rapports 1:1 et 2:1) ont été caractérisés par UV/Vis, diffusion dynamique de la lumière et HPLC-MS/MS, confirmant une taille de nanoparticules stable de 140 nm adaptée à l'usage biologique. Sur des lignées cellulaires leucémiques (CCRF-CEM, Jurkat, THP-1, Molt-16), ces complexes ont affiché une cytotoxicité jusqu'à 3,5 fois supérieure à la Dox libre à des concentrations nanomolaires, avec des preuves d'accumulation intracellulaire soutenant une délivrance améliorée. Ces résultats suggèrent le fullerène C₆₀ comme nanotransporteur prometteur pour améliorer l'efficacité de la Dox contre la leucémie.

Introduction

La nanobiotechnologie offre une voie vers des thérapies anticancéreuses plus sélectives et puissantes. Le fullerène C₆₀, une nanostructure carbonée sphérique, présente des propriétés physicochimiques uniques, une activité antioxydante intrinsèque et des capacités prouvées de chargement de médicaments. La doxorubicine, bien qu'efficace, est limitée par sa cardiotoxicité et son stress oxydatif. La combinaison Dox-C₆₀ exploite les propriétés antioxydantes du fullerène et son potentiel de délivrance de médicament pour atténuer les effets secondaires et améliorer le ciblage tumoral. Des études antérieures ont montré que les complexes non-covalents C₆₀ peuvent améliorer l'activité anticancéreuse in vitro et in vivo. Cette étude évalue les caractéristiques physicochimiques, l'absorption cellulaire et la puissance cytotoxique des complexes C₆₀-Dox contre des lignées cellulaires leucémiques humaines.

Méthodes

Matériaux

Les produits chimiques et lignées cellulaires provenaient de fournisseurs standards (Biochrom, Sigma-Aldrich, Institut Leibniz DSMZ). Les conditions de culture cellulaire suivaient des protocoles conformes aux normes ISO.

Préparation des complexes

Des colloïdes aqueux de C₆₀ pur ont été préparés par sonication par ultrasons, atteignant 150 µg mL⁻¹ de pureté et 100 nm de diamètre hydrodynamique. La Dox a été dissoute à 150 µg mL⁻¹ et mélangée au C₆₀ en rapports de poids 1:1 ou 2:1, soniquée 30 min et agitée 24 h à température ambiante. L'excès de médicament libre a été éliminé par dialyse. Les concentrations finales des complexes étaient 75 µg mL⁻¹ (1:1) et 100/50 µg mL⁻¹ (2:1). La stabilité a été confirmée sur 6 mois en solution saline.

Caractérisation analytique

L'HPLC-MS/MS (Shimadzu LCMS-8040) a quantifié la libération de Dox, utilisant une colonne C18 et une phase mobile acétonitrile:eau 0,1% acide formique 80:20. Les spectres d'absorption UV/Vis et de fluorescence ont été enregistrés avec un Tecan Infinite M200 Pro. La diffusion dynamique de la lumière (Malvern Zetasizer Nano S) a mesuré la taille des particules dans le PBS et le RPMI-1640 +10% SVF.

Viabilité cellulaire

Des tests MTT ont évalué la viabilité de 10⁴ cellules/puits après 24, 48 et 72 h d'exposition à la Dox libre ou aux complexes C₆₀-Dox à 0,1-100 µM. Les valeurs IC₅₀ ont été dérivées par régression non-linéaire (GraphPad Prism 7).

Études d'absorption

La microscopie de fluorescence (Keyence BZ-9000) et la cytométrie de flux (BD FACSJazz) ont quantifié la Dox intracellulaire après 1, 3 et 6 h d'exposition à 1 µM de médicament libre ou complexé dans des cellules CCRF-CEM.

Résultats

Stabilité et taille des complexes

Les chromatogrammes HPLC-MS/MS ont révélé des temps de rétention distincts pour la Dox libre (11,66 min) versus Dox liée au complexe (9,44 min), confirmant la formation du complexe. Les spectres UV/Vis montraient un décalage hypochromique de 30% en absorbance, tandis que l'extinction de fluorescence (~50% à 3 µM) indiquait un empilement π-π étroit entre Dox et C₆₀. La DLS a déterminé un diamètre hydrodynamique moyen de ~140 nm, stable dans le PBS et après 72 h d'incubation dans RPMI-1640 +10% SVF.

Cytotoxicité améliorée

Les quatre lignées leucémiques ont affiché une sensibilité nanomolaire à la Dox, avec des valeurs IC₅₀ allant de 2 nM (Molt-16) à 80 nM (CCRF-CEM). Les complexes C₆₀-Dox ont constamment abaissé les valeurs IC₅₀ jusqu'à 3,5 fois par rapport au médicament libre, le complexe 1:1 surpassant le rapport 2:1. La teneur plus élevée en C₆₀ dans le complexe 2:1 pourrait conférer une protection antioxydante, atténuant le stress oxydatif induit par la Dox.

Absorption intracellulaire accrue

La microscopie de fluorescence et la cytométrie de flux ont démontré que les complexes C₆₀-Dox entraient dans les cellules plus rapidement que la Dox libre, atteignant une augmentation de 1,5-2,2 fois de la fluorescence intracellulaire à 6 h. La Dox se localisait dans le noyau pour les deux formulations, comme confirmé par colocalisation avec la coloration Hoechst 33342.

Conclusion

Le fullerène C₆₀ forme des complexes stables, non-covalents de 140 nm avec la doxorubicine qui augmentent nettement sa cytotoxicité contre les cellules leucémiques humaines. Le nanotransporteur facilite une absorption cellulaire plus rapide sans altérer la localisation du médicament, atteignant jusqu'à 3,5 fois plus de puissance à doses équivalentes. Ces résultats soutiennent le développement futur de nanocomplexes C₆₀ pour abaisser les concentrations effectives de Dox, réduisant potentiellement la cardiotoxicité et autres effets indésirables en contexte clinique.