Étude de toxicité des nanoparticules de pérovskite sur les cellules épithéliales des voies respiratoires

Introduction

La manganite de lanthane et de strontium (LSM) est une nanoparticule dotée d'une structure cristalline à base de pérovskite. Il prend la forme générale de « ABO3 », où le lanthane et le strontium sont dans le site A et le manganèse dans le site B. Cela conduit à sa formule générale de La_1 − x Sr_x MnO₃ , dans laquelle x représente les niveaux de dopage au strontium qui dépendent de l'application de la nanoparticule. Le LSM peut être utilisé sous forme de poudre comme coulée de bande, pulvérisation air/thermique/plasma et pour les applications de piles à combustible [1,2,3,4].

Dans le récent effort visant à réduire la pollution et à créer une économie basée sur l'hydrogène, de nombreuses recherches se sont concentrées sur les piles à combustible à oxyde solide (SOFC) [5, 6]. À leur tour, les pérovskites LSM ont attiré l'attention de la recherche en raison de son rôle important dans les SOFC en tant que l'un de ses matériaux d'électrode les plus importants [4, 7]. Les nanoparticules LSM sont des particules métalliques sphériques à surface élevée qui se présentent sous la forme d'une poudre cristalline brune ou noire. Bien que de nombreuses études sur les propriétés mécaniques et électriques du LSM aient été menées [1, 3, 8, 9], très peu de recherches se sont concentrées sur ses effets biologiques [10,11,12]. De nombreuses nanoparticules ont illustré des tendances à favoriser la sécrétion et l'accumulation de mucus, ainsi sont liées aux maladies respiratoires [13, 14]. La recherche sur les nanoparticules LSM montre des idées prometteuses pour des applications biomédicales [15,16,17]. Récemment, des recherches sur le LSM ont montré son potentiel pour la thérapie anticancéreuse [12, 18, 19]. Avec les procédures de synthèse et les modifications de surface correctes, le LSM a la capacité d'être un agent de contraste et d'hyperthermie IRM ainsi qu'un vecteur de médicament [20,21,22]. Cependant, la possibilité de toxicité doit être évaluée avant d'autres applications médicales. Il n'y a que des études limitées sur l'effet de toxicité de la pérovskite [10, 23], et aucun effet de toxicité significatif n'a été signalé jusqu'à présent.

Dans cette étude, nous avons étudié la toxicité des nanoparticules de LSM, tout en étant exposés à des cellules épithéliales trachéales primaires pour déterminer la plage de concentration de toxicité. Nous avons ensuite analysé la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les dommages aux mitochondries ainsi que la réponse de sécrétion de mucus par microscopie à fluorescence [24]. Le niveau de progression de l'apoptose avec ou sans nanoparticules de LSM a été examiné avec des dosages du cytochrome C et de la caspase 3 [25].

Résultats et discussions

Caractérisation des NP et test de viabilité cellulaire

La toxicité des nanoparticules dépend de leurs propriétés physiques, telles que la géométrie, la distribution de la taille et la surface. Avant les expériences de toxicité, ces caractéristiques ont été analysées par SEM. Les nanoparticules de LSM illustraient une rugosité de surface significative et étaient distribuées en agrégats de différentes tailles, d'environ 35 nm à 200 nm de diamètre (Fig. 1).

Image SEM des caractéristiques physiques du LSM. La taille de particule unique était d'environ 35 nm de diamètre et l'agrégation de la taille du LSM variait de 200 nm à quelques m

Nous avons mené de nombreuses expériences de toxicité sur les cellules des voies respiratoires de la trachée avec une variété de NP dans notre étude précédente [26, 27], donc cette lignée cellulaire a été choisie pour cette étude biologique. Afin d'évaluer la toxicité globale du LSM sur les cellules de la trachée, le test colorimétrique de viabilité cellulaire CCK8 a été réalisé [25, 27]. Comme le montre la figure 2 ; test de viabilité cellulaire, il y avait un changement dramatique dans la population se produisant de 50 à 100 μg/ml de concentrations de LSM. Cependant, à des concentrations de LSM supérieures à 100 μg/ml, la population s'est maintenue dans une fourchette relativement stable, ne montrant aucun changement significatif.

Viabilité des cellules de la trachée après augmentation de la concentration de LSM, indiquée ici en Log[ng/ml]. Le test colorimétrique de viabilité cellulaire CCK8 a été utilisé pour mesurer, et sa moyenne par incrément de concentration a été calculée. (n> 6)

Production de ROS et libération de mucine

La production de ROS déclenche l'apoptose, contribue ainsi à la cytotoxicité des nanoparticules. Selon la figure 3 ; La production de ROS, l'augmentation de la concentration de LSM n'affecte pas beaucoup la production de ROS. La concentration de 250 μg/ml de LSM différait le plus du témoin, mais son écart n'était pas significatif, ce qui indique que le LSM n'a pas d'effet remarquable sur la production de ROS.

Production de ROS des cellules de la trachée après augmentation des concentrations de LSM. Les ratios de production de ROS pour chaque traitement de concentration de LSM ont été calculés par rapport au groupe témoin. (n> 100)

À partir de la figure 4 ; mucus bata, après un traitement de 15 minutes, il n'y avait pas d'effet significatif sur la viabilité cellulaire, et à mesure que les concentrations de LSM augmentaient, la sécrétion de mucine diminuait. La libération de mucine était réduite jusqu'à 40 % lorsque les cellules étaient traitées avec 500 μg/ml de LSM, et pourrait potentiellement être réduite davantage avec des concentrations encore plus élevées de LSM. Cette réduction suggère que le LSM a un effet inhibiteur sur la libération de mucus.

La sécrétion de mucine se produit après des traitements de 15 minutes à des concentrations croissantes de LSM. Les ratios ont été calculés pour chaque concentration de LSM en la comparant au groupe témoin. L'évaluation des sécrétions de mucine à la surface cellulaire a été effectuée par ELLA (essai de lectine liée à l'enzyme). (* :n> 6, p < 0,05)

Dégâts mitochondriaux et processus d'apoptose

Le stade précoce de l'apoptose est généralement représenté par des dommages mitochondriaux. Pour analyser ce phénomène, le colorant JC-1 a été utilisé comme indicateur de potentiel membranaire mitochondrial. Le rapport d'intensité induit par le colorant JC-1 est en corrélation avec la perte d'intégrité mitochondriale, et selon la Fig. 5, à mesure que les concentrations de LSM augmentaient, les dommages mitochondriaux augmentaient significativement après 100 μg/ml de traitement LSM. Bien que les résultats montrent que les dommages aux mitochondries sont importants après 100 μg/ml de traitement au LSM, la caspase3 et le cytochrome C montrent de légères diminutions, comme détaillé ci-dessous. Ce résultat suggère que le LSM pourrait endommager les mitochondries, mais les cellules ont toujours la capacité de rester à un faible niveau de progression de l'apoptose et de réduire l'expression du marqueur d'apoptose.

Résultats d'intensité fluorescente du colorant indicateur JC-1 dans quatre conditions différentes de traitement sur des cellules de la trachée pour indiquer l'intégrité mitochondriale. (*, **, *** :n> 100, p < 0,05)

L'apoptose peut également être mesurée par l'expression du cytochrome C et de la caspase 3. Comme le montre la figure 6a ; résultat de l'apoptose sur le cytochrome C, il y avait une diminution modérée des taux d'apoptose parmi les différentes concentrations de LSM et le groupe témoin. Cette même tendance peut être observée sur la figure 6b ; résultat d'apoptose sur la caspase 3, indiquant une toxicité très minime due au LSM. Dans l'ensemble, les dommages mitochondriaux et les résultats de l'apoptose sur les cellules de la trachée des voies respiratoires dus au LSM étaient très faibles, ce qui suggère que le LSM n'a pas d'effet toxique significatif sur les cellules épithéliales de la trachée.

Résultats de l'apoptose mesurés par a expression du cytochrome C, b expression de caspase 3. Les rapports ont été obtenus par traitement de concentration de LSM par rapport au groupe témoin (HBSS). (* :n> 100, P < 0,05)

Conclusions

Des études récentes sur la nanotoxicité ont attiré beaucoup d'attention sur les effets toxiques des NP en raison de leur large utilisation dans les produits industriels et commerciaux. La principale préoccupation de la nanotoxicité est due à la génération de ROS. Par exemple, TiO₂ Les NP sont considérées comme une sorte de matériau cancérigène en raison de la grande quantité de ROS générées qui pourraient entraîner la mort cellulaire et des mutations [28]. Il existe différents types de matériaux et de composés classés comme pérovskite qui ont été signalés ces dernières années dans une variété d'applications différentes. Il s'agit de la première étude visant à déterminer la toxicité du LSM sur les cellules épithéliales des voies respiratoires, qui constituent l'une des principales voies d'absorption des NP par les cellules. Cette étude visait à étudier l'effet du LSM sur les cellules de la trachée dans le but d'évaluer sa toxicité. Les résultats ont montré que le LSM n'a pas d'effet significatif sur la progression de l'apoptose mesurée par les expressions du cytochrome C et de la caspase 3, l'intégrité des mitochondries mesurée par la fluorescence JC-1, la survie cellulaire et la production de ROS. Cependant, le traitement a montré un effet suppresseur sur la sécrétion de mucus, diminuant la production de mucus à mesure que les concentrations de LSM augmentaient. En fin de compte, grâce aux résultats obtenus à partir de cette étude, le LSM s'est avéré non toxique pour les cellules épithéliales des voies respiratoires, ne provoquant aucun changement significatif dans les stades d'apoptose, réduisant en outre la sécrétion de mucus qui peut compromettre la viabilité cellulaire. Cela suggère le potentiel du LSM à interférer avec la clairance du mucus des voies respiratoires. Dans notre étude, nous avons démontré le potentiel de toxicité des NP de LSM et les résultats montrent que le risque potentiel d'effet toxique est relativement plus faible que d'autres NP qui avaient été utilisées pour des applications industrielles et commerciales. Cependant, des recherches supplémentaires doivent être menées pour déterminer si le LSM peut être incorporé en toute sécurité en tant qu'ingrédient actif dans les produits commerciaux solaires et de stockage d'énergie.

Matériaux et méthodes

Culture des cellules primaires de la trachée

Les cellules épithéliales primaires de la trachée ont été isolées de l'épithélium bronchique bovin normal selon des protocoles précédemment publiés [26]. Les cellules ont été cultivées et maintenues dans un milieu sans sérum (SFM) complété par le facteur de croissance épidermique recombinant humain 1-53 (EGF 1-53) et l'extrait d'hypophyse bovine (BPE) (Thermo Fisher) préqualifiés. Les cellules primaires de la trachée ont été cultivées dans des plaques Falcon de 15 cm pré-enduites de collagène () et incubées dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5% CO₂ . Les comptages cellulaires ont été effectués en utilisant l'exclusion au bleu trypan (Sigma) et un hémocytomètre Bright-Line. Les cellules ont été transmises lorsque la confluence a atteint 80 %.

Préparation des cellules

Les cellules ont été ensemencées à 5 × 10 ⁴ cellules par puits dans une plaque à 96 puits recouverte de collagène (75 % de confluence) pour les tests de viabilité cellulaire, 5 × 10 ⁵ cellules par puits dans une plaque à 4 puits recouverte de collagène (75 % de confluence) pour Ca ²⁺ signalisation, ROS et analyse des mitochondries. Après l'ensemencement, les cellules ont été incubées pendant 24 h dans du SFM supplémenté en EGF 1-53 recombinant humain préqualifié et en BPE (Thermo Fisher). Après 24 h d'incubation, le milieu a été retiré des cellules et la culture a été rincée deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate. Le lavage PBS a été remplacé par des nanoparticules soniquées dans du Ca ²⁺ contenant Hanks ou Ca ^2 + -gratuit Hanks.

Test de viabilité cellulaire

La détermination photocolorimétrique de la cytotoxicité a été évaluée en utilisant le colorant CCK-8 (Dojindo Laboratories, Tokyo, Japon) [27, 25]. La CCK-8, étant non radioactive, offre une détermination colorimétrique du pourcentage de cellules viables soumises à différentes concentrations de NP. Ce kit de dosage mesure l'activité métabolique des déshydrogénases dans les cellules viables pour convertir le sel de tétrazolium WST-8 en formazan soluble dans l'eau. Il a été préparé en ajoutant du CCK-8 dans du HBSS à une dilution de 1:10. Les cellules ont été rincées avec du HBSS et 100 μL de colorant ont été chargés dans chaque puits. Ensuite, les cellules ont été incubées à 37 °C, 5% CO₂ incubateur pendant 6 h. L'absorbance a été mesurée en utilisant un lecteur de plaques Thermo Multiscan EX (Lecteur de plaques Thermo Multiskan EX, VWR, CA, USA) à la densité optique de 450 nm (référence de 650 nm). Une moyenne a été calculée à partir de trois ensembles de données distincts pour chaque concentration, y compris le contrôle non traité, à partir de trois expériences indépendantes et a été tabulée en pourcentage du contrôle non traité.

La viabilité cellulaire a été calculée par \( \frac{OD_{450\mathrm{traitement}}-{OD}_{650\mathrm{treatment}}}{O{D}_{450\mathrm{control}}-O {D}_{650\mathrm{control}}}\ast 100\% \).

Nanoparticule de Lanthane Strontium Manganite

Manganite de lanthane et strontium (La_0,15 Sr_0,85 MnO₃ ) (LSM) des nanoparticules (35 nm, 99,5 %) (Nanostructured&Amorphous Materials Inc.) ont été utilisées dans cette étude. Tous les échantillons de NP ont été soniqués avant utilisation. Les concentrations utilisées étaient de 500 μg/ml, 250 μg/ml, 100 μg/ml et 50 μg/ml. La gamme de concentrations utilisée a été décidée suivie des concentrations de TiO₂ NPs trouvées dans les rapports précédents (Dowding et al. 2014; Dowding et al. 2012; Gurr et al. 2005; Hirst et al. 2009; Niu et al. 2011). Les NP de LSM ont été reconstituées avec la solution de Hanks (Invitrogen, CA, États-Unis) avant d'être testées individuellement et soniquées pendant environ 5 min immédiatement avant utilisation.

Microscope électronique à balayage

Les NP de LSM ont été préparées dans 5 μg/ml et coulées en gouttes sur une plaquette de silicium propre et séchées à l'air pour éliminer l'eau résiduelle. La taille des NP a été confirmée de manière indépendante à l'aide d'un microscope électronique à balayage (Gemini SEM, Zeiss).

Production d'espèces réactives intracellulaires d'oxygène

La production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) a été évaluée par microscopie à fluorescence en utilisant l'oxydation du colorant CM-H2DCFDA (Invitrogen, CA, USA) [24]. Les cellules (1 x 105 cellules/puits) ont été cultivées pendant 24h avant d'être rincées avec une solution de PBS. Les échantillons ont été colorés en appliquant un tampon de charge contenant 2 μM de colorant CM-H2DCFDA reconstitué dans un milieu pendant 30 min. Les échantillons colorés ont été lavés avec du PBS trois fois et mis de côté pendant 5 minutes de temps de récupération pour que les estérases cellulaires hydrolysent les groupes AM ou acétate et rendent le colorant sensible à l'oxydation. Le tampon de Hanks, contenant des LSM NP à des concentrations allant de 0 à 500 μg/ml dans 50 μg/ml, a ensuite été incubé avec les cellules pendant 15 min à 37 °C, suivi d'un lavage au PBS. Des images fluorescentes de ROS générées dans des cellules ont été capturées et analysées en calculant le rapport d'augmentation de l'intensité de fluorescence entre différents traitements et groupes témoins.

Mesure des dommages aux mitochondries

Le potentiel transmembranaire interne mitochondrial a été évalué à l'aide d'iodure polychromatique de 5,5′,6,6′-tétrachloro-1,1′,3,3′-tétraéthylbenzimidoazolyl-carbocyanio (JC-1 Sigma) [25]. JC-1 est un cation fluorescent lipophile qui peut être incorporé dans la membrane mitochondriale, où il dépend des agrégats d'état potentiel membranaire. L'agrégation modifie les propriétés de fluorescence de JC-1, passant de la fluorescence verte à la fluorescence rouge. Les membranes mitochondriales intactes colorées avec JC-1 présentent une fluorescence mitochondriale rouge prononcée qui est détectable par microscopie à fluorescence. Une rupture du potentiel de membrane mitochondriale entraîne une diminution subséquente de la fluorescence verte et une augmentation de la fluorescence rouge. Avant la stimulation des NP, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et incubées avec le réactif de coloration JC-1 (1:1000) dans un milieu à 37 °C pendant 30 min, suivi d'un lavage avec du PBS et d'un traitement cellulaire. Le potentiel de membrane mitochondriale a été détecté par microscopie à fluorescence à des intervalles de temps de 10 min.

Mesure de [Ca ²⁺ ][sub>c

Toutes les expériences ont été réalisées dans des conditions sombres. Les cellules ont été chargées avec un colorant Rhod-2 AM (1 μM) (K _d = 570 nM, λ_Ex = 552 nm, et λ_Em = 581 nm) (Invitrogen, Californie, États-Unis) pendant 45 min. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS deux fois avant d'être incubées avec du tampon Hanks, et traitées avec la concentration de NP appropriée. Tous les Ca ²⁺ des expériences de signalisation ont été réalisées dans un état thermo-régulé à 37 °C monté sur un microscope Nikon (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokyo, Japon) [24, 25, 27] (Chen et al. 2011).

Sécrétion de mucine et ELLA

Les cellules ont été ensemencées à 1 × 10 ⁶ cellules par puits dans une plaque à 6 puits et cultivées pendant 24 h. Les cellules primaires de la trachée ont ensuite été rincées avec du PBS et stimulées pendant 15 min avec les concentrations de LSM NP correspondantes (500 μg/ml, 250 μg/ml et 100 μg/ml) préparées dans du PBS. Le surnageant contenant la mucine sécrétée a été collecté et brièvement centrifugé à 8000 tr/min pour éliminer les NP résiduelles. Le surnageant a ensuite été incubé dans une plaque à 96 puits (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, USA) pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, la plaque à 96 puits a été lavée avec du PBST (PBS + 0,05 % de Tween-20) puis bloquée avec 1 % de BSA. La plaque à 96 puits a été à nouveau lavée avec du PBST et incubée avec de la lectine (Wheat germ agglutinin, WGA) (Sigma-Aldrich, MO, USA), conjuguée à de la peroxydase de raifort (HRP; 5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, MO, USA), à 37 °C pendant 1 h. Le substrat, la 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB ; Sigma-Aldrich, MO, USA), a été ajouté à chaque puits à température ambiante, suivi de H₂ SO₄ (Sigma-Aldrich, MO, USA) afin de terminer la réaction. La densité optique a été mesurée à 450 nm (Chen et al. 2011 ; Kemp et al. 2004).

Préparation du dosage immunosorbant (ELISA)

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 1 × 10 ⁶ densité cellulaire dans une plaque à 6 puits et cultivée pendant 24 h. Les cellules de la trachée ont ensuite été rincées avec du PBS. Les cellules ont été stimulées pendant 2 h avec les concentrations appropriées de LSM NP (0-500 μg/ml) préparées dans du PBS. La lyse cellulaire a été préparée par le réactif de lysat cellulaire Peirce RIPA, et le lysat a été collecté et transféré dans un tube de microcentrifugation. Les échantillons ont été centrifugés à ~ 14 000×g pendant 15 min pour agglomérer les débris cellulaires et les NP. Le surnageant a ensuite été incubé dans une plaque à 96 puits pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, la plaque à 96 puits a été lavée avec du PBST (PBS + 0,05 % de Tween-20) puis bloquée avec 1 % de BSA. La plaque 96 puits a été à nouveau lavée avec du PBST et incubée avec un anticorps de lapin anti-caspase 3, forme active (Millipore, anticorps polyclonal) et de souris anti-cytochrome C (Invitrogen, anticorps monoclonal) à température ambiante pendant 2 h. Utiliser ensuite un anticorps secondaire (peroxydase de raifort conjuguée anti-lapin et anti-souris, HRP, Millipore) et suivi de la même procédure qu'ELLA pour mesurer l'intensité d'absorbance [25].

Analyse d'images

L'analyse des images a été réalisée avec un microscope à fluorescence inversé Nikon Eclipse TE2000-U. Chaque photo a été prise à un grossissement × 10 et analysée à l'aide de Simple PCI (Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, USA). Les données indiquées pour les concentrations de calcium cytosolique sont représentées par la fluorescence Rhod-2. Les images ont été prises toutes les 0,5 s et automatiquement converties en niveaux de gris pour analyse. Le PCI simple a fourni les intensités de pixels (valeur de gris moyenne) des zones sélectionnées, chacune avec une fluorescence moyenne par image pour 200 cellules sur 100 s (~ 200 images) immédiatement après la stimulation des nanoparticules. Les données présentées pour la coloration par immunofluorescence sont une représentation de l'expression de la protéine après 1 à 2 heures de traitement au graphène. Toutes les expériences ont été menées et corroborées indépendamment au moins trois fois.

Analyse statistique

Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD. Chaque expérience a été réalisée indépendamment au moins trois fois. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'une analyse de test ANOVA à un facteur avec p valeurs < 0,05 (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).

Abréviations

BPE :

Extrait d'hypophyse bovine

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

LSM :

Manganite de lanthane strontium

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SFM :

Milieu sans sérum

SOFC :

Piles à combustible solaires oxydées