Synthèse des nanoparticules SPIO et applications ultérieures dans le marquage des cellules souches pour la maladie de Parkinson

Introduction

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par la perte progressive de neurones dopaminergiques dans le mésencéphale. La déficience relativement focale en fait un bon candidat pour les thérapies cellulaires. Plusieurs types de cellules, allant du tissu mésencéphalique fœtal [1] aux neurones induits dérivés de cellules souches embryonnaires (ESC) ou de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) [2], ont été impliqués dans le traitement de la MP ; cependant, les préoccupations éthiques et le risque potentiel de tumorigénicité n'ont pas pu être évités lors de l'application [3]. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une population de cellules souches multipotentes qui a été signalée au cours de la dernière décennie comme un outil thérapeutique prometteur pour la maladie neurodégénérative, y compris la MP [4, 5]. Par rapport à d'autres types de cellules, les MSC présentent une bonne prolifération, une disponibilité généralisée dans tout le corps humain et une capacité immunorépressive. Certaines études ont montré que la transplantation intracrânienne de CSM favorise la neuroprotection, la différenciation neuronale et l'immunomodulation [6,7,8]. Dans ces études, le suivi de la viabilité, de la migration et de l'intégration des cellules transplantées in vivo est essentiel pour une compréhension de base de la fonction des cellules souches et l'évaluation de l'efficacité clinique.

Pour mieux analyser les effets thérapeutiques des cellules transplantées, différents traceurs ont été développés. La sécurité et l'efficacité des traceurs sont les facteurs les plus critiques influençant l'application. Comparé au marquage avec des protéines fluorescentes [9], le suivi à l'aide de particules d'oxyde de fer superparamagnétique (SPIO) n'apporterait aucune modification génétique aux cellules transplantées [10,11,12]. Plusieurs études ont utilisé SPIO comme agent de contraste efficace pour visualiser et suivre les cellules transplantées [6, 13, 14]. Cependant, il a été rapporté que certains des SPIO disponibles dans le commerce affectent les fonctions normales de MSC [15,16,17]; par conséquent, des efforts considérables ont été consacrés au développement de nouveaux SPIO. Dans la présente étude, nous avons synthétisé un revêtement ultrapetit de nanoparticules SPIO (USPIO) avec de l'acide polyacrylique (PAA) et une couche subséquente de méthoxypolyéthylène glycol amine (PEG). Le roman USPIO-PAA/PEG montre une bonne internalisation cellulaire et une capacité de suivi IRM à long terme in vitro et in vivo. De plus, les MSC marquées USPIO-PAA/PEG dérivées du tissu adipeux humain (HADSC) ont conservé les caractéristiques biologiques, améliorant les troubles du comportement et augmentant l'immunoréactivité TH dans la substance noire des modèles animaux de la MP.

Matériaux et méthode

Matériaux

L'acétylacétonate de fer, le TREG (triéthylène glycol), le diéthylène glycol et le PEG ont été achetés auprès d'Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Chine). Le bromure de méthylthiazolyldiphényl-tétrazolium (MTT) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, Chine). Le milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM), la trypsine-EDTA (0,25 %) et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific. Le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide et le N-hydroxy succinimide ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Chine). Le N,N-diméthylformamide, l'alcool éthylique absolu et l'acétate d'éthyle ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Corporation. L'eau ultrapure a été produite par les systèmes de purification d'eau pure et ultrapure Millipore. Le CD90-FITC antihumain, le CD45-PE antihumain, le CD34-FITC antihumain et le CD105-PE antihumain ont été achetés auprès de Biolegend.

Synthèse de l'USPIO

L'USPIO a été synthétisé par la méthode des polyols comme des recherches antérieures [18,19,20,21]. Les étapes de l'expérience sont les suivantes :1 mmol d'acétylacétonate de fer et 25 mL de TREG ont été mélangés dans un ballon à trois cols, relié à de l'argon, un tube de condensation sphérique et un thermomètre. Après avoir incubé avec un flux d'argon pendant 15 min, le mélange a été chauffé à 120  (la vitesse de chauffage est de 3 °C/min) et maintenu pendant 1 h, puis le mélange a été chauffé à 250 °C à la même vitesse de chauffage et maintenu pendant 30 minutes. Le mélange réactionnel a été naturellement refroidi à température ambiante, dilué avec 2 ml d'alcool éthylique absolu, suivi d'une précipitation avec de l'acétate d'éthyle. Le sédiment a été recueilli par centrifugation à 8000 tr/min pendant 20 min puis remis en suspension dans de l'alcool éthylique absolu. L'USPIO a été conservé dans de l'alcool éthylique absolu à 4 °C pour une utilisation ultérieure.

Préparation de l'USPIO enduit PAA/PEG

L'USPIO-PAA a été acquise selon un précédent rapport [22]. En détail, 1,5 g d'acide polyacrylique (PAA) a été dissous dans 24 ml de diéthylène glycol. Après un flux d'argon de 5 minutes, le mélange a été chauffé à 110°C et maintenu jusqu'à ce que la solution soit transparente. La solution de dispersion d'éthanol contenant 28 mg d'USPIO préparée à l'étape précédente a été ajoutée à la solution clarifiée ci-dessus après dispersion par ultrasons. La solution a finalement été chauffée à 210°C à une vitesse de 3°C/min. La réaction a été arrêtée après 2 h de reflux et refroidie naturellement à température ambiante. Après refroidissement, de l'acétate d'éthyle a été ajouté à la solution réactionnelle pour précipiter les USPIO NP, puis centrifugé à 8000 tr/min pendant 20 min pour éliminer le surnageant. Le précipité a ensuite été dispersé dans de l'éthanol, suivi d'une précipitation avec de l'acétate d'éthyle. Après les procédures de lavage à trois reprises, l'USPIO-PAA a été dispersé dans de l'eau ultrapure pour une utilisation ultérieure. Afin d'améliorer la biocompatibilité, nous avons en outre lié le PEG à la surface des nanoparticules par EDC et amidation médiée par le NHS [23]. 0,45 g de PEG a été dissous dans 5 ml d'eau ultrapure et ajouté à la dispersion USPIO-PAA de 15 ml (contient 35 mg de Fe) complétée par 20 mg d'EDC et 12 mg de NHS. Le mélange a été agité mécaniquement à température ambiante pendant 2 h, puis 10 ml de solvant DMF ont été ajoutés, en éliminant l'eau à 40 °C dans l'appareil d'évaporation rotatif. Enfin, 40 mg de DEC et 24 mg de NHS ont été ajoutés au mélange, en mélangeant à température ambiante pendant 48 h. La solution réactionnelle a été transférée dans un sac de dialyse dans de l'eau ultrapure pendant 72 h, période au cours de laquelle l'eau ultrapure a été remplacée toutes les 12 h. Le mélange a ensuite été transféré dans un tube d'ultrafiltration pour collecter les molécules avec un Mr > 30 kD par centrifugation à 4000 tr/min pendant 10 min. Le produit final a été dissous dans de l'eau ultrapure et conservé à 4 °C. Dans certains cas, le SPIO-PAA/PEG se dissolvant dans l'eau a été collecté par centrifugation avec un tube à centrifugation d'ultrafiltration (>  30 KD taille des pores, Millipore), et les pastilles ont été séchées dans une étuve à vide pour une expérience plus approfondie.

Caractérisation des NP

La granulométrie, la distribution granulométrique et la morphologie des échantillons ont été analysées par MET. La couche de revêtement a été mesurée par coloration négative. Après dispersion par ultrasons, l'USPIO-PAA et l'USPIO-PAA/PEG en solution aqueuse ont été ajoutés au réseau de cuivre de la membrane de support en carbone de 300 mesh, séchés naturellement puis placés dans un microscope électronique à projection (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) pour observation.

L'analyse par spectroscopie infrarouge est effectuée sur le spectromètre FTIR Agilent Technologies Cary 600 Series, où la poudre d'échantillon séchée est ajoutée directement au réservoir d'échantillon pour la détection.

La teneur en Fe dans la dispersion USPIO-PAA/PEG a été déterminée par spectrométrie d'absorption atomique à flamme (FAAS), dont le modèle est PerkinElmer Analyst 700. Tout d'abord, une solution étalon de fer à 1, 2, 3, 4 et 5 μg/mL a été configurée pour courbe standard, puis 100 μL de solution de dispersion USPIO-PAA ou USPIO-PAA/PEG ont été dissous avec de l'acide nitrique, et la teneur en fer a été déterminée dans une fiole jaugée de 50 mL.

L'imagerie par résonance magnétique des nanoparticules a été réalisée sur des scanners cliniques avec un champ magnétique de 3 T dans le service d'imagerie du premier hôpital affilié de l'Université de Soochow. Les nanoparticules ont été dispersées dans une solution de gel d'agarose à 1% selon la concentration correspondante. Après solidification de la solution, le temps de relaxation transversale des échantillons a été mesuré par séquence multi-écho. En exportant l'acquisition de l'IRM au format DICOM puis en utilisant le RadiAnt DICOM Viewer pour ouvrir, lire la valeur de gris, en important les valeurs de gris de différents temps d'écho dans l'origine pour l'ajustement, les valeurs de temps de relaxation transversale des dispersions USPIO avec différentes concentrations ont été obtenues; enfin, la vitesse de relaxation transversale r2 des échantillons USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG a été obtenue par ajustement linéaire avec la vitesse de relaxation transversale de 1/T2 et la concentration en Fe des échantillons. Les boucles d'hystérésis magnétique de l'USPIO-PAA et de l'USPIO-PAA/PEG ont été acquises en utilisant le dispositif Quantum Design DynaCool-9 à l'Université des sciences et technologies de Suzhou selon les méthodes décrites précédemment [24].

Isolement et identification des HADSC

Toutes les études ont été réalisées conformément aux « Principes directeurs éthiques sur la recherche sur les cellules souches embryonnaires humaines » (du ministère des Sciences et de la Technologie et du ministère de la Santé, République populaire de Chine, 2003) et à la Déclaration d'Helsinki. Des échantillons adipeux ont été obtenus avec le consentement éclairé et l'approbation éthique du premier hôpital affilié de l'Université de Soochow. Le tissu adipeux a été lavé et coupé en petits morceaux après avoir retiré les vaisseaux sanguins et le tissu conjonctif sous un microscope anatomique. Les blocs ont été digérés avec de la collagénase de type I (0,3 pzu/mL) à 37 °C pendant 30 min, suivi d'une centrifugation à 500g pendant 10 minutes. Le culot cellulaire a été mis en suspension dans du DMEM + 10% FBS et ensemencé à la densité de 8 × 10 ⁴ /cm ² . Après 48 h, l'ancien milieu contenant les cellules flottantes a été jeté et remplacé par du milieu frais.

Les HADSC ont été caractérisées par cytométrie en flux pour des marqueurs de surface marquant spécifiquement les cellules souches mésenchymateuses (CD90 et CD105) et hématopoïétiques (CD34 et CD45). Un total de 1 x 105 cellules ont été récoltées et incubées avec des anticorps monoclonaux antihumains de souris PE, FITC, APC/cy7 ou PerCP contre CD34, CD45, CD90 et CD105 et des contrôles isotypiques appropriés. Les cellules colorées ont été analysées à l'aide d'un cytomètre en flux (LSRFortessa, BD, USA) et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Quatre phénotypes de CD90+, CD105+, CD34− et CD45− ont été sélectionnés pour les marqueurs de surface des HADSC. Les niveaux d'expression des marqueurs de la surface cellulaire ont été identifiés par cytométrie en flux (BD LSRFortessa).

La différenciation adipogène et ostéogénique des HADSC a été évaluée par Oil Red O et Alizarin Red Staining, respectivement. Les HADSC ont été cultivées avec le milieu de différenciation adipogène MesenCultTM (Stem cell Tech., 05412) ou le kit de différenciation ostéogénique OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Pour la différenciation adipogène des HADSC, les cellules ont été évaluées au jour 14 par coloration qualitative Oil Red O pour les adipocytes matures remplis de lipides (VivaCell Biosciences, C37A00150). Pour la différenciation ostéogénique des HADSC, les cellules ont été évaluées au jour 21 par coloration au rouge alizarine pour les nodules de calcium dans les ostéocytes matures (VivaCell Biosciences, C37C00150). Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope inversé Nexcope.

Capture cellulaire in vitro de l'USPIO-PAA/PEG et évaluation de la biocompatibilité

Les HADSC ont été étalés dans une plaque à 6 puits avec une densité de 1 × 10 ⁶ par puits. Les cellules ont été incubées avec le milieu contenant USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL et 0,1 μg/mL) pendant 2 h, et colorées au bleu de Prusse (PB) pour l'identification du Fe intracellulaire.

La biocompatibilité de l'USPIO-PAA/PEG a été déterminée par colorimétrie MTT et dosage d'incorporation de 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) (kit de prolifération EdU, Thermo). Pour le MTT, les HADSC ont été étalés dans une plaque à 96 puits à une densité de 5 × 10 ³ par puits et incubés avec différentes concentrations (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) d'USPIO-PAA/PEG 24 h, 48 h ou 72 h. 20 μl de solution de MTT (5 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits pendant 4 h, suivis de 150 μL de diméthylsulfoxyde pour dissoudre les cristaux. La valeur d'absorbance de chaque trou a été mesurée à une DO 570 nm à l'aide d'un instrument à marquage enzymatique (BioTek Synergy HT). Pour le dosage de l'EdU, les HADSC ont été incubés avec le SPIO-PAA/PEG à 160 g/mL de Fe pendant 72 h, suivis de l'incubation avec 10 μM d'EdU pendant 24 h. Les cellules ont été collectées, fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % et neutralisées avec une glycine à 2 mg/mL. Après incubation des cellules de perméalisation avec la solution de colorant (complexe Azide 647), les taux d'incorporation d'EdU ont été évalués par cytométrie en flux.

Modèle de DP induit par 6-OHDA

Quinze à vingt rats Wistar mâles (grade SPF, pesant 220 ± 20 g) ont été utilisés pour le traçage in vivo de HADSC marqués USPIO-PAA/PEG sur des animaux atteints de la MP. Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la réglementation en Chine (Règlement pour l'administration des affaires concernant les animaux de laboratoire, 2017) et approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Académie chinoise des sciences. Tout au long, les animaux ont été hébergés sous un éclairage contrôlé (cycle lumière/obscurité de 12/12 h, « activé » à 7 h 00) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le modèle PD a été préparé par injection en 2 points de 6-hydroxydopamine (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA) dans le striatum unilatéral de rats. Comme décrit précédemment [25, 26], des rats ont reçu une injection stéréotaxique de 3 μL de solution de 6-OHDA (5 μg/μL) à 2 coordonnées (AP :1,2 mm, ML :2,2 mm, DV :- 4,0 à 6,0 mm ; et AP :− 1,0 mm, ML :4,4 mm, DV :− 4,5 à 6,5 mm), respectivement. Des tests de rotation induits par l'apomorphine (0,5 mg/kg, par voie sous-cutanée) ont été utilisés pour tester la validité des modèles de DP. Les rats ont reçu une injection d'apomorphine (0,5 mg/kg) par voie sous-cutanée à 1, 2 et 3 semaines après le traitement par 6-OHDA, et les scores de rotation ont été évalués pendant 30 min en champ libre. Le modèle PD a plus de 7 rotations par minute induites par l'apomorphine et a été considéré comme réussi.

Transplantation cellulaire et imagerie IRM in vivo

Les HADC ont été incubées avec USPIO-PAA/PEG (la concentration en fer était de 10 μg/mL) pendant 2 h lorsqu'elles ont atteint 80 % de confluence. 3 semaines après la préparation du modèle de DP, 3 × 10 ⁶ de HADC ou de solution saline marquées USPIO-PAA/PEG ont été injectés dans le striatum gauche de modèles de rats PD aux coordonnées suivantes (AP :1,2 mm, ML :2,2 mm, DV :- 4,0 à 6,0 mm). Les animaux ayant reçu une transplantation ont reçu de la buprénorphine (0,5 mg/kg) immédiatement après la chirurgie et pendant 2 jours par la suite. Ces animaux ont été soumis aux tests de rotation induits par l'apomorphine à 1, 2 ou 3 semaines après la chirurgie de transplantation.

Pour l'IRM in vivo, les animaux ont été imagés à l'aide d'un système d'imagerie in vivo (IVIS) pour petits animaux (PerkinElmer, Waltham, MA, États-Unis) aux 3e, 9e, 15e et 21e jours suivant l'injection de solution saline ou de HADSC.

Analyse histologique

Les cerveaux des modèles de rats restants ont été récoltés et sectionnés à une épaisseur de 30 mm pour analyse 3 semaines après la transplantation de cellules souches (n = 5 par groupe). Les coupes ont été incubées avec de l'anti-tyrosine hydroxylase (TH, abcam, Angleterre) et visualisées avec un anticorps d'âne anti-lapin conjugué à Alexa-594 (Abcam). Le DAPI a été utilisé pour la contre-coloration avec les noyaux. Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal Leica TCS SP5.

Analyse statistique

Les données numériques ont été exprimées en tant que moyenne  ± SD. Les données ont été soumises à des tests t de Student bilatéraux ou à une ANOVA unidirectionnelle en utilisant GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) pour évaluer la différence. * indique p < 0,05 et NS n'indiquent aucune différence significative.

Résultats

La synthèse et la caractérisation des nanoparticules

La conception expérimentale est illustrée à la Fig. 1. Les NPs USPIO hydrophobes ont été préparées en utilisant la méthode de décomposition thermique. Comme le montrent les Fig. 2a–c, le diamètre des NPs USPIO d'origine était de 4,07 ± 0,57 nm ; par revêtement avec du PAA, le diamètre des NPs USPIO-PAA a augmenté jusqu'à 6,34 ± 0,54 nm ; une autre modification des NP avec du PEG fait que le diamètre des NP USPIO-PAA/PEG atteint 10,07 ± 0,55 nm. Les trois nanoparticules étaient de forme sphérique et uniformément dispersées. L'analyse statistique a montré qu'il y avait une différence significative (F = 10, ***i>p < 0,01, ##p < 0,01) parmi les diamètres des NPs USPIO, USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG, indiquant une modification réussie avec PAA et PEG (Fig. 2d).

Illustration schématique de la conception expérimentale

Caractérisation des nanoparticules. a–c Images TEM représentatives des NP USPIO (a ), les NP USPIO-PAA (b ) et les NP USPIO-PAA/PEG (c ). d L'analyse statistique a indiqué une différence significative entre la taille des particules d'USPIO, USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG (n = 20 par groupe). e Infrarouge à transformée de Fourier de nanoparticules de NPs USPIO, USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG. Les flèches indiquent le pic d'absorption spécifique à 1728 cm ⁻¹ en raison de la modification PAA, 1595 cm ⁻¹ et 3 440 cm ⁻¹ en raison de la modification du PEG. Les données numériques sont présentées sous forme de moyenne  ± SD, **p < 0,01 par rapport aux NP de l'USPIO, ##p <0,01 versus les NP USPIO-PAA/PEG. La barre représente 20 nm

En utilisant la méthode d'absorption infrarouge, nous avons constaté que l'USPIO-PAA a un pic d'absorption de carbonyle évident à 1728 cm ⁻¹ en raison du pic de vibration d'étirement du carbonyle dans la molécule de PAA ; L'USPIO-PAA/PEG présente un pic de vibration de flexion dans le plan de la liaison carbone-azote à 1 595 cm ⁻¹ et un pic de vibration d'étirement du groupe hydroxyle à 3 440 cm ⁻¹ (Fig. 2e). Toutes ces données ont en outre confirmé que les molécules de PAA ou de PEG ont été modifiées avec succès à la surface des NP.

USPIO-PAA/PEG a montré une bonne réponse magnétique in vitro et une bonne biocompatibilité avec HADSC

La capacité d'imagerie in vitro de l'USPIO-PAA et de l'USPIO-PAA/PEG a été évaluée par les valeurs en niveaux de gris des images IRM à différentes concentrations (équivalentes aux concentrations de Fe). Après ajustement, les valeurs de temps de relaxation transversale des dispersions à différentes concentrations ont été obtenues. En définissant le taux de relaxation transversale de 1/T2 comme coordonnée verticale et la concentration de Fe comme coordonnée horizontale, le taux de relaxation transversale de l'USPIO-PAA a été calculé à 107,94 s ⁻¹ mm ⁻¹ (Fig. 3a) et 84,65 s ⁻¹ mm ⁻¹ pour USPIO-PAA/PEG (Fig. 3b). Les deux particules ont montré de bonnes propriétés d'imagerie IRM. Les boucles d'hystérésis magnétique du SPIO-PAA et du SPIO-PAA/PEG ont montré que la valeur d'aimantation à saturation du SPIO-PAA est de 57 emu/g au-dessus de 10 000 Oe (Fig. 3c), et celle du SPIO-PAA/PEG est de 40 emu/g au-dessus de 10 000 Oe (Fig. 3d). La force coercitive et la rémanence étaient proches de zéro (Fig. 3c, d), indiquant en outre que SPIO-PAA et SPIO-PAA/PEG étaient des superparamagnétisme.

Réponse magnétique in vitro des NP synthétisées USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG. un , b IRM et taux de relaxation transversale des NPs USPIO-PAA (a ) et les NP USPIO-PAA/PEG (b ). r ₂ représente le taux de relaxation. Les taux de relaxation des NP USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG étaient de 107,94 s ⁻¹ mM ⁻¹ et 84,65 s ⁻¹ mM ⁻¹ . c , d boucles d'hystérésis magnétique des NPs USPIO-PAA (c ) et les NP USPIO-PAA/PEG (d ). L'hystérésis magnétique a été mesurée à 295 k (21,85 °C) avec une intensité de champ magnétique maximale de 50 000 Oe (5 Telsa). Les valeurs d'aimantation à saturation étaient proches de 57 emu/g pour SPIO-PAA et 40 emu/g pour SPIO-PAA/PEG. L'hystérésis de magnétisation dans les deux courbes était proche de zéro

En incubant les NP USPIO-PAA/PEG avec des HADSC pendant un temps différent, nous avons constaté que les NP USPIO-PAA/PEG n'avaient aucun effet significatif sur la survie des cellules (p> 0,05). La viabilité cellulaire des HADSC reste supérieure à 96 % lorsque la concentration équivalente en Fe variait de 0 à 160 μg/mL. De plus, l'augmentation du temps d'incubation (de 24 à 72 h) n'induit pas de perte cellulaire significative à chaque concentration en Fe (Fig. 4a). Une observation similaire a été obtenue lorsque les NPs USPIO-PAA/PEG ont été incubées avec des iPSC à différentes concentrations (Fig. 4b). Même si les HADSC ont été traités avec 160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG pendant 72 h, la capacité de prolifération, comme indiqué par les taux d'incorporation d'EdU, n'a pas été altérée par la présence d'USPIO-PAA/PEG (Fig. 4c). Toutes ces données ont indiqué la biosécurité des NPs USPIO-PAA/PEG synthétisées.

Les NPs USPIO-PAA/PEG synthétisées présentent une bonne biocompatibilité et une bonne capacité de marquage. un , b Les HADSC ou les iPSC ont été incubés avec des NPs USPIO-PAA/PEG à des concentrations variables (équivalentes à des concentrations de Fe à 0, 10, 20, 40, 80 et 160 μg Fe/mL) pendant 24, 48 et 72 h, et la viabilité cellulaire a été déterminé par la méthode MTT et montré dans a , b , respectivement. Il n'y a pas de différence significative entre les viabilités à différentes concentrations de NP (n = 5) ou temps d'incubation (n = 5). c L'analyse par cytométrie en flux a montré que les taux d'incorporation d'EdU étaient similaires dans les HADSC incubés en présence ou en l'absence d'USPIO-PAA/PEG (160 μg Fe/mL pendant 72 h). Les HADSC non traités avec l'EdU ont servi de contrôle négatif. d L'USPIO-PAA/PEG à 10 μg Fe/mL et un temps d'incubation de 2 h ont permis d'obtenir une efficacité de marquage de près de 100 % des HADSC, évaluée par coloration au bleu de Prusse. Notez que l'USPIO-PAA/PEG à 0,1 μg Fe/mL (temps d'incubation de 2 h) a produit une coloration PB légère mais uniforme dans les HADSC. Les données numériques sont présentées sous forme de moyenne  ± SD. La barre représente 20 μm

Pour identifier si les cellules pouvaient être efficacement étiquetées par les NP USPIO-PAA/PEG, nous avons incubé les HADSC avec des NP USPIO-PAA/PEG à un Fe équivalent à 10 μg/mL ou 0,1 μg/mL pendant 2 h. Comme le montre la figure 4d, un grand nombre de NP colorées en bleu ont été observées dans près de 100 % des HADSC en présence d'USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL). Même si la dose d'USPIO-PAA/PEG a été réduite à 0,1 μg Fe/ml, nous avons tout de même observé une coloration PB plutôt uniforme et dispersée dans presque tous les HADSC. Par rapport à certains des autres SPIO signalés [14, 27, 28], l'USPIO-PAA/PEG a présenté une efficacité d'absorption cellulaire élevée.

Suivi à long terme des HADSC marqués USPIO-PAA/PEG NPs dans des modèles de rats PD

Des HADSC marqués avec des NP USPIO-PAA/PEG ont été transplantés dans le striatum gauche du modèle de rat PD par injection stéréotaxique. Comme le montre la figure 5, nous avons observé un signal IRM clair dans le striatum gauche 3 jours après la transplantation HADSC, indiquant un bon traçage in vivo des cellules transplantées. Une observation dynamique à J3, J9, J15 et J21 après transplantation a montré que les cellules transplantées avec marquage NP pouvaient être clairement tracées jusqu'à 3 semaines, et les signaux IRM n'ont pas montré de réduction évidente au cours du processus. Ces résultats indiquent que les nanoparticules synthétisées ont un bon potentiel pour le traçage in vivo des cellules transplantées.

Images IRM représentatives des cerveaux à 3 jours, 9 jours, 15 jours et 21 jours, suivies d'une transplantation avec des HADSC de marquage USPIO-PAA/PEG ou une solution saline. Les images IRM des contrôles correspondants, c'est-à-dire des rats normaux ou un modèle de rat PD injecté avec une solution saline, ont été montrées dans les 1ère et 2ème rangées, respectivement. Notez que par rapport aux signaux négatifs dans le contrôle, les cerveaux de rats transplantés avec des HADSC marqués USPIO-PAA/PEG ont montré des signaux IRM constants et clairs jusqu'à 21 jours. La barre représente 5 mm

Les HADSC marqués USPIO-PAA/PEG NPs ont présenté des effets thérapeutiques dans le modèle de PD

Pour évaluer si les HADSC marqués par des NPs présentaient des effets thérapeutiques, nous avons d'abord effectué une caractérisation phénotypique des HADSC isolés. Comme le montre la figure 6a, les HADSC cultivées étaient des cellules en forme de fuseau. L'analyse par cytométrie en flux a montré que les HADSC étaient des marqueurs hautement exprimés pour les cellules mésenchymateuses, telles que CD90 (> 99%) et CD105 (> 99%), alors que peu d'entre elles exprimaient des marqueurs hématopoïétiques tels que CD34 et CD45 (Fig. 6b–g ). Les HADSC pouvaient se différencier vers des lignées adipogènes ou ostéogéniques dans certaines conditions, et la capacité de différenciation a été montrée par Oil Red O ou Alizarin Red Staining, respectivement (Fig. 5h). Notez les gouttelettes lipidiques ou les nodules calcifiés dans les HADSC différenciés, alors qu'aucune structure de ce type n'est présente dans les cellules HEK293 de contrôle (Fig. 6h). Tous ces éléments indiquent que les HADSC remplissent les critères des cellules mésenchymateuses.

Caractérisation des HADSC. un Une image représentative sous l'expression microscope à contraste montrant que les HADSC ont un phénotype typique en forme de fuseau. b–g Les HADSC ont été incubés avec des anticorps conjugués avec différents colorants contre les marqueurs CD45, CD105, CD34 et CD90 et soumis à une analyse par cytométrie en flux. Les diagrammes de dispersion sont présentés dans b, c , et les histogrammes sont affichés en d–g . Notez que la plupart des cellules étaient exprimées CD90 et CD105, mais pas CD34 et CD45. h La différenciation adipogène et la différenciation ostéogénique des cellules HADSC par rapport aux cellules HEK293 sont évaluées par Oil Red O ou Alizarin Red Staining, respectivement. La barre représente 20 μm

Les rotations induites par l'apomorphine étaient de 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 et 31,86 ± 1,72 par min au cours des 1ère, 2ème et 3ème semaines après l'injection de 6-OHDA, confirmant l'établissement réussi du modèle de PD chez le rat. Comme le montre la figure 7, le nombre de rotations des modèles de rats PD a été réduit à 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 et 31,54 ± 1,73 au cours des 1ère, 2e et 3e semaines, suivi d'une transplantation de HADSC marqués par NP dans le striatum du côté de la lésion. L'analyse statistique a révélé une différence significative entre les groupes recevant une solution saline et le groupe HADSC à partir de la 2e semaine après la chirurgie de transplantation (p < 0,01 à la 2e semaine, p < 0,01 à la 3e semaine ; n = 5 dans chaque groupe), indiquant que les HADSC marqués par les NP améliorent les troubles du comportement dans les modèles de DP.

Des modèles de rat PD ont été administrés avec une solution saline ou des HADSC marqués USPIO-PAA/PEG dans le striatum ipsilatéral altéré par la 6-OHDA, et les nombres de rotations par minute ont été notés et comparés. Il y a une réduction significative du nombre de rotations au cours des 2e et 3e semaines après que les rats PD reçoivent des HADSC, par rapport aux rats PD correspondants recevant une solution saline. ns indique un changement insignifiant et ** indique p < 0,01. n = 5 pour chaque groupe

La MP est caractérisée par la perte de neurones exprimant la tyrosine hydroxylase (TH) dans la substance noire. En utilisant l'immunocoloration contre la TH, nous avons constaté que la 6-OHDA réduit les neurones exprimant la TH dans la substance noire, et la transplantation avec des HADSC dans le striatum des modèles de rats PD pourrait atténuer cette réduction (Fig. 8). Combiné avec l'observation que la transplantation cellulaire atténue les troubles du comportement des rats PD, nous avons conclu que les HADSC marqués USPIO-PAA/PEG NPs exercent des effets thérapeutiques dans les modèles de rat PD.

Immunomarquage contre TH dans la substance noire des rats recevant une solution saline (a , d , g ), rats PD recevant une solution saline (b , e , h ) ou des rats PD recevant des HADSC marqués USPIO-PAA/PEG NPs (c , f , je ). La zone dans le cadre en pointillés indique la zone compacte de la substance noire (SNc) et la zone tegmentale ventrale (VTA). Images dans les cases de d , e , f sont agrandies et affichées en g , h , je , respectivement. Il y a moins de cellules exprimant TH dans les régions SNc et VTA chez les rats recevant une injection de 6-OHDA, par rapport aux témoins recevant une solution saline. Suite à une transplantation HADSC, davantage de cellules exprimant TH dans le SNc de rats PD ont pu être observées. La barre représente 100 μm

Discussion

La thérapie cellulaire est une stratégie prometteuse pour le traitement des maladies neurodégénératives et a été à la pointe de la recherche préclinique au cours des 20 dernières années [29, 30]. Le traçage des cellules transplantées est un élément indispensable pour la clarification des mécanismes sous-jacents ainsi que l'évaluation des effets cliniques; cependant, il est difficile et dans une certaine mesure, a entravé l'application de la thérapie cellulaire [31, 32]. La tomodensitométrie (CT), l'imagerie par fluorescence proche infrarouge (NIFI) et l'IRM sont les méthodes les plus couramment utilisées pour le suivi in ​​vivo des cellules transplantées [31, 32]. Par rapport au rayonnement plutôt élevé du scanner et à la faible sensibilité du NIFI, l'IRM montre une bonne imagerie des tissus profonds, un contraste élevé et un faible rayonnement ionisant, ce qui en fait un bon candidat pour le traçage in vivo [33,34,35,36]. Le développement de traceurs appropriés pour l'IRM devient donc un élément indispensable pour promouvoir l'application de la thérapie cellulaire.

SPIO est une stratégie d'étiquetage simple et fiable pour la visualisation IRM. Pour obtenir un traçage in vivo à long terme des cellules transplantées, les particules SPIO doivent avoir une taille uniforme et ultrapetite, car les grosses particules peuvent entraîner une distribution inégale des traceurs et interférer avec la circulation sanguine normale [33]. De plus, l'efficacité d'internalisation et la biocompatibilité des nanoparticules sont un autre indice important pour évaluer les traceurs. Les nanoparticules pénètrent généralement dans les cellules par endocytose en phase liquide [37], endocytose médiée par des récepteurs [38] et phagocytose [39]. Pour obtenir une meilleure absorption cellulaire, les particules SPIO sont généralement modifiées avec des ligands intermédiaires [18, 40, 41].

Outre le suivi cellulaire, SPIO a également été appliqué pour l'administration de médicaments [42]. La distribution tissulaire et la clairance pharmacocinétique sont des indices importants pour les deux applications. Par rapport aux NPs-PAA, les NPs-PAA/PEG ont montré un temps de rétention dans le sang plus long et une clairance urinaire plus lente [43]. Les NP densément recouvertes de PEG offrent une distribution beaucoup plus uniforme sur les surfaces épithéliales des muqueuses, y compris le tractus gastro-intestinal [44], le système respiratoire [45, 46] et les tumeurs cérébrales [42], etc. De plus, le revêtement PEG réduit l'attachement des protéines et la formation de la couronne, ce qui pourrait à son tour favoriser une distribution uniforme des NP au prix d'une absorption réduite [47]. En tant que bon outil diagnostique et thérapeutique potentiel, la capacité de marquage de SPIO-PAA/PEG aux CSM et son application ultérieure dans les troubles cérébraux tels que la MP n'ont pas été bien étudiées, et la présente étude a été conçue pour répondre à cette question. Dans la présente étude, nous avons synthétisé de nouvelles nanoparticules ultrapetites USPIO-PAA/PEG, modifiant les noyaux SPIO avec des ligands PAA et PEG, respectivement. Les NP USPIO-PAA/PEG ont un diamètre ultra-petit uniforme (10,07 ± 0,55 nm), une bonne dispersion en solution aqueuse, une biocompatibilité avec divers types de cellules ainsi qu'un bon effet de réponse magnétique in vitro et in vivo. Il est important de noter que les signaux des HADSC marqués pourraient être clairement détectés par IRM après une transplantation cérébrale jusqu'à trois semaines, indiquant le bon potentiel d'application clinique.

La MP se caractérise par une perte progressive des neurones dopaminergiques dans la substance noire, et par une déficience des niveaux dopaminergiques dans les réseaux dopaminergiques [1]; la plus touchée est la voie nigro-striée incluant le striatum. Dans la présente étude, nous avons transplanté des HADSC marqués USPIO-PAA/PEG dans le striatum de modèles de rats PD et avons constaté qu'une telle transplantation améliorait les troubles du comportement; de plus, il a atténué dans une certaine mesure la perte de neurones dopaminergiques dans la substance noire. De même, Ardeshir et al. ont rapporté que la transplantation des CSM dérivées de tissus adipeux de rat atténuait les rotations induites par l'apomorphine dans les modèles de MP [48]. À la différence de la transplantation de tissus du mésencéphale fœtal [49] ou de progéniteurs neuraux dopaminergiques [50], les HADSC exercent leurs effets thérapeutiques principalement par le biais des effets paracrines [51, 52], plutôt que de se substituer aux tissus altérés. Des études ont montré que les CSM agissent comme des promoteurs d'immunomodulation, de neuroprotection et de différenciation neuronale, et ces effets sont essentiellement médiés par le sécrétome libéré par les CSM [6, 7, 51]. Notre résultat est cohérent avec ces observations; de plus, cela indique que les nouveaux traceurs USPIO-PAA/PEG n'ont pas interféré avec les effets de neuroprotection des HADSC.

Conclusions

Nous avons développé un nouveau traceur USPIO-PAA/PEG présentant une efficacité d'absorption cellulaire élevée, une excellente biocompatibilité et des capacités de traçage IRM à long terme. Les HADSC marqués à l'USPIO-PAA/PEG ont pu être tracés par IRM pendant 3 semaines après la transplantation cellulaire. De plus, les HADSC marqués ont considérablement atténué les troubles du comportement des modèles de MP et augmenté le nombre de neurones dopaminergiques dans la substance noire. Le développement du traceur USPIO-PAA/PEG peut fournir un outil prometteur dans la recherche et l'application des cellules souches.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données étayant les conclusions de cet article sont incluses dans l'article.

Abréviations

SPIO :

Petit oxyde de fer superparamagnétique

USPIO :

Oxyde de fer superparamagnétique ultra-petit

AAP :

Acide polyacrylique

PEG :

Méthoxypolyéthylène glycol amine

HADSC :

Cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux

USPIO-PAA/PEG :

Revêtement ultra-petit de nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétique avec l'acide polyacrylique et l'amine de méthoxypolyéthylène glycol

6-OHDA :

6-Hydroxydopamine

CT :

Tomodensitométrie

NIFI :

Imagerie de fluorescence proche infrarouge

IRM :

Imagerie par résonance magnétique

TH :

Tyrosine hydroxylase

TEM :

Microscope électronique à transmission