Évaluation de l'efficacité de l'absorption cellulaire selon de multiples inhibiteurs de nanoparticules Fe3O4-Au Core-Shell :possibilité de contrôler l'endocytose spécifique dans les cellules de cancer colorectal

Introduction

Les nanomatériaux ont ouvert de nouvelles voies pour le diagnostic clinique et la thérapeutique. En particulier, les nanoparticules (NP) sont l'un des outils les plus importants et ont été utilisées dans des applications telles que les biocapteurs [1, 2], les diagnostics [3, 4] et les systèmes d'administration de médicaments ciblés [5, 6]. Pour les applications biomédicales, les nanoparticules sont généralement composées de matériaux organiques entourant la surface des matériaux du noyau [7,8,9]. Les matériaux du noyau, qui sont constitués de matériaux magnétiques, de matériaux semi-conducteurs ou d'autres types de matériaux, ont des propriétés physico-chimiques utiles, et la surface organique externe fournit une stabilité chimique et une fonctionnalité aux NP. Pour les applications dans les systèmes de ciblage biologique, non seulement les propriétés physico-chimiques mais aussi la surface organique externe, qui sont biofonctionnalisées pour le ciblage, sont des paramètres critiques. Des exemples de fragments de ciblage pour la fonctionnalisation sont des anticorps ou des ligands qui sont spécifiques d'une cible. En fonction des matériaux biofonctionnalisés sur la surface externe, les mécanismes d'endocytose des NPs sont déterminés. Le mécanisme qui permet aux NP d'entrer dans les cellules a fait l'objet de nombreux travaux de recherche récents en raison de leur importance dans les applications en nanomédecine [10,11,12,13,14,15].

En particulier, les NP magnétiques ont été largement utilisées dans de nombreuses applications de ciblage de sites spécifiques, notamment le tri cellulaire [16, 17], l'IRM [18], l'isolement d'ADN [19], l'administration de médicaments [20], le traitement de l'hyperthermie [21] et le cancer. ciblage [22]. Parmi diverses NP magnétiques, les nanocristaux de magnétite ont été les plus largement utilisés dans les applications biomédicales en raison de leur biocompatibilité et de leur stabilité chimique. Bien que de nombreux efforts aient été consacrés aux applications biomédicales utilisant des NP magnétiques, il existe encore des problèmes critiques tels qu'une bonne dispersibilité en solution aqueuse, la fonctionnalité et la biocompatibilité. Pour surmonter ces problèmes, de nombreuses études se sont concentrées sur la modification de surface des NP en utilisant une variété de groupes fonctionnels (par exemple, les groupes carboxyle et amine) [23]. Cependant, la fixation des groupes fonctionnels à la surface des NP de magnétite est un processus long et laborieux. Compte tenu de ce fait, les NP magnétiques revêtues d'Au de type noyau-coquille sont attrayantes car la surface de l'Au peut facilement se lier aux biomolécules et aux matériaux organiques.

En particulier, les propriétés magnétiques des NP à noyau magnétique et enveloppe Au permettent la séparation magnétique, augmentent la résolution de l'imagerie IRM et peuvent être appliquées à la thérapie par hyperthermie. De plus, les propriétés supérieures de liaison chimique de l'or sont avantageuses pour la construction de systèmes de délivrance médiés par des récepteurs pour le ciblage spécifique du cancer [24,25,26].

Au cours des dernières décennies, de nombreux chercheurs ont signalé des systèmes d'administration à médiation par des récepteurs pour le ciblage du cancer [27,28,29].

Le ciblage médié par les récepteurs des cellules cancéreuses est une forme de ciblage actif. Le choix de la cible est la clé d'un ciblage actif efficace, et les cibles doivent être surexprimées sur la membrane extracellulaire. La plupart des chercheurs ont utilisé des anticorps monoclonaux pour le traitement du cancer, et l'effet thérapeutique pourrait être considérablement accru lorsque les thérapies par anticorps monoclonaux sont associées à une chimiothérapie conventionnelle [30]. Malgré le succès de la thérapie par anticorps monoclonaux, les anticorps monoclonaux présentent plusieurs limitations dans le ciblage du cancer. Leur grande taille (environ 150 kDa) est un obstacle majeur à la pénétration tumorale [31, 32], et leur faible stabilité et faible solubilité entravent leur utilisation généralisée [33]. La direction inhomogène de leur fixation sur le support de ciblage est également considérée comme un obstacle à la liaison non spécifique. Pour produire des anticorps avec une pénétration tumorale améliorée, une large gamme de formats d'anticorps ont été conçus et testés [34]. Outre les anticorps classiques, un format d'anticorps unique est présent chez les espèces de la famille des camélidés. Les anticorps dits à chaînes lourdes (HCAb) sont naturellement présents dans le sang périphérique et le lait de ces espèces. Les fragments de liaison à l'antigène de ces HCAb sont composés d'un seul domaine, le domaine variable de chaîne lourde (VH) du camélidé HCAb (VHH). Le VHH, obtenu de manière recombinante après clonage et expression dans des bactéries ou des champignons, est appelé nanocorps. Il a un poids moléculaire de 11-15 kDa et est le plus petit anticorps parmi tous les mAb [35,36,37]. Non seulement leur petite taille les rend potentiellement appropriées comme sondes de ciblage contre des antigènes dans des endroits isolés, mais leur extrémité terminale facilement modifiable est également intéressante pour une application dans le ciblage du cancer.

La livraison efficace de NP avec un ciblage et une internalisation appropriés des cellules sont également des facteurs importants dans le système de livraison. Il a été rapporté que la vimentine joue un rôle important en tant que composant de l'attachement des agents pathogènes et des voies d'entrée intracellulaire. Le silence de l'expression du gène de la vimentine inhibe la phagocytose [38], tandis que la vimentine clivée est un signal qui augmente significativement la phagocytose [39]. Par conséquent, la neutralisation de la résistance à la phagocytose cellulaire causée par la vimentine à la surface cellulaire est importante pour une livraison efficace des nanoparticules.

Dans cette étude, nous étudions les voies d'endocytose de Fe₃ marqué par des nanocorps. O₄ -Au core-shell NPs modifiés avec des espaceurs PEG (polyéthylène glycol) de différentes longueurs. La vimentine, qui est connue pour avoir un effet puissant sur la phagocytose par des expériences biochimiques [39], a été comparée à un contrôle, et il a été confirmé qu'elle agit efficacement sur l'internalisation cellulaire des NP. En outre, la Muc1, qui est une glycoprotéine de surface cellulaire et surexprimée dans divers cancers, tels que le cancer du pancréas, du sein, du poumon et de l'estomac, est utilisée comme biomarqueur de ciblage du cancer. Nous avons confirmé l'internalisation efficace de Fe₃ O₄ NPs noyau-enveloppe Au et méthodes de ciblage contrôlable des cellules cancéreuses via la voie d'endocytose médiée par le récepteur Muc1 dans les cellules coliques.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'acétate d'or (III) (Au(OOCCH3)3, 99,9%) a été obtenu auprès d'Alfa Aesar. Autres produits chimiques, y compris l'acétylacétonate de fer (III) (Fe(acac)₃ , 99,9%), 1,2-hexadécanediol (C14H29CH(OH)CH2(OH), 90%), bloc poly(éthylène glycol)-poly(propylène glycol)-bloc-poly(éthylène glycol) (PEG-PPG- PEG) et l'éther octylique (C8H17OC8H17, 99 %) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich et utilisés tels quels. L'alpha-pyridyl-2-disulfide-oméga-carboxy succinimidyl ester poly(éthylène glycol) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K et 10K) a été acheté auprès de Nanocs. Le bicarbonate de sodium, le WST-1, la chlorpromazine, la nystatine, la cytochalasine D, le dynasore, la brefeldine A (BFA), la monensine et le bleu trypan ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Cy3 et Cy7.5 ont été achetés auprès de Lumiprobe. Anti-Muc1 Ab a été acheté chez Abcam Inc. (Cambridge, MA). La solution saline tamponnée au phosphate (PBS), le milieu Eagle modifié de Dulbecco et le sérum de veau fœtal ont été achetés auprès d'Invitrogen Corp.

Synthèse de Fe₃ O₄ -Au Core-Shell NPs

Le Fe₃ O₄ -Au core-shell NPs ont été synthétisés via une méthode de nanoémulsion. Le processus de synthèse des NP core-shell se compose de deux étapes :(1) formation du Fe₃ O₄ noyau NPs et (2) revêtement de la coquille Au sur les NP magnétiques. Dans la première étape, le Fe₃ O₄ Les NP ont été préparées à partir d'une solution mixte de Fe(acac)₃ (0,1766 g ou 0,5 mmol), 1,2-hexadecandiol (0,6468 g ou 2,5 mmol), et copolymère bloc (poly(oxyde d'éthylène)-poly(oxyde de propylène)-poly(oxyde d'éthylène) ; 0,4 ~ 1,2 g) dans l'éther octylique. La solution mélangée a été chauffée à 300°C pour réduire le précurseur de Fe. La formation de Fe₃ O₄ noyau NPs a été complété par le refroidissement de la solution chauffée. Le deuxième processus a été conduit en continu sans aucun processus de purification après la formation du noyau magnétique. Les précurseurs Au (0,2338 g ou 0,62 mmol) et le 1,2-hexadecandiol (0,88 g, 3,4 mmol) ont été ajoutés dans l'émulsion constituée de Fe₃ O₄ NPs, puis la solution mélangée a été chauffée à 230 °C. Après refroidissement à température ambiante, l'émulsion a été précipitée par centrifugation et les NP core-shell ont été séparées.

Construction du vecteur d'expression recombinant Anti-Muc1-VHH 5-24 K10

L'amplification en chaîne par polymérase (PCR) a été réalisée en utilisant l'amorce sens 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3' et l'amorce inverse 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'. Le produit de PCR a été digéré avec EcoRI et Xhol et purifié sur gel en utilisant le kit d'extraction de gel rapide QIA (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Le produit PCR purifié a été cloné dans pET-23a digéré par EcoRI/Xhol (Novagen, Darmstadt, Allemagne). Escherichia coli (E. coli ) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) a été transformé avec la construction résultante par choc thermique et sélectionné sur des plaques de gélose LB contenant 100 μg/mL d'ampicilline (Duchefa Biochemie, Haarlem, Pays-Bas).

Expression et purification de la protéine recombinante

Pour exprimer et purifier la protéine recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10, E. coli Des souches BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) ont été transformées avec pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Les bactéries ont ensuite été cultivées dans du bouillon LB contenant de l'ampicilline (100 µg/mL). L'expression de la protéine a été induite par l'isopropyl β-d-thiogalactoside (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Pays-Bas) à une concentration finale de 0,4 mM pendant 5 h à 37 °C. Les culots bactériens ont été remis en suspension dans du tampon de lyse (50 mM NaH₂ Bon de commande₄ , pH 8,0 ; 300 mM NaCl) suivi d'une sonication sur glace pendant 10 min. Les lysats soniqués ont été centrifugés à 20 000 ×g pendant 20 min à 4 °C et soumis à la résine Ni-NTA His·Bind (Peptron, Daejeon, Corée). Les protéines marquées par His qui étaient liées à la résine ont été éluées avec un tampon d'élution (50  mM NaH₂ Bon de commande₄ , pH 8,0 ; 300 mM de NaCl ; 150 mM d'imidazole). La protéine purifiée a été séparée sur un gel SDS-PAGE à 15 %.

Modification de Core-Shell Fe₃ O₄ -Au NPs

L'OPSS-PEG-NHS à différentes longueurs (2, 5 et 10 K) a été dissous dans du bicarbonate de sodium 0,1 M pour l'activation des groupes thiol. L'OPSS-PEG-NHS activé a été ajouté à la solution de Fe₃ synthétisé core-shell O₄ -Au NPs et agité 12 h à 4 °C. Les groupes thiol de l'OPSS-PEG-NHS activé étaient liés de manière covalente à la surface Au des NP core-shell. Ensuite, une solution de nanocorps (0,25 mg/mL) a été ajoutée au Fe₃ PEGylé O₄ -Au core-shell NPs pendant 12 h à 4 °C. Les groupes amine des dix queues de lysine (K) à l'extrémité étaient liés de manière covalente aux groupes NHS d'OPSS-PEG-NHS à pH 8,3. Cy3 et Cy7.5 ont été marqués sur les groupes amine résiduels du nanocorps.

Courbe d'internalisation

Les cellules CT26 ont été ensemencées à 5 × 10 ³ cellules par puits dans une plaque 96 puits à fond transparent et incubées dans 250 μL de milieu de culture pendant 24 h à 37 °C dans 5% CO₂ dans le noir. Le milieu a été retiré, et 250 μL de milieu de culture frais contenant 50 μg/mL de Fe₃ marqué Cy3 O₄ -Au NPs et PEG-Cy3 ou PEG-nanobody-Cy3 NPs marqués ont été ajoutés à chaque puits. Les cellules ont encore été incubées pendant différentes périodes (0, 10, 20, 30, 60, 120 et 360  min). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS pour éliminer les NP libres, et la fluorescence de chaque puits a été mesurée avec du bleu trypan en tant qu'extincteur de fluorescence imperméable à la membrane par SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA). Chaque expérience a été réalisée avec des quantités égales de NP (50 μg/mL) et répétée trois fois [40].

Test d'inhibition

Les cellules CT26 ont été ensemencées à 5 × 10 ³ cellules par puits dans une plaque 96 puits à fond transparent et incubées dans 250 μL de milieu pendant 24 h à 37 °C dans 5% CO₂ dans le noir. Le milieu a été retiré et 250 L de milieu de culture frais contenant soit 20 g/mL de chlorpromazine (CPZ), 50 g/mL de nystatine, 20 g/mL de cytochalasine D, 25 g/mL de dynasore, 20 g/mL de BFA, 140 g/ ml de monensine ou 5 μM d'anticorps anti-Muc1 ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant 1 h.

Le milieu a été à nouveau retiré, et 250 μL de milieu de culture contenant 50 μg/mL de Fe₃ marqué Cy3 O₄ - NPs Au, NP marquées PEG-Cy3, NP marquées PEG-nanobody-Cy3 ou NP marquées vimentine-Cy3 a été ajoutée.

Après 1 h à 37 °C et 5% CO₂ , les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS pour éliminer les NP libres, et la fluorescence a été mesurée avec du bleu trypan en tant qu'extincteur de fluorescence imperméable à la membrane par SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA). Chaque expérience a été réalisée avec des quantités égales de NP (50  μg/mL) et répétée quatre fois.

Résultats et discussion

Les NP core-shell ont été synthétisées par une méthode publiée [16, 17]. Les observations en microscopie électronique à transmission (MET) sur les figures 1a, b montrent que le Fe₃ O₄ -Les NP core-shell étaient sphériques avec un diamètre moyen de 13,5  nm et une distribution de taille étroite.

Caractérisation du Fe₃ synthétisé O₄ -Au core-shell NPs. un , b Observations MET du Fe₃ synthétisé O₄ -Au core-shell NPs. c , d NPs en solution aqueuse, avant et après application d'un champ magnétique externe. e Le pic d'absorbance UV des NPs core-shell synthétisées apparaît à ~ 530 nm. f Boucles d'hystérésis magnétique de Fe₃ O₄ noyau

L'augmentation du ~ 8.5 nm du noyau NP (Fe₃ O₄ ) provient du revêtement d'une couche d'Au d'environ 2,5 nm d'épaisseur sur la surface du noyau, ce qui donne un NP noyau-enveloppe. Une image MET haute résolution avec l'analyse de la transformée de Fourier rapide (FFT) du Fe₃ O₄ -Au core-shell NP est inclus dans les informations supplémentaires Fig. S1.

Le produit fabriqué en solvant organique a été purifié par séparation magnétique et transféré dans l'eau.

Les NP core-shell étaient bien dispersées et stables dans l'eau sans aucune modification de surface, en raison des copolymères séquencés résiduels qui étaient présents sur les NP.

Les figures 1c et d montrent les NP en solution aqueuse avant et après l'application d'un champ magnétique externe. Sous un champ magnétique externe, les NP noyau-coque sont rapidement passées d'une dispersion homogène (Fig. 1c) à une solution claire et transparente (Fig. 1d).

La bande d'absorption des NP core-shell a été étudiée en utilisant la spectrométrie UV-Vis. Comme le montre la figure 1e, un pic d'absorbance est apparu à ~ 530  nm, indiquant la présence d'Au sur la surface des NP (Informations supplémentaires Fig. S2 comprend le résultat des données EDX pour Fe₃ O₄ -Au core-shell NPs). L'échantillon ayant été purifié, les résultats optiques ont démontré la formation de la structure core-shell.

Des boucles d'hystérésis magnétique ont été obtenues à partir de mesures d'échantillons vibrants pour étudier les propriétés magnétiques du Fe₃ O₄ core et les NP core-shell. Les deux NP ont montré un comportement superparamagnétique avec une coercivité proche de 0 Oe à température ambiante (Fig. 1f).

Comme indiqué dans des travaux antérieurs, la susceptibilité des NP core-shell était plus élevée que celle des NP de magnétite, ce qui pourrait être en partie dû à des effets de proximité et à des configurations spatiales uniques [41, 42]. De plus, les aimantations de saturation des NPs noyau et des NPs noyau-enveloppe sont respectivement de ~ 37 emu/g et ~ 21 emu/g à 10 kOe. La différence de Ms provient de l'existence d'un composant non magnétique (Au) dans les NP noyau-enveloppe.

Le gène VHH 5-24 K10 a été cloné dans le cadre pour produire pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 après amplification par PCR (figure 2a). La protéine recombinante a été exprimée dans E. coli BL21 qui a été transformé avec pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 après induction avec IPTG et purifié par Ni-NTA His·Bind Resin. L'anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinant a été facilement exprimé dans E. coli en tant que protéine soluble de 18 kDa. A partir d'une culture de 1 L, nous avons obtenu 1 ± 0,5 mg d'anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinant purifié.

Expression et purification de la protéine de fusion anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Le gène VHH 5-24 K10 a été cloné dans le cadre pour produire a pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 après b purification de la protéine de fusion Muc1-VHH 5-24 K10. La protéine purifiée a été séparée sur SDS-PAGE à 15 %. Échelle de protéines de la piste 1. Piste 2 protéine purifiée. c Illustration schématique des NP marquées au PEG-nanobody-dye utilisées dans cette étude

La protéine purifiée a été vérifiée par gel SDS-PAGE à 15 %. La coloration au bleu de Coomassie de la protéine purifiée a révélé qu'elle était pure à> 95 % (Fig. 2b). Le Fe₃ synthétisé O₄ -Au NPs ont été modifiés en trois étapes, à savoir la PEGylation, le marquage d'anticorps et le marquage de colorant (Fig. 2c). Après chaque étape de modification, le potentiel zêta a été mesuré pour confirmer la modification réussie. Le tableau 1 montre l'effet de la modification sur les potentiels zêta correspondants. Le potentiel zêta des NP à noyau-enveloppe nu était de − 19,8 ± 6,68  mV. La PEGylation des NPs a été réalisée en utilisant OPSS-PEG-NHS. Pour produire une série de nanocomplexes de différentes tailles, OPSS-PEG-NHS avec différentes longueurs (2 K, 5 K et 10 K) a été utilisé.

Après PEGylation, les potentiels zêta ont été réduits (- 44,9 ± 8,19 mV, - 40,7 ± 7,88 mV et - 39,6 ± 8,74 mV pour 2 K, 5 K et 10 K, respectivement).

Fait intéressant, après le marquage des nanocorps, les potentiels zêta ont clairement augmenté (− 38,5 ± 5,61 mV, − 23,3 ± 8,61 mV et − 31,8 ± 7,37 mV pour 2 K, 5 K et 10 K, respectivement).

Après le marquage au colorant, les potentiels zêta ont également augmenté (− 12,5 ± 7,25 mV, − 17,7 ± 3,94 mV et − 10,6 ± 4,72 mV pour 2, 5 et 10 K, respectivement).

Le potentiel zêta de Fe₃ nu O₄ -Au cœur-enveloppe NP était de − 19,8 ± 6,68  mV. Après PEGylation, le potentiel zêta a été réduit à près de - 40  mV. Ces résultats indiquent que les molécules de PEG étaient bien liées de manière covalente à la couche Au des NP core-shell parce que les molécules de PEG ont des groupes fonctionnels N-hydroxysuccinimide chargés négativement. Pendant ce temps, le potentiel zêta a augmenté après le marquage du colorant sur le nanocorps (− 38,5 ± 5,61 mV pour NP-PEG2 K-nanobody et − 12,5 ± 7,25  mV pour NP-PEG2 K-nanobody-dye). Ce résultat est raisonnable car le nanocorps recombinant a dix queues de lysine à l'extrémité terminale. Chaque type de nanocorps a été classé par mesure du potentiel zêta, et pour déterminer la liaison des anticorps sur le nanocorps, nous avons mesuré la fluorescence pour chaque type de nanocorps.

Comme le montre la figure 3, nous avons confirmé que tous les types de nanoparticules et de nanocorps ont une bonne absorption et internalisation cellulaire en l'absence de restrictions d'inhibiteur. Une courbe d'internalisation cellulaire a été obtenue à partir de cellules incubées en présence de 50 μg/mL de Fe₃ marqué au Cy3 O₄ -Au NPs, NPs marqués au PEG-Cy3 et NPs marqués au PEG-nanobody-Cy3 pendant différentes périodes (entre 0 et 360 min) après avoir retiré les médias, lavé les NPs libres et enfin mesuré la fluorescence totale des cellules avec du trypan bleu (Fig.3).

Photofluorescence normalisée des cellules de mucine CT26 après incubation avec 50 μg/mL a Fe₃ O₄ -Au NPs, b NPs PEGylées et NPs étiquetées PEG-nanobody, et c Fe₃ O₄ -Au NPs, nanobody-tagged NPs et vimentin-tagged NPs à 37 °C dans 5% CO₂ pour différentes périodes (10, 20, 30, 60, 120 et 360 min)

Selon le résultat de la mesure de l'intensité de fluorescence, nous pouvons déterminer que les NP ont été internalisées dans les cellules en 1hh (Fig. 3a). L'intensité de fluorescence de NP a atteint un maximum en 1 h, et l'intensité de fluorescence a progressivement diminué après avoir atteint un état stable. Même s'il existe une légère différence de temps en fonction de la présence d'Ab, l'intensité de fluorescence par temps de culture n'était pas significativement différente du résultat des NP nues (Fig. 3b). Comme le montre la figure 3c, il a été confirmé que l'effet de l'Ab, en utilisant des Ab hétérogènes de Muc1 et de la vimentine, était négligeable dans l'absorption cellulaire et l'internalisation de NP.

Avec le test WST-1, la viabilité (%) des cellules à mucine CT26 en fonction de la concentration et de la modification de surface de Fe₃ O₄ -Les NPs core-shell ont été estimées après différents temps d'exposition (Fig. 4a, b). La viabilité des cellules CT26 n'a pas montré de différences significatives après 24h et 48h d'exposition, que ce soit avec des doses variables ou après modification de surface des NPs. La viabilité cellulaire était supérieure à 90 % sur les deux Fe₃ nus O₄ -Au NPs (Fig. 4a) et les NPs à surface modifiée (Fig. 4b).

Viabilités des cellules de mucine CT26 traitées avec Fe₃ nu O₄ -Au cœur-coquille NPs et Fe₃ modifié en surface O₄ -Au NPs à différentes concentrations. un Fe₃ O₄ -Au NPs et b NPs marquées au PEG-nanobody-Cy3. Chaque graphique expérimental représente la moyenne d'une série de quatre expériences différentes

La figure 5 indique que les NP ont pénétré dans les cellules de mucine CT26 via diverses voies d'endocytose (voies médiées par la clathrine, médiées par les cavéoles et phagocytose/macropinocytose). Fait intéressant, la figure 5b montre que l'anticorps anti-Muc1 affecte également principalement l'endocytose des NP marquées au PEG-nanobody-Cy3. Pour comprendre la voie d'internalisation des NP, nous avons essayé d'inhiber les voies d'endocytose avec des inhibiteurs chimiques spécifiques (Fig. 5). Les voies de l'endocytose étaient bien connues pour être divisées en trois types :à médiation par la clathrine, à médiation par les cavéoles et la macropinocytose/phagocytose.

Photofluorescence normalisée à partir de cellules de mucine CT26 traitées avec des inhibiteurs chimiques d'endocytose pendant 1 h et incubées avec 50 μg/mL a NPs noyau-shell nu et b NPs marquées par des nanocorps à 37 °C dans 5% de CO₂ pendant 30 min. Inhibiteurs ayant un effet statistique sur l'internalisation (Student's t essai, p (*) <0,05 et p (**) <0,01) sont signalés par des astérisques noirs

Dans cette étude, des inhibiteurs ont été utilisés comme première approche pour étudier l'internalisation des nanoparticules étiquetées par des nanocorps. CPZ (inhibiteur de l'endocytose à médiation par la clathrine), nystatine (inhibiteur de l'endocytose à médiation par les caveoles), dynasore (inhibiteur de la dynamine), cytochalasine D (inhibiteur de la phagocytose/macropinocytose), BFA (destructeur de l'appareil de Golgi), monensine (inhibiteur de lysosome) ou anti-Muc1 Les Ac (compétiteur spécifique au récepteur/transporteur) ont été incubés avec les cellules pendant 1 h. La CPZ, la nystatine, le dynasore et la cytochalasine D ont affecté l'endocytose des NP (Fig. 5a).

La fraction de ciblage est la clé du succès du ciblage du cancer, qui est exceptionnellement important dans le traitement du cancer. Pour le ciblage, une modification de surface efficace est très importante pour augmenter l'efficacité thérapeutique et limiter les effets secondaires. Fe₃ étiqueté nanocorps O₄ -Les NP core-shell ont été fabriquées avec succès à partir des NP synthétisées et du nanocorps recombinant. Le tableau 1 montre clairement que chaque étape de modification a été effectuée avec succès.

La viabilité cellulaire est l'un des éléments essentiels pour l'application biologique des nanomatériaux. Les viabilités cellulaires étaient supérieures à 90 % sur les NP core-shell et les NP modifiées (Fig. 4a, b). Ces résultats impliquent que Fe₃ nu O₄ -Les NPs Au et les NPs modifiées n'ont pas causé de cytotoxicité significative dépendante de la concentration et de la modification et que les NPs modifiées étaient adaptées à une application biologique.

Les études sur l'efficacité d'internalisation et l'effet inhibiteur des NP fournissent des informations importantes pour comprendre les mécanismes par lesquels les NP pénètrent dans les cellules. Les NP pégylées ont été internalisées relativement lentement dans les cellules par rapport aux NP nues, mais les NP marquées par des nanocorps ont été internalisées dans les cellules légèrement plus rapidement que les NP nues (Fig. 3a, b). Étant donné que la PEGylation est une méthode de modification de surface bien connue pour empêcher l'internalisation des NP, la tendance à l'internalisation des NP PEGylées s'explique facilement. De plus, le nanocorps a induit l'endocytose des NP. Pour vérifier la spécificité du nanocorps, nous avons confirmé le taux d'internalisation des NP marquées par l'Ab de vimentine. Il est intéressant de noter que les NP marquées à l'Ab de la vimentine n'ont pas favorisé l'internalisation cellulaire (Fig. 3c).

Ces résultats indiquent que le nanocorps peut induire efficacement l'internalisation de nanomatériaux dans les cellules de mucine CT26 et impliquent que la tendance à l'internalisation peut être contrôlée par une modification spécifique de la membrane externe des NP. De plus, les mécanismes de l'endocytose des NP marquées par des nanocorps ont été clairement démontrés via des tests d'inhibition et l'imagerie par microscopie confocale. La photofluorescence des NP marquées par des nanocorps et des NP non marquées a montré des valeurs décroissantes similaires lorsqu'elles étaient cultivées avec du CPZ, de la nystatine ou du dynasore (Fig. 5a, b). La CPZ, la nystatine et le dynasore jouent un rôle dans l'inhibition, respectivement, de l'endocytose médiée par la clathrine, l'endocytose médiée par les cavéoles et la dynamine, qui est une grande GTPase impliquée dans le bourgeonnement et la scission des vésicules naissantes des membranes parentales. Ainsi, les valeurs de photofluorescence dans les deux cas ont diminué rapidement car la dynamine est étroitement liée à la production de vésicules pour l'endocytose médiée par la clathrine et les cavéoles. Comme le montre la figure 5a, les NP non marquées (Fig. 5a) et les nanocorps marqués (Fig. 5b) ont montré des diminutions rapides de la photofluorescence.

En particulier, les nanoparticules marquées par des nanocorps ont affiché des valeurs de photofluorescence significativement plus faibles dans CPZ, nystatine et dynasore. De plus, nous avons confirmé que les NP non marquées étaient plus fortement affectées que les NP marquées par nanocorps lorsqu'elles étaient appliquées à la cytochalasine D, qui est une toxine perméable aux cellules qui bloque la polymérisation des filaments d'actine pour la phagocytose [43]. Ces résultats impliquent que les NP non marquées ont été internalisées par de multiples mécanismes tels que l'endocytose médiée par la clathrine, l'endocytose médiée par les cavéoles et la phagocytose. Par conséquent, l'internalisation cellulaire des NP marquées par des nanocorps dépend de l'endocytose médiée par la clathrine et les cavéoles. En outre, la quantité d'absorption cellulaire des NP marquées par des nanocorps était considérablement réduite lorsque les cellules étaient cultivées avec l'anticorps Muc1 (Fig. 5b). Ce résultat indique que l'anticorps libre Muc1 joue un rôle de compétiteur du nanocorps sur les NP modifiées en se fixant à la membrane cellulaire CT26 et que l'anticorps Muc1 joue un rôle important dans l'internalisation cellulaire des NP modifiées. Particulièrement, les NP marquées par l'Ab de vimentine ont montré des différences évidentes par rapport aux NP marquées par des nanocorps en termes de capacité d'inhibition. La photofluorescence des NP marquées à la vimentine n'a pas été affectée par de multiples tests d'inhibition, indiquant que les NP étaient peu influencées par la nystatine, le dynasore, la cytochalasine D et même l'Ab Muc1. Ce phénomène pourrait être la preuve de l'efficacité de la vimentine, qui a été confirmée biochimiquement pour affecter puissamment la phagocytose [39]. Par conséquent, ce résultat indique que l'Ab Muc1 peut cibler des molécules spécifiques et contrôler l'endocytose spécifique.

Comme le montre la figure 6, des résultats analogues ont été obtenus lorsque les cellules ont été traitées avec des NP à noyau-coquille nue marquées au Cy7.5 et des NP marquées au PEG-nanobody, indiquant une absorption cellulaire similaire dans les deux cas en l'absence d'inhibition de dynasore. L'inhibition de Dynasore a induit une internalisation cellulaire nettement plus faible des NP marquées au PEG-nanobody par rapport aux NP nues (Fig. 6b, rangée du bas). Ces résultats impliquent qu'il existe deux mécanismes d'endocytose, qui sont l'endocytose non spécifique des NP nues et l'endocytose restreinte des NP marquées par des nanocorps via la molécule de dynamine. Une fois que le nanocorps se fixe à la membrane cellulaire externe, les NP marquées par le nanocorps pourraient facilement traverser la membrane cellulaire en raison de l'activation simultanée des mécanismes médiés par la clathrine et les cavéoles. Par conséquent, nous pourrions supposer que les principaux mécanismes sont à la fois l'endocytose médiée par la clathrine et les cavéoles pour l'internalisation des NP marquées par des nanocorps dans les cellules de mucine CT26.

Confocal microscopic imaging of CT26 mucin cells incubated with a Fe₃ O₄ -Au NPs and b PEG-nanobody-tagged NPs for 1 h at 37 °C in 5% CO₂ incubator, before and after dynasore inhibition (1 ng/mL)

Conclusions

Nanomaterials for cancer targeting and controllable insertion of exogenic materials such as drugs, genes, and peptides are critical advances in biomedical applications. These familiar but creative concepts can offer strategies for new therapeutic methods. In this paper, we demonstrated enhanced cellular uptake of Fe₃ O₄ -Au core-shell NPs after PEGylation with the Muc1 antibody. The main endocytosis mechanisms of nanobody-tagged NPs were demonstrated, showing the possibility of controllable specific endocytosis in colorectal cancer cells. These findings provide insight into the targeting between nanobody-tagged NPs and colorectal cancer cells to aid the design of high-efficiency targeting carriers.

Disponibilité des données et des matériaux

All data generated or analyzed during this study are included in this published article.

Abréviations

Fe₃ O₄ :

Magnetite

Au:

Gold

NP :

Nanoparticules

Ab:

Antibody

HCAbs:

Heavy-chain antibodies

VHH:

VH of the camelid HCAb

PEG:

Poly(ethylene glycol)

PPG:

Poly(propylene glycol)

PCR:

Polymerase chain reaction

TEM :

Microscopie électronique à transmission

PEO-PPO-PEO:

Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)

OPSS-PEG-NHS:

Orthopyridyl disulfide PDP PEG succinimidyl ester

BFA:

Brefeldin A

CPZ:

Chlorpromazine