L'effet photothermique synergisé BRAF de silençage génique ciblé inhibe la croissance des cellules d'hépatome à l'aide du nouveau nanosystème GAL-GNR-siBRAF

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un problème de santé mondial majeur [1]. C'est le sixième cancer le plus répandu dans le monde et la troisième cause de décès par cancer [2, 3]. La plupart des cas de CHC surviennent en Asie de l'Est et en Afrique subsaharienne. Cependant, l'incidence a augmenté dans certains pays développés, dont la France, la Grande-Bretagne, le Japon et les États-Unis [4]. Le traitement standard du CHC précoce est la résection chirurgicale de la tumeur. Après chirurgie, le taux de survie à 5 ans peut aller de 89 à 93 % [5]. Malheureusement, seul un faible pourcentage de patients atteints de CHC (environ 20 à 30 %) sont diagnostiqués à un stade précoce ; la plupart des patients atteints de CHC (> 70 %) se trouvent à un stade avancé et ne peuvent pas subir de résection chirurgicale. Les autres options de traitement comprennent la transplantation hépatique, la chimioembolisation artérielle par cathéter (TACE) et la chimiothérapie systémique [6]. Cependant, la transplantation hépatique est limitée par l'offre, et une embolisation incomplète de la TACE peut entraîner un échec du traitement, avec des effets secondaires importants de la chimiothérapie systémique et un mauvais pronostic global. Par conséquent, les nouvelles méthodes de traitement du carcinome hépatocellulaire sont très exigeantes sur le plan clinique [7].

La voie de signalisation RAS/RAF joue un rôle essentiel dans le développement du cancer du foie, et BRAF est l'un des gènes essentiels associés au cancer dans cette voie. Les altérations génétiques de ces gènes entraînent souvent deux troubles en cascade. Une activation anormale de la voie de signalisation RAS/RAF est associée à un mauvais pronostic chez les patients cancéreux [8]. BRAF est le gène le plus fréquemment muté dans la famille RAF, et le ciblage de la voie RAS/RAF est une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement du CHC [8,9,10]. Depuis que l'inhibiteur de la kinase RAF sorafenib s'est avéré utile dans le traitement du CHC, les mutations BRAF sont devenues la cible privilégiée pour le traitement du CHC [8]. Plus précisément, les mutations BRAF sont devenues une cible souhaitable pour le traitement du CHC avancé, car le développement clinique de l'inhibiteur de la kinase RAF sorafenib a été trouvé dans le traitement du CHC en Asie, en Europe et aux États-Unis [11]. Par rapport au placebo, le sorafénib a augmenté la survie globale, prolongeant la survie globale médiane des patients atteints d'un CHC avancé [12,13,14]. Cependant, le sorafénib a une faible capacité de ciblage tumoral, ce qui peut entraîner des effets secondaires indésirables tels que l'hypertension artérielle, la perte de cheveux et les nausées [15]. Les médicaments qui ciblent le cancer du foie avec une spécificité élevée et bloquent la RAF restent à explorer davantage.

Le récepteur des asialoglycoprotéines (ASGPR), également appelé récepteur hépatique du galactose, est une lectine de type C exprimée à la surface sinusoïdale des hépatocytes [16]. L'ASGPR est considérée comme une cible essentielle pour les nanostructures hépatiques car elle joue un rôle important dans la liaison, l'internalisation et l'élimination des substances avec des résidus de galactose terminaux [17]. Il a été rapporté que plusieurs monosaccharides (galactose, mannose, lactose, N-acétylgalactosamine et acide sialique) interagissent avec l'ASGPR à des degrés divers, et le galactose a montré une affinité plus élevée pour l'ASGPR [18]. Parce que l'ASGPR est fortement exposé à la surface des cellules parenchymateuses hépatiques [19], le récepteur a une forte affinité pour le galactose et les promédicaments galactosylés ou les systèmes de délivrance ciblant le foie. Les nanoparticules de galactose [20], les micelles de galactose [21] et les liposomes de galactose [22] ont été identifiés comme des systèmes médicamenteux de ciblage hépatique, qui ciblent spécifiquement les cellules carcinoïdes hépatocellulaires.

Les nanotiges d'or (GNR) sont des nanoparticules d'or en forme de tige qui présentent des avantages significatifs en tant que nanosupports [23]. Les nanotiges d'or (GNR) ont une excellente biocompatibilité et peuvent être utilisées pour une livraison stable de siRNA [24]; ils ont une grande surface spécifique, ce qui permet une modification flexible des adaptateurs spécifiques de ciblage tumoral [25]; La résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) a une efficacité de conversion photothermique élevée sous irradiation de lumière proche infrarouge et est devenue un excellent matériau anti-tumoral photothermique [26]. L'efficacité photothermique maximale peut être obtenue en ajustant le rapport d'aspect des nanotiges d'or (GNR). La toxicité in vitro et in vivo des nanoparticules d'or dépend de leur taille, de leur charge de surface et de leur revêtement de surface [27]. Cependant, le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) est un agent actif essentiel dans la synthèse des nanotiges d'or, qui présente une cytotoxicité apparente et limite les applications biologiques [28].

L'interférence ARN (ARNi) est devenue une approche prometteuse pour le traitement du cancer car elle élimine ou fait taire efficacement les gènes cibles par de petits ARN interférents (siARN) [29]. Récemment, les molécules d'ARNsi sont entrées dans la phase d'essai chez l'homme et sont considérées comme des moyens prometteurs pour traiter les cancers et les tumeurs à gènes mutants multiples [30]. Cependant, l'application de siRNA est toujours confrontée à d'énormes défis tels que l'instabilité du sérum (dégradation par les nucléases dans l'environnement extracellulaire) et les effets hors cible [31]. De plus, les siRNA sont chargés négativement, ce qui les empêche de se lier aux membranes cellulaires chargées négativement [32]. En raison de ces caractéristiques, il est peu probable que l'ARNsi lui-même soit délivré directement aux cellules. La stabilité de l'ARNsi peut être améliorée par la modification chimique de l'ARNsi ou en insérant des chargeurs d'ARNsi dans des supports protecteurs [33].

Dans cette étude, nous avons récemment construit un nanocarrier multifonctionnel GAL-GNR-siBRAF. Le système utilise des nanotiges d'or avec une capacité de génération de chaleur optique comme noyau interne et du GAL modifié de l'extérieur (d-galactose) avec un ciblage spécifique des tumeurs du foie. Ce système a réduit la toxicité biologique du CTAB à la surface des nanotiges d'or et a montré une capacité de charge élevée en siARN et peut être utilisé pour réduire efficacement le gène BRAF dans le cancer du foie. L'application de GAL-GNR-siBRAF a considérablement atténué la prolifération, l'invasion et la migration des cellules cancéreuses du foie. De plus, le GAL-GNR-siBRAF a simultanément induit le silençage génique de BRAF et des effets photothermiques qui ont atteint une efficacité synergique dans la capacité de destruction des cellules tumorales, offrant une nouvelle façon de penser pour le développement d'un traitement clinique du cancer du foie.

Matériel et méthodes

Ligne cellulaire

La lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire de souris Hepa1-6 a été achetée auprès de la Stem Cell Bank, Académie chinoise des sciences. Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) contenant 10 % de FBS à 37 °C avec 5 % de CO₂ .

Synthèse des siRNA BRAF

La séquence de l'ARNsi ciblant le gène BRAF est 5'-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3' et a été synthétisée par Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Le gène de la luciférase ciblée disponible dans le commerce siGL2 a été utilisé comme un siARN de contrôle négatif.

Synthèse de CTAB-GNR

Des nanotiges d'or solubles dans l'eau ont été synthétisées à l'aide d'une voie de croissance médiée par les graines [34]. sous>4 (0,5 µmM) (Sinopharm). Agiter la solution à 28 °C, bien mélanger et ajouter 0,12 mL de NaBH froid₄ (0,01 µM) (Sinopharm) jusqu'à ce que la solution de graines obtenue vire au brun et reste en réserve. La solution de croissance a ensuite été synthétisée comme suit :50 mL de CTAB (0,2 M) et 50 mL de HAuCl₄ (1 mM), 2,5 mL AgNO₃ (4 mM) (Sinopharm) ont été légèrement mélangés à 28°C. Après un mélange doux et minutieux, 670 L d'acide ascorbique (0,079  M) ont été ajoutés lorsque la couleur de la solution passe du jaune foncé à l'incolore. Cent vingt microlitres de la solution d'ensemencement ont été ajoutés sous agitation douce à 28°C, et la couleur est progressivement devenue transparente du violet au violet-noir. Après 24 h d'agitation à température constante, la solution a été centrifugée à 12 000  rpm pendant 10 min pour éliminer le CTAB supplémentaire et lyophilisée sous vide en poudre GNR pour une utilisation future.

Synthèse de MUA-PEI et GAL-PEI-MUA

L'acide mercaptoundécanoïque (MUA; 654 mg) a été dissous dans 30 mL de chloroforme (CHCl₃ ) puis incubée avec 100 mmoles de chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide (EDC) et 100 mmoles de N-hydroxysuccinimide (NHS) pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, 100 pmoles de polyéthylèneimine (PEI) ont été ajoutées à la solution ci-dessus. Après 24h de réaction à température ambiante, un volume égal d'eau désionisée a été utilisé pour extraire le PEI-MUA soluble dans l'eau. La même méthode a été utilisée pour compléter l'activation du d-galactose en solution aqueuse. Ensuite, un excès de d-galactose activé (500 mmol) a été ajouté à la solution PEI-MUA soluble dans l'eau ci-dessus, et la réaction a été suffisamment effectuée à température ambiante pendant 24  h pour obtenir un GAL-PEI-MUA soluble dans l'eau. complexe.

Synthèse de GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) et PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

La poudre CTAB-GNR lyophilisée (10 mg) a été mise en suspension dans 10 mL de complexes PEI-MUA ou GAL-PEI-MUA solubles dans l'eau. CTAB a été remplacé par une liaison Au-S lorsqu'il a été agité à température ambiante pendant 24 h. La solution a été centrifugée à 12 000 rpm pendant 15 min pour éliminer l'excès de surnageant, et le précipité a été lavé trois fois avec de l'eau distillée. Les poudres PEI-GNR ou GAL-GNR ont été préparées par lyophilisation, pesées et dissoutes dans de l'eau sans ribozyme, puis l'effet de résonance plasmatique a été observé par un analyseur enzymatique multifonctionnel (Spectra Max M5e, MD, USA).

Microscopie électronique à transmission

Le GNR ou GAL-GNR a été mis en suspension dans de l'eau distillée, et la remise en suspension a été placée sur une grille en cuivre. Après que les échantillons sur le treillis de cuivre aient été soigneusement séchés à l'air pendant 30 min, le treillis de cuivre a été imagé à l'aide d'un microscope électronique à transmission (LIBRA 120, Carl Zeiss, Allemagne).

Analyse Ultraviolet-Visible

Le GNR, PEI-GNR ou GAL-GNR a été mis en suspension dans de l'eau distillée. L'effet de résonance plasmonique de surface des nanomatériaux dans la gamme de longueurs d'onde de 600 à 900  nm a été examiné à l'aide d'un lecteur de microplaques multifonction (SpectraMax M5e, MD, États-Unis).

Analyse du potentiel Zeta et du diamètre hydrodynamique

Le GNR, PEI-GNR ou GAL-GNR a été mis en suspension dans de l'eau distillée, puis le potentiel zêta et le diamètre hydrodynamique du nanomatériau ont été mesurés sur un Zetasizer Nano ZS.

Analyse par résonance magnétique nucléaire

La poudre lyophilisée GAL-GNR a été dissoute dans de l'eau lourde (99 %, Sigma) pour former une suspension homogène, et la suspension a ensuite été transférée dans un tube à échantillon RMN. La composition de GAL-GNR a été déterminée par résonance magnétique nucléaire (RMN) (Bruker, 600mhz, Allemagne).

Dosage Gel Shift

GAL-GNR et siBRAF ont été mélangés selon le rapport de masse (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1). Après incubation à température ambiante pendant 30 min, le tampon de charge d'ADN a été ajouté au mélange. Tous les échantillons ont été ajoutés à un gel d'agarose à 2 % contenant 0,01 % de Goldview (Bioshop, USA) puis soumis à une électrophorèse à 90 V pendant 30 min. Le degré d'enveloppement du siBRAF a été visualisé sur le système d'imagerie sur gel.

Stabilité du siRNA dans le sérum

Le mélange GAL-GNR-siBRAF (6:1) a été incubé dans du sérum murin frais à 37 °C pendant 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h et 48 h respectivement. Le groupe siBRAF nu plus sérum murin frais a été traité dans les mêmes conditions. Un volume égal de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 2 % a été ajouté à la solution de GAL-GNR-siBRAF. Après incubation pendant 30 min à température ambiante, un tampon de chargement d'ADN a été ajouté et tous les échantillons ont été chargés sur un gel d'agarose à 2% (contenant 0,02% de Goldview (Bioshop, USA)) et soumis à une électrophorèse à 90 V pendant 30 min. La luminosité de la bande du siBRAF a été visualisée sur un système d'imagerie sur gel.

Test d'inhibition compétitif de GAL-GNR-siBRAF

2 × 10 ⁵ Les cellules Hepa1-6 ont été cultivées dans des microplaques à 12 puits pendant la nuit. Ensuite, les cellules ont été prétraitées par de l'acide lactobionique pendant 12h puis transfectées avec du GAL-GNR-siBRAF (marqué au Cy3) pendant 30min. L'intensité de fluorescence intracellulaire a été déterminée au microscope à fluorescence (barre d'échelle =200 μm).

Capacité d'administration ciblée sur le cancer du foie de GAL-GNR-siBRAF

Un microgramme de siBRAF marqué au cy3 a été incubé avec PEI-GNR (30 g/mL), GAL-GNR (30 g/mL) pendant 20 min à température ambiante, puis ajouté au milieu des cellules Hepa1-6. Après incubation pendant 30 min, les cellules ont été lavées trois fois avec 50 % de FBS et l'intensité de fluorescence dans les cellules a été mesurée sous un microscope à fluorescence.

Effets photothermiques

Vingt, 40, 60, 80 et 100 g de GAL-GNR et 100  μg de poudre lyophilisée GNR ont été soigneusement dissous dans 1 mL d'eau distillée. La solution a été ajoutée à une plaque de 24 puits et irradiée en continu avec une source laser proche infrarouge de 803 nm (2 W/cm ² ) pendant 15 min. La température de chaque groupe a été enregistrée avec un thermomètre infrarouge toutes les 0,5 min pendant les 5 min premières, puis la température a été marquée toutes les 1 min.

Dosage MTT

Deux cents microlitres de cellules (3,5 × 10 ⁴ /mL) a été cultivée en microplaques 96 puits pendant 24 h puis cultivée avec différentes concentrations de GNR ou GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/mL). Après 24 ou 48 h d'incubation, 20 L de MTT ont été ajoutés au système de culture et incubés pendant 4 h supplémentaires. Les cristaux violets ont été dissous dans 150 μL de DMSO, suivi d'une analyse spectrophotométrique à 490 nm en utilisant une référence de 650 nm dans un lecteur de microplaques (SpectraMax M5e, MD, USA).

Test de coloration Calcein-AM et PI

Cellules Hepa1-6 (1,5 × 10 ⁵ ) ont été conservés une nuit dans une plaque 12 puits et traités avec PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg), GAL-GNR-siGL2 (30 μg/mL:1 μg) + laser ou GAL -GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg) + laser pendant 4 h, puis irradié en lumière proche infrarouge (808 nm, 2 W/cm ² ) pendant 15 min. La cytotoxicité de GAL-GNR a été détectée par des expériences de coloration calcéine-AM (cellules vivantes) et PI (cellules mortes). La fluorescence verte de la calcéine-AM et la fluorescence rouge du PI ont été photographiées en microscopie à fluorescence.

PCR quantitative en temps réel

L'ARN cellulaire total a été extrait à l'aide de Trizol (réactif Trizol, Invitrogen) et utilisé comme matrice pour la synthèse d'ADNc. La Q-PCR a été réalisée à l'aide d'amorces directes et inverses spécifiques d'un gène (0,5 µL × 10 µM chacune) dans le système Stratagene Mx3000P qRT-PCR (Agilent Technologies, Lexington, MA, États-Unis). Le SYBR green PCR MasterMix (Life Technologies) a été utilisé selon le schéma du fabricant. Le gène de ménage β-actine a été utilisé comme référence interne. Les séquences d'amorces étaient la -actine :5'AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3' (en avant) et 5'ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3' (en arrière); BRAF :5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (en avant) et 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (en arrière). La différence d'expression génique a été calculée et affichée par 2 ^−∆∆Ct méthode.

Western Blot

Les protéines totales des cellules Hepa1-6 ont été obtenues par tampon RIPA (Cell signalisation, Pickering, Ontario, Canada) et quantifiées par l'acide bicinchoninique (BCA). La protéine a été séparée dans 12% de SDS-PAGE et transférée dans du fluorure de polyvinylidène (PVDF). Le gène domestique β-actine a été utilisé comme référence interne pour détecter l'expression de la protéine BRAF. La bande de protéine et la référence interne de la protéine cible ont été détectées par chimiluminescence ECL.

Test de grattage

Le Hepa1-6 transfecté (1,7 × 10 ⁵ /mL) les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits pendant la nuit. Les cellules qui adhéraient complètement à la plaque ont été grattées avec une pointe de pipette de 10 L. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et remplacées par un milieu contenant 2 % de FBS. La moyenne de la ligne de plaie a été observée au microscope après 0, 24 et 48 h. Chaque scratch test a été réalisé en triple.

Test de Transwell pour la migration et l'invasion

Des chambres transwell de huit micromètres (Corning Life Science) ont été utilisées pour évaluer la migration et l'invasion des cellules. Hepa1-6 en suspension dans 200 μL de milieu sans sérum a été ajouté aux chambres supérieures à une densité de 1,7 × 10 ⁵ mL de cellules/puits, puis 500  μL de milieu contenant 12% de FBS ont été ajoutés à la chambre inférieure. Après une incubation de 24 à 48 h, les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min, puis les cellules ont été colorées avec une solution de cristal violet à 1 % pendant 30 min. Enfin, les cellules ont été photographiées et comptées au microscope inversé. Pour le test d'invasion cellulaire, les expériences d'invasion cellulaire nécessitent un revêtement de gel ECM, et les étapes restantes sont cohérentes.

Statistiques

Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Les données ont été exprimées en moyenne ± SD et en t de Student test (bilatéral) pour déterminer la différence entre les deux méthodes. Un test ANOVA à un facteur a été utilisé pour la comparaison de plusieurs groupes. Les données ont été considérées comme statistiquement significatives à p <0,05 (*p <0,05, ***i>p <0,01, ****p <0,001).

Résultats

Synthèse et Caractérisation du Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF

Nous avons conçu un nouveau nanocarrier GAL-GNR capable de fournir de petits ARN interférents (ARNsi) aux cellules hépatiques et de maintenir simultanément l'effet photothermique des nanotiges d'or. La procédure de synthèse de GAL-GNR est illustrée dans le schéma 1. Ce système ciblé sur le foie contient trois composants fonctionnels. Premièrement, la partie de base de GAL-GNR est un squelette GNR, qui mesure environ 30 nm de long et 10  nm de diamètre, comme le montre l'image MET (Fig. 1a) et le GNR chimiquement conjugué (GAL-GNR) n'a montré aucun signe significatif. changement dimensionnel et possédait toujours une bonne dispersibilité (Fig. 1b). Les données de la taille des particules ont montré que la taille moyenne de GNR était de 30,23 nm, ce qui était cohérent avec les résultats de la microscopie électronique, et la taille de GAL-GNR (50  nm) et PEI-GNR (42,35 nm) était plus grande que GNR depuis la conjugaison de GAL et de PEI a augmenté l'hydratation entre les particules (Fig. 1c). Deuxièmement, le CTAB biologiquement toxique à la surface du GNR a été remplacé par du MUA-PEI chargé positivement qui peut être chargé avec un siARN chargé négativement. La mesure du potentiel zêta a montré que la charge de surface du GNR augmentait de 35,6 à 42,7 mV ou 41,8 mV lorsque les GNR étaient respectivement modifiés avec PEI ou GAL-PEI, indiquant que GAL-GNR possédait une forte capacité à se lier aux siARN (Fig. 1d). Troisièmement, nous avons appliqué la GAL en tant que molécule guide pour conjuguer les nanocarriers GNR, qui peuvent être utilisés pour le homing spécifique du carcinome hépatocellulaire. La spectroscopie d'absorption UV-Vis a été utilisée pour détecter la structure du GNR modifié de manière préliminaire. La longueur d'onde initiale du spectre d'absorption du GNR non modifié était de 763  nm; un décalage de 7 nm de longueur d'onde a été observé initialement avec la modification MUA-PEI, et un autre décalage de 8 nm a été observé à la fin de la synthèse, lorsque la modification de GNR avec GAL a réussi (Fig. 1e). Afin de confirmer la GAL dans le nano-système, une image RMN a été utilisée pour analyser les groupes chimiques. Les résultats ont montré que le signal H du galactose n'était trouvé que dans le spectre GAL-GNR sur le spectre d'hydrogène RMN, qui était :3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53. Les spectres RMN ont confirmé la structure chimique de la GAL, dans laquelle la GAL a été conjuguée avec succès à la surface du GNR (Fig. 1f).

Procédure de synthèse GAL-GNR. un Le procédé de synthèse de MUA-PEI. b Activation du d-galactose et réaction chimique avec le MUA-PEI. c Le produit synthétique final de GAL-GNR

Caractérisation de GNR et GAL-GNR. un Micrographie MET de GNR (échelle =0,5 μm/50 nm). b Micrographie MET de GAL-GNR (échelle =0.5 μm /50 nm). c Analyse granulométrique de différents GNR modifiés. d Analyse du potentiel zêta de différents GNR modifiés (GAL-GNR). e Spectres d'absorption UV-Vis normalisés de différents GNR modifiés et de l'eau. f Spectres d'absorbance RMN du GAL-GNR

Capacité d'encapsulation d'ARNi et stabilité de GAL-GNR

Le nano-squelette GAL-GNR a été modifié par du PEI chargé positivement, qui peut être combiné avec des siARN chargés négativement par interaction électrostatique. Nous avons utilisé un test de décalage sur gel pour évaluer la capacité de liaison de l'ARNsi de GAL-GNR. Le siRNA libre peut se déplacer le long du passage du gel tandis que le siRNA lié est ralenti ou totalement arrêté. De plus, l'ARNsi lié ne se liera plus efficacement au bromure et, par conséquent, l'intensité de fluorescence diminuera en conséquence. Le résultat de l'électrophorèse sur gel a montré que le rapport optimal pour saturer GAL-GNR avec siBRAF est de 6:1 (p/p) (Fig. 2a).

Essais de décalage de gel. un Capacité de charge siRNA de GAL-GNR. Un microgramme de siRNA a été mélangé en volumes égaux avec différents rapports de masse de GAL-GNR. Après incubation pendant 30 min, un test de migration sur gel a été utilisé pour évaluer la capacité de chargement de l'ARNsi de GAL-GNR. b Stabilité des siRNA dans le sérum de souris. Un microgramme de siRNA BARF a été inoculé avec le GAL-GNR au rapport de masse de 1:6 et a ensuite été ajouté à du sérum murin frais. Après réaction de 0, 3, 6, 12, 24 et 48 h à 37 °C, les siRNA de GAL-GNR-siBARF ont été extraits par 2% de SDS et ont été visualisés avec du bromure d'éthidium

Le siRNA nu est très dégradable, surtout in vivo. Une fonction importante du système d'administration est de protéger l'ARNsi de la dégradation. Ainsi, nous avons testé l'effet protecteur du nanocarrier GAL-GNR sur le siRNA dans du sérum frais en conséquence. Par rapport à l'ARNsi nu, l'ARNsi lié a été stocké dans le sérum pendant de plus longues périodes. Comme le montre la figure 2b, l'ARNsi nu pouvait exister dans le sérum jusqu'à 12 h alors que l'ARNsi lié était encore abondant après 48 h. Le résultat a démontré que la GAL-GNR peut empêcher efficacement la dégradation des siARN dans le sérum, assurant une livraison ciblée in vivo.

Cytotoxicité des nanomatériaux

La faible toxicité biologique est une autre propriété importante des nanomatériaux, ce qui leur permet d'être utilisés dans le traitement du cancer. Pour évaluer la biocompatibilité de cette nouvelle nanostructure GAL-GNR, nous avons testé sa cytotoxicité. Comme le montre la figure 3, des cellules mortes de Hepa1-6 dans le groupe traité par GNR non modifié ont été observées initialement à une faible concentration de 30 g/mL. Après incubation avec 75  μg/mL de GNR pendant 24 h, le taux de mortalité cellulaire atteignait 56,09 % et la mortalité augmentait à 75,5 % après incubation pendant 48 h. Au contraire, la modification de GAL réduisait significativement la cytotoxicité. Après incubation du GAL-GNR pendant 48 h, plus de 80% des cellules étaient encore en vie même à haute concentration (105  μg/mL). Ces données suggèrent que le nanosupport GAL-GNR a une biocompatibilité élevée par rapport au GNR, garantissant la sécurité d'application.

Toxicité de GAL-GNR. Les cellules Hepa1-6 ont été traitées par GNR (CTAB-GNR) ou GAL-GNR pendant 24 ou 48h aux concentrations indiquées. La viabilité cellulaire a été mesurée par dosage MTT (n =5)

Livraison ciblée sur les cellules d'hépatome de siRNA et silençage génique de BRAF in vitro

La capacité à délivrer des siARN dans les cellules cancéreuses est l'une des fonctions les plus importantes des nanomatériaux. Pour étudier le potentiel de GAL-GNR dans la livraison de siRNA, nous avons détecté l'efficacité de l'inactivation génique à l'aide de siBRAF chargé par GAL-GNR dans les cellules Hepa1-6. Par rapport au groupe blanc, l'expression de BRAF dans les cellules transfectées GAL-GNR-siGL2 (contrôle négatif) n'a pas changé alors que les cellules transfectées avec GAL-GNR-siBRAF présentaient une diminution significative (Fig. 4a). De plus, l'effet de silençage était dose-dépendant, ce qui est corrélé à l'augmentation de la concentration de GAL-GNR. Les résultats qPCR ont démontré que la concentration transfectée idéale de GAL-GNR-siBRAF était de 30 g/mL, et l'efficacité de silençage peut atteindre 90,29%, ce qui était similaire au groupe de lipofectamine 2000 (contrôle positif). Le résultat du western blot était cohérent avec la qPCR, et l'expression protéique de BRAF a été régulée à la baisse après 48 h de transfection (Fig. 4b).

Livraison de siARN ciblée sur les cellules d'hépatome et silençage génique de BRAF in vitro. un L'ARNm de l'expression de BRAF après transfection GAL-GNR-siBRAF. Des cellules Hepa1-6 ont été transfectées avec différentes concentrations de GA-GNR portant la même quantité de siRNA BRAF (1µg) pendant 24µh. L'expression de l'ARNm de BRAF a été déterminée par qPCR. La barre d'erreur représente l'écart type de trois expériences (***p <0,001). b L'expression protéique de BRAF dans Hepa1-6 après transfection GAL-GNR-siBRAF. Des cellules Hepa1-6 ont été transfectées avec GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 ou PBS pendant 48h, les niveaux de BRAF et de -actine ont été déterminés par Western blot. c et d Capacité d'administration ciblée sur le cancer du foie de GAL-GNR-siBRAF. Un microgramme de siBRAF marqué au cy3 a été incubé avec lip2000, PEI-GNR (30 g/mL), GAL-GNR (30 g/mL) pendant 20 min à température ambiante, puis ajouté au milieu des cellules Hepa1-6. Pour le test d'inhibition compétitive, les cellules Hepa1-6 ont été prétraitées avec de l'acide lactobionique pendant la nuit. L'intensité de fluorescence intracellulaire a été observée au microscope à fluorescence (barre d'échelle =200 µm), et les expressions d'ARNm de BRAF ont été quantifiées par q-PCR. La barre d'erreur représente l'écart type de trois expériences (*p <0,05)

L'acide lactobionique a une structure similaire à celle de la GAL qui peut être combinée de manière compétitive avec le récepteur des asialoglycoprotéines (ASGPR) qui est exprimé à la surface de la membrane cellulaire du carcinome hépatocellulaire [35]. Pour confirmer l'efficacité de ciblage spécifique de GAL-GNR, des cellules Hepa1-6 ont été pré-incubées avec de l'acide lactobionique puis transfectées avec GAL-GNR-siBRAF. Des cellules non traitées ont été utilisées comme contrôle à blanc, et le réactif de transfection classique lipofectamine 2000 a été utilisé comme contrôle positif. Comme le montre la figure 4c, l'intensité de fluorescence rouge des cellules transfectées par GAL-GNR était similaire à celle du groupe témoin positif, tandis que l'intensité de fluorescence des cellules transfectées par PEI-GNR est significativement réduite. D'autre part, les cellules transfectées avec GAL-GNR-siBRAF seul ont été observées avec une fluorescence rouge de Cy3 plus forte que les cellules Hepa1-6 prétraitées avec de l'acide lactobionique (Fig. 4c), et le résultat de la qPCR était cohérent avec celui des résultats de fluorescence rouge ( 4d). Ces résultats ont en outre illustré que la GAL favorisait efficacement l'endocytose de l'ARNsi par les cellules Hepa1-6 et peut être appliquée en tant que fraction ciblée du CHC.

L'impact de GAL-GNR-siBRAF sur la prolifération, la migration et l'invasion des cellules Hepa1-6

BRAF joue un rôle important dans la voie MAPK, qui est responsable de la régulation de la prolifération, de la migration et de l'invasion cellulaires [36]. Pour évaluer l'impact de GAL-GNR-siBRAF sur les cellules de carcinome hépatocellulaire, nous avons d'abord analysé la prolifération cellulaire par des tests MTT. Comme le montre la figure 5a, la prolifération des cellules hepa1-6 transfectées par GAL-GNR-siBRAF était significativement diminuée par rapport aux cellules GAL-GNR-siGL2 (témoin négatif) ou traitées au PBS. Ensuite, nous avons étudié l'effet de GAL-GNR-siBRAF sur la migration cellulaire par des tests scratch et transwell. Compared with negative control cells, the migration ability of Hepa1-6 cells that transfected with GAL-GNR-siBRAF was evidently reduced (Fig. 5b–d).

The impact of silencing BRAF gene on Hepa1-6 cells by GAL-GNR-siBRAF. un Proliferation of Hepa1-6 Cells. Hepa1-6 cells were transfected with GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, or PBS, and the cell proliferation was measured by MTT assay (n =5). The error bar represents the standard deviation of three experiments (*p <0,05). b Scratch test of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above and then scraped with a 10 μL tip. The cell scratch images were taken at different time points (scale bar =200 μm). c et e Migration and invasion of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above. Cell migration and invasion ability was determined by transwell assay, and imagines were taken at different time points (scale bar =200 μm). d et f Columnar statistical analysis of cell migration and invasive capacity (***p <0.001)

To further investigate the potential of GAL-GNR-siBRAF on the invasion, transwell assays were performed. The results showed that hepa1-6 cells transfected with GAL-GNR-siBRAF haven significantly decreased the invasion of Hepal-6, as compared with GAL-GNR-siGL2 or PBS (Fig. 5e and f). The above results implied that knockdown of BRAF gene using GAL-GNR-siBRAF complexes can effectively reduce migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

Combination Treatment with Photothermal Effect and Gene Silencing of GAL-GNR-siBRAF

Our previous studies have demonstrated that gold nanomaterials can generate thermal energy under near infrared radiation [37]; this phenomenon is called photothermal effect due to LSPR properties of the GNR. Our results showed that, with the increase of GAL-GNR concentration, the heat production capacity of GAL-GNR was enhanced. When the concentration of GAL-GNR is 100 μg/mL, the temperature quickly rises from 24 to over 60 °C. In addition, there was no significant difference in heat production capacity between GNR and GAL-GNR (Fig. 6a).

Photothermal effect induced by GAL-GNR and combination treatment of photothermal effect and gene silencing on liver cancer cells. un 803 nm near-infrared laser source (2 W/cm ² ) was used to irradiate the solution of GNR, GAL-GNR, or distilled water (blank control) for 15 min. The temperature was detected by infrared thermometer at different time point. b Hepa1-6 cells were treated with PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Laser, or GAL-GNR-siBRAF + Laser, respectively. Green fluorescence of calcein AM (live cells) and red fluorescence of PI (dead cells) were observed under fluorescence microscope

The novel nano-system GAL-GNR-siBRAF possesses three individual characteristics:specific targeting of liver cancer, siRNA-based gene silencing of BRAF, and GNR-offered photothermal effects. Thus, we further study the synergistic therapeutic effect of GAL-GNR-siBRAF in anti-tumor treatment. Hepa1-6 cells without GAL-GNR kept higher viability even under near infrared radiation, suggesting laser itself had no significant effect on tumor cells. Once the laser irradiation was carried out on the basis of GAL-GNR-siGL2 treatment, the photothermal effect showed powerful killing ability on Hepa1-6 cells. Although BRAF gene silencing alone induced cell death, the effect was not conclusive. The treatment of cells with the nano-material GAL-GNR-siGL2 plus laser irradiation resulted in much stronger cell-killing ability than BRAF gene silencing individual (Fig. 6b). These data indicates that the BRAF gene silencing and photothermal effect can synergistically increase the potential of killing tumor cells.

Discussion

Difficulties in tumor-targeted delivery are major obstacles in the clinical treatment of tumors. This study demonstrated for the first time that we have developed a novel multifunctional nanocarrier GAL-GNR-siBRAF, and it was provided with many advantages. The modified GAL-GNR not only possessed good biocompatibility but also maintained the LSPR phenomena of GNR skeleton and still has excellent photothermal conversion ability. GNR modified with GAL can home hepatocellular carcinoma cells through ASGPR, which has great potential in targeted molecular therapy of hepatocellular carcinoma. Further studies showed that BRAF gene silencing inhibited the proliferation, migration, and invasion of hepatoma cells. It is worth noting that GAL-GNR-siBRAF shows a stronger cell killing ability in the combination of photothermal effect and gene silencing of BRAF.

RNA interference (RNAi) has attracted much attention due to its crucial role in gene expression and regulation. Using siRNA to knock down sequence-specific genes in cancer cells for gene therapy is an effective and specific targeted gene therapy, and which has become a new therapeutic tool for many diseases including cancer [29, 31]. However, low stability in serum and poor cell uptake limit siRNA in clinical application [38]. On the other hand, siRNA possess negative charge that prevents it from binding negatively charged cell membranes, and siRNA itself is unlikely to be delivered directly into cells [32, 39]. In addition, there are problems associated with low transfection efficiency and poor cell internalization in siRNA therapy [40]. These barriers impede the delivery of siRNA to target cells. To enhance siRNA stability and to strengthen gene silencing efficacy, we synthesized a novel nanocarrier, GAL-GNR-siBRAF, which includes three components (Scheme 1). This nanocarrier has low molecular size (about 30-nm longitude and 10-nm diameter) and good dispersibility (Fig. 1). Additionally, GAL-GNR-siBRAF could effectively load large amount of siRNA at low concentration (Fig. 2a) and protect siRNA degradation from RNase in serum; the siRNA was evidenced by stability for at least two days at 37 °C in the presence of fresh murine serum (Fig. 2b).

Good biocompatibility is essential for nanomaterials used in the field of biotherapy. CTAB is an essential active reagent in the synthesis of gold nanorods although it has apparent cytotoxicity that limits its biological application [41]. In order to reduce the cytotoxicity of the material, we manipulated the GNR by external modification of positive charge PEI and targeting adaptor GAL (d-galactose). Our results showed that, compared with unfunctionalized GNR, GAL-modified GNR has a better biocompatibility. The cell viabilities maintained over 80% even at very high concentrations (105 μg/mL) of GAL-GNR for 48 h (Fig. 3). In addition, the small molecular size and cylindrical shape of the nanorod facilitate its penetration through the cell membrane into the cell [37, 38, 42]. This phenomenon is particularly evident in targeted therapy of cancer cells. Nano-construct modified with the galactose-targeting moieties resulted in high accumulation of GAL-GNR-siBRAF in tumor cells, inducing effective downregulation of BRAF gene expression (Fig. 4). Moreover, according to the competitive inhibition experiments, we found that GAL-GNR entered cells mainly through ASGPR surface receptors of Hepa1-6 cells (Fig. 4c).

It was reported that HCC with high expression of BRAF and RAF1 tends to have rapid proliferation and growth [41, 43, 44]. B-Raf and Raf1 mainly act on the downstream of ERK/MAPK pathway, regulating nuclear factors through cascade amplification. Activation of this pathway accelerates the proliferation and differentiation of HCC cells abnormally [41, 44, 45]. RAF gene can also promote the expression of matrix metalloproteinases (MMPs), which can change the adhesion of tumor cells, degrade extracellular matrix (ECM) and basement membrane, and promote the invasion and metastasis of tumors [44, 45]. BRAF kinase regulates the RAS-RAF-MEK-ERK pathway, which promotes tumor cell proliferation, invasion and metastasis, and allows cell death through apoptosis [5, 46, 47]. In previous work, we found that BRAF gene was highly expressed in Hepa1-6 cells (data were not shown). It is speculated that the knock down of BRAF expression in Hepa1-6 will block the RAS-RAF-MEK-ERK pathway and lead biological changes of Hepa1-6. To verify our hypothesis, we transfected hepatocellular carcinoma cells with GAL-GNR-siBRAF and found that it can restrain the cell proliferation, migration, and invasion significantly (Fig. 5), providing a new strategy for clinical treatment of hepatocellular carcinoma.

Another important advantage of GNR is that it possesses local surface plasmon resonance (LSPR), which can convert absorbed light energy into heat energy under near infrared light irradiation, thereby killing and destroying cells [42]. Then, we explored the light-to-heat conversion ability of GAL-GNR, and the results showed that the modified GAL-GNR can induce heat energy effectively under the irradiation of near infrared light (Fig. 6a). Next, we further investigated the synergistic effects of GAL-GNR-siBRAF. Whereas BRAF gene silencing showed limited cytotoxicity, the treatment of GAL-GNR-siGL2 + laser had a much stronger killing ability on tumor cells. At the same time, the combination of photothermal hyperthermia and BRAF gene silencing could cause more than 85% cell death (Fig. 6b) which indicates that the synergy of GAL-GNR-siBRAF and photothermal effects could be an ideal strategy to inhibit liver cancer.

Conclusion

This study showed that GAL-GNR-siBRAF overcome the obstacle of siRNA degradation, effectively increased the stability of siRNA in serum in vitro. In addition, GAL-GNR-siBRAF can target deliver siRNA to hepatocellular carcinoma cells and knockdown the expression of BRAF and inhibit the cell proliferation, invasion, and migration significantly. More importantly, GAL-GNR-siBRAF, as a new multifunctional nanocarrier, can greatly enhance the ability of killing tumor cells when combined with near-infrared light. In conclusion, GAL-GNR-siBRAF has great potential in treatment of hepatocellular carcinoma and provides new ideas for clinical application of liver cancer.

Disponibilité des données et des matériaux

All data generated and materials used in this study are included in the manuscript and corresponding additional files.

Abréviations

GAL:

d-galactose

GNR:

Golden nanorods

siBRAF:

Small interfering RNA specific for BRAF

HCC :

Carcinome hépatocellulaire

ASGPR:

Asialoglycoprotein receptor

TACE:

Transcatheter arterial chemoembolization

LSPR :

Résonance plasmonique de surface localisée

CTAB :

cetyltrimethylammonium bromide

MUA:

Mercaptoundecanoic acid

EDC :

1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride

NHS :

N-hydroxysuccinimide

Île-du-Prince-Édouard :

Polyéthylèneimine

TEM :

Microscopie électronique à transmission

NMR:

Nuclear magnetic resonance

FBS :

Sérum fœtal bovin

DMSO :

Dimethyl Sulfoxide

BCA:

Bicinchoninic acid

PVDF :

Fluorure de polyvinylidène