Un groupe de complexes basés sur PAMAM et Quantum Dots utilisés dans les immunoessais cliniques

Introduction

Les points quantiques (QD) sont largement utilisés comme luminaires en raison de leurs rendements quantiques de fluorescence élevés, de leur photostabilité élevée et de leurs faibles propriétés de photoblanchiment. Ils sont également largement utilisés comme fluorophores organiques dans l'imagerie cellulaire et les applications biotechnologiques. En particulier, les QD contenant du cadmium (c. Par conséquent, les QD conjugués à des anticorps sont les sondes les plus prometteuses pour l'imagerie moléculaire.

Le dendrimère polyamidoamine (PAMAM), l'une des macromolécules dendritiques les plus étudiées et les plus étudiées, présente les caractéristiques suivantes :un grand nombre de groupes fonctionnels de surface, un grand nombre de cavités à l'intérieur des molécules, une taille nanométrique et une biocompatibilité élevée. Lorsqu'ils sont conjugués à des médicaments et des anticorps, ces dendrimères peuvent améliorer la solubilité et la circulation systémique d'un médicament, mais n'entravent pas l'activité biologique du médicament [3]. Par conséquent, les anticorps modifiés avec PAMAM sont souvent utilisés dans l'immunisation clinique.

Les immunoessais cliniques comprennent de nombreuses méthodes, telles que WB, ELISA, IHC (immunohistochimie), ICC (immunocytochimie) et FCM (cytométrie en flux). Parmi eux, le FCM utilisant des sondes d'anticorps spécifiques effectue une analyse rapide d'une cellule unique ou d'autres particules biologiques au niveau cellulaire et moléculaire. Par conséquent, le FCM est l'un des dosages immunologiques les plus largement utilisés. Si un criblage cellulaire est réalisé, l'utilisation de la sonde anticorps correspondante est suffisante; Cependant, si le criblage de petites molécules biologiques est souhaité, comme celui d'une petite protéine, d'un virus ou d'une cytokine, la méthode CBA (cytometric bead array) doit être adoptée car la FCM ne peut pas détecter directement les petites cytokines. La méthode CBA utilise des billes marquées par un colorant construites avec des anticorps de capture spécifiques sur la surface. Lorsque des billes de CBA sont mélangées à l'échantillon et aux anticorps marqués par colorant correspondants, des complexes sandwich se forment comme dans ELISA, et le petit antigène peut être détecté par FCM.

Dans cette étude, nous présentons un groupe de complexes comprenant une IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à PAMAM et une IgG de chèvre anti-souris conjuguée à QDs. Ce groupe de complexes peut être utilisé pour le FCM, l'ICC et l'IHC. Lorsque l'anti-antigène de lapin et l'anti-antigène de souris sont ajoutés, l'antigène correspondant sera détecté. Ce modèle peut détecter de nombreux types d'antigènes, y compris de petites protéines, des virus et des cytokines lorsque les anticorps de souris et de lapin correspondants sont présents. Le schéma 1 montre les complexes utilisés dans le FCM, nous prenons HSP27 comme exemple. HSP27 est également connue sous le nom de HSPB1 (famille de protéines de choc thermique B numéro 1) et c'est une protéine importante impliquée dans la résistance aux médicaments, la croissance cellulaire, l'apoptose, l'apparition de tumeurs et les métastases, etc. [4, 5]. Dans ce modèle, l'IgG anti-lapin de chèvre conjuguée à PAMAM agit comme un support et une capture, similaire aux billes CBA (cytometric bead array), permettant aux petites molécules d'antigènes d'être détectées par FCM. L'IgG anti-souris de chèvre conjuguée à QDs agit comme une sonde fluorescente. Si les antigènes sont des protéines membranaires ou des protéines intracellulaires, nous pouvons utiliser la méthode FCM traditionnelle pour détecter les antigènes. Nous avons seulement besoin d'ajouter les QD et non la fraction PAMAM. Pour les protéines intracellulaires et les protéines membranaires, les cellules peuvent être considérées comme des cibles pouvant être directement détectées par la méthode FCM; ils n'ont pas besoin du fragment PAMAM pour constituer une pseudocellule. Par conséquent, nous pouvons diviser les complexes et les utiliser individuellement.

Représentation de la façon dont les complexes sont formés et utilisés par le FCM pour détecter HSP27. Premièrement, l'amino PAMAM G5 doit réagir avec l'anhydride succinique pour former du PAMAM neutre

Résultats et discussion

Le groupe de complexes comprend deux parties, une partie PAMAM et une partie QDs. La partie PAMAM est une IgG anti-lapin de chèvre conjuguée à PAMAM. Nous avons utilisé des dendrimères PAMAM à terminaison amino de cinquième génération (G5 PAMAM) comme agent stabilisant de surface pour fournir des caractéristiques de solubilité idéales pour les environnements aqueux, mais ce dendrimère a une forte charge positive qui est nocive pour la liaison des anticorps. Pour neutraliser la charge positive, nous avons dissous PAMAM dans du DMSO et ajouté de l'anhydride succinique (dihydro-2,5-dicetotetrahydrofuran) pour neutraliser le groupe aminé PAMAM. Le groupe amino dans PAMAM réagit avec l'anhydride succinique pour former des liaisons amide [6,7,8,9,10]. Après la réaction, le produit a été dialysé, lyophilisé, pesé et redissous, la production est presque neutre et nous avons nommé le produit « N-PAMAM », qui est capable de se conjuguer avec les IgG anti-lapin de chèvre. PAMAM, en particulier G5 PAMAM, contient un grand nombre de cavités, et les IgG peuvent être encapsulées dans les espaces vides de G5 PAMAM [11]. L'IgG de chèvre anti-lapin a d'abord été dissoute dans du tampon MES (0,1 mol/L, pH 6,0), puis de l'EDC et du sulfo-NHS (à un rapport molaire de 1:1) ont été ajoutés et le mélange a été incubé pendant 15 min. Enfin, du N-PAMAM (PAMAM neutre) a été ajouté suivi d'une incubation à 4°C dans un lit agité pendant une nuit. Ce polymère s'est auto-assemblé en solution aqueuse pour former des micelles polymères qui ont encapsulé les hôtes de faible poids moléculaire autrement insolubles [12]; après la réaction, une dialyse était nécessaire pour éliminer les matériaux n'ayant pas réagi. Ensuite, la production a été lyophilisée, pesée et redissoute dans un tampon de conservation, et enfin, l'IgG de chèvre anti-lapin conjuguée au N-PAMAM a été fabriquée.

Les spectres de fluorescence et UV-vis de N-PAMAM-IgG (chèvre anti-lapin) dans le MES sont présentés sur la Fig. 1. Par rapport à N-PAMAM (PAMAM neutre) et IgG, le pic d'émission de fluorescence de N-PAMAM-IgG était de la plus faible intensité. Le spectre UV-vis montre que par rapport aux IgG, au tampon MES, au PAMAM et au N-PAMAM, seul le N-PAMAM-IgG avait un pic d'absorption à une longueur d'onde de 200  nm. Qu'il s'agisse du spectre de fluorescence ou du spectre UV-vis, N-PAMAM-IgG présente des caractéristiques différentes par rapport à N-PAMAM et IgG, ce qui prouve indirectement que N-PAMAM et IgG ont été combinés plutôt que simplement mélangés. Pour détecter l'activité anticorps de N-PAMAM-IgG, un ELISA a été réalisé. Comme le montre la figure 2, la résistance aux anticorps IgG (chèvre anti-lapin) n'a pas été perdue lors du couplage avec N-PAMAM.

un Spectres de fluorescence de PAMAM-IgG (chèvre anti-lapin) dans le MES. La longueur d'onde d'excitation était de 548  nm. b Spectres UV-vis de PAMAM-IgG (chèvre anti-lapin) en MES et spectres d'émission sur une gamme de longueurs d'onde

Méthode ELISA pour détecter la résistance aux anticorps N-PAMAM-IgG (chèvre anti-lapin). N-PAMAM-IgG a été utilisé comme antigène et dilué à différentes concentrations. L'IgG-HRP de lapin a été utilisée comme sonde d'anticorps pour détecter la résistance de N-PAMAM-IgG. La mesure d'absorbance a été prise à une longueur d'onde de 450 nm

La partie des QDs est une IgG anti-souris de chèvre conjuguée aux QDs. Les QD conjugués à des anticorps sont généralement formés par des réactions de couplage croisé, où les molécules d'anticorps se lient à des groupes fonctionnels tels que des groupes carboxyle ou des groupes amino sur la surface des QD [13, 14]. Dans cette étude, nous avons utilisé des points quantiques hydrosolubles core/shell CdSe/ZnS stabilisés avec des ligands carboxyle et la réaction de couplage carbodiimide à l'aide d'EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride). Cette méthode est l'une des méthodes les plus populaires pour conjuguer un anticorps à la surface des QD [15,16,17]. Les micelles des QDs CdSe/ZnS ont d'abord été incubées en présence d'EDC et de sulfo-NHS dans du tampon borate (5 mM BS, pH 7,2). Ensuite, des IgG anti-souris de chèvre ont été ajoutées et le mélange a été incubé à 4°C dans un lit agité pendant une nuit dans l'obscurité. Enfin, 10 % de BSA (albumine de sérum bovin) ont été ajoutés pour bloquer les QD n'ayant pas réagi, et la production a été purifiée par centrifugation et redissolution successives pour éliminer les matériaux n'ayant pas réagi. L'activité anticorps des IgG conjuguées aux QDs (chèvre anti-souris) peut se conserver 3 mois après stockage à 4 °C dans l'obscurité.

La taille des particules des QDs-IgG (chèvre anti-souris) et des QDs dans un tampon de conservation (2,5  mM BS, pH 8,0, 0,1% BSA) est indiquée sur la figure 3 a. Après la réaction de couplage, le diamètre des produits a évidemment augmenté, et les produits ont une bonne homogénéité et stabilité. Ces caractéristiques sont la clé de leur utilisation comme sonde de détection. Les spectres de fluorescence des QDs-IgG et QDs sont montrés dans la Fig. 3b, et comme montré dans la Fig. 3a, le diamètre de production augmenté montre que l'IgG a été combiné avec les QDs, mais le pic d'émission de fluorescence QDs-IgG était le même comme les QD. Ce résultat signifie que le couplage des IgG et des QD n'a pas modifié les caractéristiques optiques des QD, ce qui est utile pour leur application en immunoessais. Pour détecter l'activité anticorps des QDs-IgG, nous avons utilisé une méthode ELISA avec une membrane PVDF. L'anticorps anti-AKT de souris a été dilué à des concentrations de 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml et 200 μg/ml, et les quatre antigènes à gradient de concentration ont été hybridés avec QDs-IgG (chèvre anti-souris) à la même concentration de 0,1 µmg/ml. Après hybridation pendant 40 min à 37 °C dans l'obscurité, la membrane PVDF a été lavée avec du PBST (pH 6,0, 0,1 % de Tween 20) 3 fois, et la membrane PVDF a été irradiée avec de la lumière UV. L'intensité de fluorescence a été montrée sur la figure 3c, l'intensité de fluorescence a augmenté avec l'augmentation de la concentration d'antigène, indiquant que QDs-IgG a une activité d'anticorps élevée.

un Distribution du diamètre hydrodynamique des QDs et des QDs-IgG conjuguées (chèvre anti-souris). (un ) Diamètres des QDs et (b ) IgG conjuguées QDs (chèvre anti-souris). Le diamètre moyen des QDs est de 64,87 nm, et celui des QDs-IgG est de 211,4 nm, détecté par DLS. b Spectres de fluorescence des QDs-IgG (chèvre anti-souris), des QDs et du tampon conservateur (2.5 mM BS, pH 8.0, 0.1% BSA). Le pic d'émission de fluorescence QDs-IgG était le même que celui des QDs, indiquant que le couplage des IgG aux QDs n'altère pas les caractéristiques optiques des QDs. c Méthode ELISA pour détecter la résistance aux anticorps des QDs-IgG (chèvre anti-souris), la membrane PVDF a été évaluée aux UV

Cette section présente comment utiliser ce groupe de complexes dans FCM. Comme mentionné ci-dessus, nous pouvons détecter de nombreux types d'antigènes, tels que les petites protéines, les virus et les cytokines [18], et nous avons utilisé la protéine HSP27 comme exemple, examinons maintenant le processus en détail. HSP27 est situé dans le cytoplasme et est sécrétée en grande quantité dans les cellules tumorales, en particulier dans le cancer du poumon, le cancer du pancréas, le cancer de l'épithélium urinaire, le cancer du rein, le cancer du sein et le mélanome du cancer de la peau. Comme une petite partie de HSP27 est sécrétée extracellulaire, nous devons lyser la cellule pour extraire la protéine. Dans cette expérience, nous avons sélectionné deux lignées cellulaires, MCF-7 (cellules humaines du cancer du sein) comme groupe test et L02 (cellules hépatiques humaines normales) comme groupe témoin. Les cellules ont été lysées pour extraire les protéines intracellulaires. Les protéines totales ont été collectées puis de l'anti-HSP27 de lapin et de l'anti-HSP27 de souris ont été ajoutés en fonction de la concentration en protéines, suivi d'une incubation à 37°C pendant 50  min. Ensuite, N-PAMAM-IgG a été ajouté au mélange, le mélange a été incubé à 37 °C pendant 30 min, puis divisé en deux groupes égaux :un groupe test et un groupe PAMAM. Enfin, QDs-IgG a été ajouté au groupe de test et incubé à 37 °C pendant 30 min dans l'obscurité. La figure 4 montre l'analyse de fluorescence pour les deux groupes de cellules par cytométrie en flux. L'intensité de fluorescence de la courbe de test était beaucoup plus élevée que celle de la courbe PAMAM dans le groupe MCF-7, tandis que dans le groupe L02, les deux courbes se chevauchaient presque. Lorsque HSP27 existe dans des extraits cellulaires, N-PAMAM-IgG et QDs-IgG se lieront indirectement pour former une combinaison sandwich en présence d'anti-HSP27 de lapin et d'anti-HSP27 de souris. Si HSP27 n'existe pas, seule une petite quantité de QDs-IgG se liera à N-PAMAM-IgG par adsorption non spécifique. Par conséquent, si l'intensité de fluorescence de la courbe test est supérieure à celle de la courbe contrôle PAMAM, HSP27 est contenue dans l'échantillon. La figure 4 montre que les cellules MCF-7 sécrètent plus de protéines HSP27 que les cellules L02.

Analyse de fluorescence de HSP27 par cytométrie en flux. un Cellules L02. b Cellules MCF-7. Le groupe test a été incubé avec N-PAMAM-IgG et QDs-IgG, groupe PAMAM comme contrôle, qui n'a été incubé qu'avec N-PAMAM-IgG pour former une pseudocellule pour la protéine micromoléculaire détectée par FCM. Lorsque les deux courbes se chevauchent presque, on peut déterminer qu'il n'y a pas de HSP27 dans l'échantillon; par conséquent, que QDs-IgG soit ajouté ou non, l'intensité de fluorescence ne changera pas

Comme mentionné ci-dessus, ces complexes peuvent détecter les protéines intracellulaires sécrétées par le FCM; en principe, ces complexes peuvent être appliqués à tout type d'antigène. De plus, les deux parties de la combinaison peuvent être utilisées séparément. Si l'antigène que nous voulons détecter est situé dans la cellule ou à la surface de la cellule, nous ne pouvons utiliser que la partie des QD. Par exemple, la -actine est l'un des principaux composants du cytosquelette situé dans les cellules et existe largement dans les cellules eucaryotes. La figure 5a montre que l'analyse de fluorescence n'a utilisé que la partie QD pour la -actine dans les cellules HeLa par FCM. Les cellules HeLa ont été lavées et traitées avec du méthanol pour améliorer la pénétration de la membrane cellulaire, puis divisées en deux groupes égaux. Le groupe β-actine a été incubé avec de l'anti-β-actine de souris à 37°C pendant 30 min, et le groupe témoin a été incubé avec de la BSA. Après lavage avec du PBS, les deux groupes ont été incubés avec des QDs-IgG (chèvre anti-souris) à 37°C pendant 30 min. Après deux lavages avec du PBS, les deux groupes ont été détectés par FCM. L'intensité de fluorescence de la courbe -actine était beaucoup plus élevée que celle de la courbe de contrôle, ce qui indiquait que les cellules HeLa contenaient la protéine -actine.

un Analyse de fluorescence pour la -actine dans les cellules HeLa. Le groupe β-actine a été incubé avec de l'anti-β-actine de souris et des QDs-IgG (chèvre anti-souris), et le groupe témoin a été incubé avec de la BSA et des QDs-IgG. Le groupe témoin peut permettre l'exclusion de la fluorescence de fond causée par l'adsorption non spécifique de QDs-IgG. b Images au microscope à fluorescence de cellules HeLa sous irradiation UV-vis. Le DAPI a coloré les noyaux cellulaires et émis une fluorescence bleue ; QDs-IgG indirectement combiné avec la -actine et émis une fluorescence rouge. Barre d'échelle 20 μm

De plus, ces complexes peuvent également être appliqués à l'ICC. Cependant, pour l'ICC, il est nécessaire que l'antigène cible soit localisé dans la cellule ou à la surface de la cellule et soit présent en grande quantité [19]; sinon, la cible expérimentale sera difficile à distinguer de l'arrière-plan. Nous avons pris la protéine β-actine par exemple et ensemencé des cellules HeLa dans une plaque de cellules de 10 cm et placé une lamelle de microscope dedans, utiliser du méthanol pour immobiliser les cellules. Les cellules ont ensuite été incubées avec de l'anti-β-actine de souris (PBS, 1% BSA) à 37°C pendant 1hh, lavées deux fois avec du PBST et incubées avec des QDs-IgG (chèvre anti-souris) à 37°C dans le sombre pendant 1 h. Après deux lavages au PBST et coloration du noyau cellulaire au DAPI, la fluorescence a été détectée au microscope à fluorescence [20, 21]. La figure 5b montre les images au microscope à fluorescence des cellules HeLa. L'avantage des QD en tant que colorant fluorescent est que le signal des QD et le signal DAPI peuvent être observés simultanément sous l'irradiation du canal ultraviolet ; donc, selon le noyau, la cible peut être évidemment localisée. Dans cette expérience, la -actine est constituée de protéines du cytosquelette autour du noyau cellulaire et peut évidemment être observée.

Conclusions

En conclusion, nous avons démontré l'application des complexes utilisés dans les immunoessais cliniques, tels que le FCM et l'ICC. Le groupe de complexes comprend une IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à PAMAM et une IgG de chèvre anti-souris conjuguée à QDs. Lorsque l'anti-antigène de lapin et l'anti-antigène de souris ont été ajoutés, l'antigène correspondant a été détecté. Ces complexes sont avantageux en raison de leur large spectre, de leur biocompatibilité élevée, de leur stabilité élevée à la lumière et de leur faible toxicité biologique. Ce complexe est un modèle universel qui ne nécessite que le changement des anticorps primaires correspondants. Dans cet article, nous avons utilisé les complexes pour détecter HSP27 et -actine, mais en théorie, ce processus peut être appliqué à tout type d'antigène. De plus, nous pouvons choisir la méthode de détection en fonction des caractéristiques des antigènes, et nous pouvons également diviser les complexes et les utiliser individuellement selon les besoins réels. Cette méthode permet également de détecter de petites molécules, telles que des petites protéines et des virus, par cytométrie en flux. Nous pensons qu'avec une amélioration appropriée, il peut également être appliqué à d'autres méthodes, comme l'immunoflurescence (IF), le western blot (WB) et la bandelette immunochromatographique à flux latéral (LCS).

Méthodes/Expérimental

Matériaux

Les points quantiques CdSe/ZnS (QD hydrosolubles avec groupes carboxyle, cas n° N/A) ont été achetés auprès de NEPQD, Chine. PAMAM (cinquième génération à terminaison amino, lot n° CYD-150A) a été acheté auprès de CYD, Chine. L'IgG de chèvre anti-lapin (ab6702) et l'anti-β-actine de souris (ab8226) ont été achetés auprès d'Abcam, Royaume-Uni; l'anti-HSP27 de souris (BF0624) et l'anti-HSP27 de lapin (AF6082) ont été achetés chez Affinity, USA; l'IgG anti-souris de chèvre (bs0296G) a été achetée chez Bioss, Chine; EDC et sulfo-NHS ont été achetés auprès de Thermo Fisher; Le DMEM et le sérum bovin fœtal ont été achetés auprès de Gibco; et les membranes PVDF (0,2 µm) ont été achetées auprès de Millipore. Tous les autres réactifs chimiques étaient de qualité réactif analytique.

Préparation de N-PAMAM-IgG (chèvre anti-lapin)

1. a)

   Préparation de N-PAMAM (PAMAM neutre) :du PAMAM (à terminaisons amino G5, MW moyen 28826) (60 mg, 2,081  mM) a été dissous dans du DMSO (2  ml) et de l'anhydride succinique (dihydro-2,5-dicétotétrahydrofurane) (0,266 g, 2,66 µM) a été ajouté pour neutraliser les groupes amino. Parce qu'une mole de macromolécules PAMAM G5 contient 128 moles de groupes aminés, 60 µmg de PAMAM contiennent 0,266 µm de groupes aminés et le rapport molaire pour les groupes aminés PAMAM et l'anhydride succinique est d'environ 1:10. Ensuite, le mélange a été mélangé dans un lit agité à 100 rpm pendant 4 h, après quoi la solution a été dialysée à travers une membrane de dialyse 3500 MWCO pendant 24 h, et le N-PAMAM a été obtenu après lyophilisation.

2. b)

   Préparation de N-PAMAM-IgG (chèvre anti-lapin) :tampon MES formulé (100 mM, pH 6,0), puis prélever 100 μl de tampon MES dans un tube, ajouter 20 μM d'EDC, et 20 μM de sulfo-NHS puis agiter à l'aide d'un tourbillon à faible vitesse. Ajouter 35.7 μl IgG (pH, 0.5 μM) et agiter par vortex, après cela ajouter 19 μg N-PAMAM et incuber à 4 °C pendant une nuit, enfin la solution sera dialysée à travers une membrane de dialyse 3500MWCO et 8000MWCO pendant 3 days, après lyophilisation le N-PAMAM-IgG sera gagné.

Préparation de QDs-IgG (chèvre anti-souris)

1. a)

   Formulation du tampon BS :

1. 1.

   Préparer du tampon borax (50 mM) :peser 19,07 g de borax et dissoudre dans 1 L d'eau ultrapure.

2. 2.

   Préparer le tampon acide borique (50 mM) :peser 3,09 g d'acide borique et dissoudre dans 1 L d'eau ultrapure.

3. 3.

   Un tampon BS à pH 8,0 et un tampon BS à pH 7,2 ont été préparés en mélangeant les deux solutions ci-dessus.

4. 4.

   Le tampon de lavage, également utilisé comme tampon de conservation, a été préparé en diluant le tampon BS pH 8,0 à une concentration de 5 mM et en ajoutant 0,1% de Tween 20.

5. 5.

   La solution d'activation a été préparée en diluant le tampon BS pH 7,2 à une concentration de 5 mM et en ajoutant 0,1 % de Tween 20.

6. 6.

   Le tampon EDC a été fabriqué en dissolvant 0,27 g d'EDC dans 5 ml de solution d'activation, et le tampon sulfo-NHS a été fabriqué en dissolvant 0,378  g de sulfo-NHS dans 5 ml de solution d'activation.

1. b)

   Préparation des QDs-IgG (chèvre anti-souris) :

Tout d'abord, 450 μl de QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) ont été dissous dans 2,25 ml de solution d'activation, puis 150 μl de tampon EDC et 150 μl de tampon sulfo-NHS ont été ajoutés, et la solution a été soniquée sur de la glace pendant 5 min. Deuxièmement, la solution a été centrifugée à 12 000 rpm pendant 5 min pour éliminer le surnageant, et le précipité a été dissous dans 1,2 ml de tampon de lavage. Après 30 min de mélange aux ultrasons, 100 μg d'anticorps IgG ont été ajoutés, puis la solution a été incubée pendant une nuit dans un lit agité à une température de 4 °C. Troisièmement, 150 l de BSA à 10 % ont été ajoutés, suivis d'une incubation à 30 °C pendant 30 min et d'une centrifugation à 12 000 rpm pendant 2 min pour éliminer le surnageant. Le précipité a été redissous dans 1 ml de tampon de lavage puis centrifugé à 12.000 rpm pendant 2 min, cette étape a été répétée et enfin résolu le précipité dans 1 ml de tampon conservateur. À la fin, 10 % de BSA ont été ajoutés ; le mélange a été mélangé avec un mélange de choc ultrasonique complet et centrifugé à 820 µg/min pour éliminer le précipité, le surnageant contenant des QDs-IgG. Les QDs-IgG doivent être conservés à 4 °C dans l'obscurité pendant 3 mois. Il est à noter que les échantillons ne peuvent être conservés qu'à 4°C, et ne peuvent pas être congelés même avec de la glycérine; sinon, cela entraînera un grand nombre de points quantiques rassemblés en grappes, formant des précipitations qui ne pourraient pas être éliminées avec du PBST, ce qui entraînera une fluorescence de fond grave.

Analyse FCM pour la protéine HSP27

HSP27 est localisée dans le cytoplasme et est sécrétée en grande quantité dans les cellules tumorales. Dans cette expérience, nous avons sélectionné deux lignées cellulaires, MCF-7 (cellules humaines du cancer du sein) comme groupe test et L02 (cellules hépatiques humaines normales) comme groupe témoin. Les deux groupes de cellules ont été ensemencés dans une boîte de culture de 10 cm et incubés dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum bovin foetal (FBS) à 37 °C. Lorsque les cellules couvraient 80 % de la plaque, les cellules ont été digérées avec de la trypsine et lavées deux fois avec du PBS. Ensuite, les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS. Après avoir compté les cellules avec un hémocytomètre, un tampon de lyse cellulaire T-PER a été ajouté en fonction de la concentration cellulaire, après quoi la protéine intracellulaire a été extraite du lysat cellulaire. Ensuite, le lysat cellulaire a été centrifugé à 14000 rpm pendant 10 min pour récupérer le surnageant, et la concentration en protéines a été mesurée par la méthode BCA, selon la concentration en protéines, les anti-HSP27 de lapin et anti-HSP27 de souris ont été ajoutés et incubés à 37 °C pendant 50 min. Dans cette expérience, la concentration en protéines de L02 était d'environ 0,2 mg/ml et MCF-7 était de 0,25  mg/ml, et le volume des deux était de 500  μl. Les deux anticorps, anti-HSP27 de lapin et anti-HSP27 de souris, ont été ajoutés aux cellules (0,625 μl aux cellules MCF-7 et 0,5 μl aux cellules L02).

Ensuite, 1 mg/ml de N-PAMAM-IgG ont été ajoutés aux mélanges suivis d'une incubation à 37°C pendant 30 min; 6,25 l ont été ajoutés au groupe MCF-7 et 5 l ont été ajoutés au groupe L02. Après incubation, la production a été divisée en deux groupes égaux, le groupe test et le groupe PAMAM. Enfin, QDs-IgG a été ajouté au groupe de test, qui a été incubé à 37 °C pendant 30 min dans l'obscurité. Ensuite, les deux groupes de cellules ont été analysés par cytométrie en flux.

Analyse FCM pour la protéine β-actine

La β-actine est une protéine intracellulaire qui est l'un des principaux composants du cytosquelette et qui existe largement dans les cellules eucaryotes. Les cellules HeLa ont été ensemencées dans une boîte de culture de 10 cm et incubées dans du DMEM avec 10 % de FBS à 37 °C pendant 2 jours, puis le surnageant a été retiré et les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS. Les cellules ont été digérées avec de la trypsine, après quoi les cellules ont été centrifugées à 800 rpm pendant 3 min pour éliminer le surnageant, et 1 ml de méthanol froid a été ajouté pour remettre les cellules en suspension. Après 5 min, les cellules ont été centrifugées à 800 rpm pendant 3 min pour éliminer le surnageant, et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS. Cette étape a été répétée et les cellules HeLa ont été divisées en deux groupes égaux. Le groupe test a été incubé avec de l'anti-β-actine de souris à 37 °C pendant 30 min et le groupe témoin a été incubé avec de la BSA (albumine de sérum bovin). Dans cette expérience, l'anti-β-actine de souris a été dissoute dans du PBST (1% de BSA, 5 g/ml), et 100 l d'IgG ont été ajoutés à 300 l du groupe test, et une quantité équivalente de BSA a été ajoutée au groupe de contrôle. Après une demi-heure d'incubation, les deux groupes ont été incubés avec des QDs-IgG (chèvre anti-souris) à 37°C pendant 30 min. Après deux lavages avec du PBS, les deux groupes ont été évalués par le FCM.

Analyse ICC pour la protéine β-actine

Les cellules HeLa ont été ensemencées dans une boîte de culture de 10 cm et incubées dans du DMEM avec 10 % de FBS à 37 °C pendant 1 jour. Ensuite, plusieurs lamelles couvre-objet stérilisées ont été placées dans la boîte à cellules et les cellules ont été davantage cultivées pendant 2 jours et demi. Les lamelles ont été retirées et lavées deux fois avec du PBS, puis les lamelles ont été incubées dans 400 μl de méthanol pendant 20 min à température ambiante. Les lamelles ont été lavées 3 fois avec du PBS. Ensuite, un tampon de blocage a été préparé avec du PBST (0,1 % de Tween 20), 22,52  mg/ml de glycine et 10 % de BSA. Une lamelle a été placée dans un tampon de blocage et incubée pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, le tampon de blocage a été retiré et une lamelle a été incubée avec de l'anti-β-actine de souris (PBS, 1% de BSA) à 37 °C pendant 1 h, lavée deux fois avec du PBST et incubée avec du QDs-IgG (chèvre anti- souris) à 37°C pendant 1hh dans l'obscurité. Après lavage deux fois avec du PBST et coloration du noyau cellulaire avec du DAPI pendant 2 min, la lamelle a été rincée une fois avec du PBS et une fois avec de l'eau pour une visualisation au microscope à fluorescence.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données sont entièrement disponibles sans restriction.

Abréviations

CBA :

Réseau de billes cytométriques

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

FBS :

Sérum fœtal bovin

FCM :

Cytométrie en flux

ICC :

Immunocytochimie

N-PAMAM :

PAMAM neutre

PAMAM :

Le dendrimère polyamidoamine

QD :

Points quantiques