Nanoparticules biodégradables multimodes sensibles au microenvironnement tumoral pour l'imagerie ciblée du cancer du sein

Introduction

En pratique clinique, les microbulles sont principalement utilisées comme agents de contraste ultrasonores pour l'imagerie en temps réel de divers organes et vaisseaux sanguins [1,2,3]. Les agents de contraste à ultrasons traditionnels sont généralement constitués de matériaux tels que des lipides ou des protéines qui contiennent de l'air ou des gaz perfluorocarbonés. Les espèces gazeuses encapsulées dans les microsphères ont une faible stabilité dans le sang et une courte demi-vie en raison de la diffusion rapide des défauts des microbulles [4,5,6]. De plus, comme la taille des particules des microbulles remplies de gaz est généralement grande (environ 1 à 8 m), il est difficile pour les microbulles de pénétrer dans l'environnement tumoral hôte par extravasation tissulaire. Par conséquent, l'application actuelle des bulles de la taille du micron en imagerie intravasculaire est limitée [7]. Les agents de contraste échographiques idéaux doivent généralement présenter une taille optimale pour le transport à travers l'espace vasculaire tissulaire, une durée adéquate de l'effet acoustique, un bon ciblage et une bonne biocompatibilité, et une excrétion facile du corps [8, 9]. Le concept de « nanoparticules génératrices de gaz » a été proposé dans des recherches antérieures, et de telles nanoparticules ont le potentiel d'être utilisées dans l'imagerie de contraste par ultrasons [10,11,12]. Ces nanoparticules génératrices de gaz sont supérieures aux performances des microbulles remplies de gaz actuelles, et le gaz généré en continu permet une imagerie ultrasonore intense. Les nanoparticules génératrices de gaz peuvent améliorer la perméation et la rétention, et elles peuvent circuler de manière stable dans le sang et s'accumuler efficacement dans le tissu tumoral [13, 14].

Il reste un défi de détecter des tumeurs minuscules et occultes par des méthodes d'imagerie traditionnelles, telles que l'imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie (TDM) et les ultrasons, qui sont limitées par de longs temps d'acquisition, une dose de rayonnement élevée et une faible sensibilité [15 , 16]. Il est nécessaire d'intégrer différentes méthodes d'imagerie et de développer une technologie d'imagerie multimodale pour parvenir à une synergie intégrée pour la détection précoce du cancer [17,18,19]. Oxyde de fer superparamagnétique (Fe₃ O₄ ) les nanoparticules peuvent être utilisées comme agents de contraste IRM négatifs en imagerie pondérée en T2 [20, 21]. Fe₃ O₄ a des propriétés globales attrayantes, notamment une petite taille de particule, une forte pénétrabilité, une magnétisation élevée, un bon métabolisme et une toxicité relativement faible [22, 23]. Fe₃ O₄ les agents de contraste pour le diagnostic par IRM du cancer à un stade précoce ont été largement étudiés en raison de leur relaxation et de leur contraste élevés [24,25,26]. De plus, l'imagerie par fluorescence en temps réel a une excellente résolution et peut être une méthode précieuse pour définir le stade tumoral, guider la résection tumorale et surveiller les effets du traitement [27, 28].

Ici, ces nanoparticules sont principalement encapsulées par de l'acide poly (lactique-co-glycolique) (PLGA), qui a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour être utilisé comme matériau biosûr [29, 30]. Les particules PLGA sont modifiées avec le peptide RGD pour permettre la liaison à l'intégrine αvβ3 à la surface des cellules cancéreuses du sein et avec Cy5.5 comme colorant fluorescent pour l'imagerie in vivo, et elles sont encapsulées avec Fe₃ O₄ agir comme agent de contraste T2 négatif en IRM (Schéma 1a). En raison de la glycolyse régulée à la hausse dans le tissu tumoral, qui pourrait produire plus d'acide lactique et de protons dans l'environnement extracellulaire, le pH des tissus tumoraux (6,8-7,2) est inférieur à celui des tissus normaux (pH 7,4) [31,32,33] . Ainsi, nous avons conçu le carbonate de sodium (Na₂ CO₃ ) dans la PLGA pour produire du CO₂ bulles au pH inférieur des tissus tumoraux pour l'imagerie par ultrasons. Pour vérifier leur application prometteuse dans l'imagerie tumorale, les propriétés complètes de ces nanoparticules multimodes pour l'imagerie in vitro ont été systématiquement caractérisées, y compris leur cytotoxicité, leur spécificité de ciblage et leur biodistribution dans le tissu tumoral, par trois modes d'imagerie.

un Schémas de principe de la fonction dans Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs via une accumulation ciblée dans la tumeur et générant du CO₂ bulles dans les tissus tumoraux acides, suivies d'une imagerie MR/US/FI triple modale du cancer du sein. b Illustration schématique de la préparation du Fe₃ O₄ / Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP

Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD ont été conçues comme des agents de contraste multimodes ciblés RGD en encapsulant un polymère biocompatible de PLGA avec Fe₃ O₄ et Na₂ CO₃ et un agent ciblant les intégrines via une liaison chimique biodégradable (Schéma 1b).

Les images de microscopie électronique à transmission ont montré que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD étaient des sphères claires avec des particules d'oxyde de fer uniformément dispersées visibles dans la coque (Fig. 1a). La taille hydrodynamique moyenne des NPs a été mesurée à 117,6  nm par diffusion dynamique de la lumière, et l'indice de polydispersité moyen était de 0,234 (Fig. 1b). La charge de surface des NP a été confirmée par des mesures de potentiel zêta comme étant de − 21,7 mV (Fig. 1c). La mesure du spectre de fluorescence a révélé que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD avait la longueur d'onde d'émission maximale à 685  nm, indiquant que Cy5.5 a été encapsulé avec succès dans le noyau PLGA (Fig. 1d). Les valeurs d'aimantation de saturation pour Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD et Fe₃ gratuit O₄ Les NP étaient respectivement égales à 32,6 et 42,5  emu/g (Fig. 1e). Ces résultats ont indiqué la caractéristique superparamagnétique des nanoparticules à température ambiante. Le spectre FITR de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD a montré que la vibration d'étirement N-H et le pic d'absorption -OH apparaissaient autour de 3432 cm ⁻¹ . De plus, nous avons trouvé une amélioration (1628 cm ⁻¹ ) de la vibration d'étirement C =O. Comparé à celui des NP non ciblées, le pic caractéristique (le carboxyle) à 1735 cm ⁻¹ des NP ciblées a été considérablement réduite. Les résultats ont montré la liaison entre le groupe carboxyle sur la surface des microsphères et le groupe amino sur le peptide RGD. Liaison in vitro de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs est montré dans Fig. 1f.

Images TEM (a ) Distributions de taille (b ) Potentiel zêta (c ) de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @ NPs PLGA/Cy5.5/cRGD. d Spectre d'émission de fluorescence de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD et Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/cRGD NPs. e Courbes d'hystérésis magnétique de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs et Fe₃ O₄ NPs. f Le FTIR des spectres de Fe₃ ciblé O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD et NP PLGA non ciblés

Liaison in vitro des NP Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD

L'intégrine αvβ3 est généralement fortement exprimée sur les cellules endothéliales tumorales du cancer du sein et peut favoriser la métastase tumorale [33,34,35,36]. L'immunofluorescence cellulaire pour l'expression de l'intégrine v dans les cellules MDA-MB-231 était beaucoup plus élevée que celle dans les cellules MCF-7; Les cellules A549 ont servi de témoins positifs (Fig. 2a). L'absorption cellulaire des NPs a été étudiée par CLSM (Fig. 2b). Le Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD ont montré un taux de liaison aux cellules MD-MB-231 beaucoup plus élevé que les NP non ciblées. Les images de fluorescence ont également révélé que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD liées au cytoplasme cellulaire et les images fusionnées ont montré les mêmes emplacements que l'expression de l'intégrine αv [37, 38].

un Images de fluorescence confocale avec l'expression de l'intégrine v sur les cellules MB231, A549 et Mcf-7. Le bleu et le vert représentent respectivement la fluorescence DAPI et αv. b Images de fluorescence confocale de cellules MB231 incubées avec Fe₃ ciblé O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs et NPs non ciblés. Le bleu, le rouge et le vert représentent respectivement la fluorescence DAPI, Cy5.5 et v. c Viabilité relative des cellules MB231 incubées avec différentes concentrations de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs

Test de cytotoxicité

La cytotoxicité in vitro du Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD ont été estimées dans les cellules MDA-MB-231 à l'aide d'un test CCK8, tandis que les cellules A549 et MCF-7 traitées avec les NP ont été utilisées comme témoins (Fig. 2c). Dans la plage de concentrations de Fe de 5 à 80  μg/mL, la viabilité cellulaire des cellules A549 et MB231 n'était pas significativement réduite, et les deux étaient supérieures à 70 %. En revanche, les cellules MCF-7 ont montré une diminution significative de la viabilité cellulaire à environ 50 % à des concentrations de Fe supérieures à 40  μg/mL. Les résultats du CCK8 ont démontré que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD ont montré une cytotoxicité significativement plus faible dans les cellules MDA-MB-231 sur une plage de concentration donnée.

Imagerie de contraste in vitro

Nous avons utilisé un fantôme de gel d'agar pour étudier les performances de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs in vitro à différentes valeurs de pH (Fig. 3a). Les images de contraste échographiques de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD Les NP étaient significativement améliorées à un pH faiblement acide (pH 6,8) par rapport à pH 7,2, probablement parce que pH 7,2 ne produit pas assez de CO₂ bulles pour l'imagerie par ultrasons. En revanche, lorsque les NP étaient dans un environnement faiblement acide, suffisamment de bulles pouvaient être générées pour l'imagerie par ultrasons. Cette caractéristique est pertinente pour les tumeurs, qui présentent une hétérogénéité tissulaire élevée et divers niveaux de pH (pH 6,8–7,2) in vivo [32, 39, 40]. L'intensité du signal de l'image échographique a ensuite été analysée (Fig. 3b). Les rapports d'intensité du signal des groupes NP non ciblés (pH =7), NP non ciblés (PH =5), NP ciblés (PH =7) et NP ciblés (PH =5) par rapport à l'intensité du signal du le groupe blanc était de 112 %, 145 %, 167 % et 178 ± 4 %, respectivement, ce qui indique clairement que le groupe NP ciblé (PH =5) avait le signal américain le plus fort.

un Images ultrasonores des NP ciblées et des NP non ciblées enregistrées à différentes valeurs de pH (7,2 et 6,8), PBS comme contrôle. b Le taux d'intensité du signal est calculé par échantillon/vide, l'échantillon représente l'intensité de l'écho des NP ciblées et non ciblées, et le blanc représente l'intensité de l'écho du PBS. c Images IRM pondérées en T2 de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs avec différentes concentrations de Fe (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 et 1 mM). d Les relativités transversales (r2) étaient de 19,597 mM ⁻¹ s ⁻¹ pour Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs

Pour l'étude IRM in vitro, comme la concentration de Fe dans le Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs ont augmenté, l'intensité du signal pondéré en T2 a montré une diminution significative, indiquant la possibilité de ces NPs pour une utilisation comme agents de contraste T2 MR (Fig. 3c). Le taux de relaxation transversale (r2) de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs a été calculé à 19,597 mM ⁻¹ s ⁻¹ . Bien que le taux de relaxation transversale (r2) de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs est inférieur à celui de nombreux autres agents superparamagnétiques IRM, la composition de Fe₃ O₄ peut augmenter le r2, qui était 2,94 fois supérieur au r2 des particules SPIO utilisées en clinique.

Imagerie échographique de contraste de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP

Démontrer le potentiel du Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs pour l'imagerie par ultrasons dans les tumeurs, nous avons administré une injection de Na₂ dans la veine caudale CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs à des souris nudes xénogreffes de cancer du sein et surveillé les images échographiques en fonction du temps (Fig. 4a). Avant l'injection, des images de la tumeur, du foie et de la zone sous-cutanée ont été enregistrées. Immédiatement après l'injection, la zone des tissus tumoraux n'a montré aucune augmentation de contraste. Un rehaussement de la zone tumorale a été observé à partir de 30 min après l'injection et a duré 90 min. Les résultats de l'échographie in vivo ont montré que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/ RGD NPs ont généré suffisamment de bulles dans les tissus tumoraux acides pour produire une réflectivité échogène pour l'imagerie par ultrasons. À titre de contrôle, nous avons également obtenu des images du foie et des tissus sous-cutanés à différents moments après l'injection des NP ciblées. Tout au long de la période d'observation, aucun rehaussement significatif n'a été trouvé dans la zone d'injection sous-cutanée, et le rehaussement dans le foie, qui diminuait avec le temps, était significativement inférieur à celui des tumeurs (Fig. 4b). Ce résultat indique que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs circulant dans le corps à pH physiologique ne produisent pas une quantité substantielle de CO₂ bulles pour l'amélioration du contraste par ultrasons.

un Imagerie échographique in vivo des tumeurs, du foie et des zones sous-cutanées à différents moments après l'injection de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @ NPs PLGA/Cy5.5/cRGD. b Le taux d'intensité de l'écho en fonction du temps est calculé par tissu/blanc, le tissu représente l'intensité de l'écho de la tumeur, du foie ou de la zone sous-cutanée, le blanc représente l'intensité de l'écho avant l'injection

IRM de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP

Pour l'IRM in vivo, pour démontrer que les NP peuvent être utilisées pour l'imagerie spécifique de la tumeur, Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD ont été injectées directement dans les tumeurs et les muscles. Les résultats ont montré que la zone tumorale présentait une diminution significative du contraste T2-MR après l'injection des NP ciblées, et l'intensité du signal a diminué de manière significative de 8875 à 0 min à 5972 à 120 min après l'injection (Fig. 5a, b). Cependant, avec la même quantité de nanoparticules injectées, la zone musculaire sous-cutanée a montré une diminution du signal T2 beaucoup plus faible. Ce résultat démontre l'efficacité de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs avec des agents de contraste T2-MR hypersensibles ciblés sur les intégrines pour une utilisation dans l'imagerie ciblée sur les tumeurs. Dans le groupe d'injection dans la veine caudale, l'imagerie T2-MR a également montré une diminution évidente du contraste dans la tumeur 24h après l'injection, démontrant la forte accumulation tumorale de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @ NPs PLGA/Cy5.5/RGD (Fig. 5c, d). De plus, une diminution des signaux T2 a été observée dans le foie et les reins, indiquant que les ions fer dans les NP pourraient être rapidement éliminés du corps. Par conséquent, l'IRM a révélé que le Fe₃ enveloppé de PLGA O₄ les nanoparticules ont présenté un ciblage passif efficace des tumeurs via l'effet de perméabilité et de rétention améliorées (EPR), en particulier le ciblage médié par RGD, mais pourraient être décomposées et rapidement excrétées in vivo.

un Images T2-MR in vivo de tissus sous-cutanés normaux et tumoraux avant et après injection de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @ NPs PLGA/Cy5.5/cRGD. b Intensité moyenne du signal dans le muscle et la tumeur pour l'injection de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @ NPs PLGA/Cy5.5/cRGD. c Images T2-MR sur axiale et coronale de souris porteuses de tumeurs MDA-MB-231 avant et après injection intraveineuse de Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @ NPs PLGA/Cy5.5/cRGD. d Le rapport d'intensité du signal est calculé par tissu/muscle, le tissu représente l'intensité du signal de la tumeur, du foie et du rein avant et après l'injection des NP ciblées, le muscle représente l'intensité du signal du muscle en même temps

Imagerie de fluorescence et histologie

Deux cents microlitres de NP ont été injectés par voie intraveineuse à des souris pour une imagerie par fluorescence in vivo. Dans le groupe injecté avec des NP ciblées par RGD, le signal de fluorescence de Cy5.5 a progressivement augmenté dans la zone tumorale et a atteint un pic à 4 h après l'injection, indiquant que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD peuvent s'accumuler efficacement dans la tumeur. Dans le groupe non ciblé, les NP étaient distribuées dans tout le corps après l'injection et rapidement éliminées, et elles ne se sont pas accumulées dans la tumeur pendant une longue période (Fig. 6a). Les souris ont ensuite été disséquées et les principaux organes et tumeurs ont été collectés pour une imagerie par fluorescence in vitro, qui a révélé une absorption tumorale élevée des NP ciblées (Fig. 6b, c). L'intensité de fluorescence de Cy5.5 dans les tumeurs des souris injectées avec des NP ciblées était 1,5 fois supérieure à celle des souris injectées avec des NP non ciblées.

un Imagerie de fluorescence de fluorescence in vivo des animaux à 0, 0,5, 1, 2 et 3 h post-injection après injection de NP ciblées et non ciblées. b Images de fluorescence ex vivo de tumeurs et d'organes majeurs (foie, rate, poumon, cœur et rein) prélevés sur des animaux. c Intensité de fluorescence moyenne de divers organes et tumeurs

De plus, le ciblage spécifique de la tumeur de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD ont été vérifiées par imagerie par fluorescence des tissus de coupes de tumeurs congelées (Fig. 7a). La coloration par immunofluorescence des coupes tumorales avec des anticorps contre l'intégrine v et 3 a révélé une expression significative de l'intégrine vβ3 dans les tissus tumoraux. La fluorescence de l'intégrine αv et 3 a été fusionnée avec la fluorescence Cy5.5 de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs pour obtenir une image d'immunomarquage révélant une colocalisation. Les résultats d'immunofluorescence dans les tissus tumoraux ont indiqué que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD se lient spécifiquement à l'intégrine vβ3 dans le cancer du sein malin MB231. De plus, coloration H&E de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD comparées au groupe non ciblé ont montré que toutes les sections de tissus d'organes avaient une morphologie pathologique normale et aucune réponse aux dommages histopathologiques (Fig. 7b). Tous les résultats de la cytotoxicité ci-dessus et de l'analyse histologique ont indiqué que Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD n'ont induit aucune toxicité significative pour les principaux tissus d'organes in vivo, et leur bonne biocompatibilité peut être raisonnablement attribuée au PLGA.

un Imagerie fluorescente de coupes congelées de tumeurs MDA-MB-231 provenant de souris injectées avec des NP ciblées et non ciblées. Le vert, le rouge, le violet et le bleu représentent respectivement la fluorescence αv, 3, Cy5.5 et DAPI. b Tranches de tumeur colorées au H&E prélevées sur des souris après injection de NP ciblées et non ciblées

Conclusions

En conclusion, les résultats ci-dessus démontrent une approche créative et réussie pour l'IRM du cancer du sein grâce à un ciblage magnétique et un système générateur de gaz qui est activé dans le microenvironnement tumoral. Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les NP @PLGA/Cy5.5/RGD présentent d'excellentes performances d'imagerie et une bonne biocompatibilité dans les modes d'imagerie par résonance magnétique/échographie/fluorescence. Notre travail montre le fort potentiel pour le diagnostic des tumeurs avec une imagerie multimodale améliorée.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) (lactide:glycolide =75:25, Mw =20 000), le colorant Cyanine5.5 et l'alcool polyvinylique (PVA) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Company (Shanghai, Chine). Le peptide RGD a été synthétisé sur mesure par GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Fe₃ O₄ nanoparticules et carbonate de sodium (Na₂ CO₃ ) ont été achetés auprès de Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, Chine). Dichlorométhane (CH₂ Cl₂ ) et le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été obtenus auprès de Solarbio Company (Beijing, Chine). Tous les produits chimiques étaient de qualité analytique.

Synthèse de nanoparticules Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD

Tout d'abord, 12,5 mg de PLGA et 0,25 mL de chloroforme ont été mélangés. Ensuite, 5 μL de Cy5.5, 15 μL de nanoparticules magnétiques modifiées en acide oléique dispersées dans du chloroforme (OA@Fe₃ O₄ , 10 mg/mL), 5 μL de carbonate de sodium (Na₂ CO₃ ) et 1,5 mL de solution de PVA à 1% ont été ajoutés en séquence et émulsionnés avec un processeur à ultrasons pendant 2 min. Ensuite, 12,5 mL de solution de PVA à 0,3 % ont été ajoutés et agités pendant 3 à 4 h à température ambiante, et 12,5 mL de solution de PVA à 0,4 % ont été ajoutés pour agitation (500 rpm/min) pendant la nuit pour éliminer le solvant organique résiduel. La solution ci-dessus a été soumise à plusieurs lavages d'ultrafiltration avec ddH₂ O puis dilué avec du tampon PB (pH =7,4) jusqu'à un volume final de 1,25 µmL. Ensuite, 0,25 mg d'EDC et 1,25 mg de NHS ont été ajoutés à la solution mélangée ci-dessus. Le mélange a été agité pendant 30 min à 25 °C puis lavé trois fois par ultrafiltration et remis en suspension dans une solution tampon PB (pH =7,4). Ensuite, 1,25 µg de cRGD ont été ajoutés à la solution et agités à 4°C pendant une nuit. Pour éliminer l'EDC, le NHS et tout cRGD résiduel, la solution transparente a été filtrée par un tube d'ultrafiltration. Enfin, Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ Les NP @PLGA/Cy5.5/cRGD ont été remises en suspension dans 1,25 mL d'eau déminéralisée et stockées à 4 °C.

Caractérisation des nanoparticules

Les diamètres dynamiques et le potentiel zêta des nanoparticules ont été mesurés par un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Royaume-Uni). La morphologie des nanoparticules a été obtenue à l'aide d'un microscope électronique à transmission FEI Tecnai F20. Le chargement de Cy5.5 a été enregistré par un spectromètre à fluorescence Hitachi F-7000. La FTIR a été réalisée en utilisant un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (Alpha II, Bruker, Suisse). Un magnétomètre à échantillon vibrant (VSM, Lake Shore 7410) a été appliqué pour déterminer la courbe d'hystérésis des nanoparticules et Fe₃ libre. O₄ .

Cellules et animaux

Les cellules MDA-MB-231 du cancer du sein humain ont été gracieusement fournies par la Stem Cell Bank, Académie chinoise des sciences. Les cellules ont été maintenues à 37 °C dans 95% d'air et 5% de CO₂ . Des souris femelles BALB/c (4 semaines) ont été achetées auprès de Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. et maintenues selon des protocoles approuvés par le Guangxi Medical University Laboratory Animal Center. Les expérimentations animales ont été suivies avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, publié par le Comité d'éthique des animaux du Centre des animaux de laboratoire, Université médicale du Guangxi. Des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 ont été transplantées dans le flanc droit de souris BALB/c (2 × 106 dans 200 l de cellules par souris) et laissées à croître pendant 10 à 14 jours (diamètre moyen 5 mm) avant l'imagerie.

Expression cellulaire de l'intégrine αv

Une immunofluorescence cellulaire a été réalisée pour confirmer la forte expression de l'intégrine v dans les cellules MDA-MB-231. Des cellules A549 et MCF-7 ont été utilisées comme témoins. Les cellules ont été ensemencées sur des boîtes de culture à fond de verre de 35 mm (MatTek, USA) à 2 × 10 ⁴ cellules mL ⁻¹ pendant 24 h. Après incubation, les cellules ont été fixées pendant 20 min à température ambiante avec du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, ils ont été incubés avec un anticorps monoclonal de lapin anti-intégrine av (ab179475, Abcam) à 4°C pendant une nuit et un anticorps anti-IgG de lapin pendant 1h à température ambiante. Enfin, les cellules ont été colorées au DAPI. Les images ont été acquises par microscopie confocale à balayage laser (TCS SP8, Leica, Allemagne).

Pour évaluer l'efficacité de ciblage des nanoparticules, une étude d'absorption cellulaire a été réalisée en utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Les cellules ont été ensemencées sur des boîtes de culture à fond de verre de 35 mm (MatTek, USA) à 2 × 10 ⁴ cellules mL ⁻¹ pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été incubées avec des NP ciblées par RGD (30 μg mL ^-1 , 0,5 mL) à pH 7,4 pendant 2 h, et des NP non ciblées ont été utilisées comme témoins. Après incubation, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 20 min puis incubées avec l'anticorps αv. Par colocalisation, nous avons vérifié la liaison ciblée des nanoparticules à l'intégrine sur les cellules.

Test CCK8

La biocompatibilité de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Les nanoparticules @PLGA/Cy5.5/RGD ont été évaluées par une étude de cytotoxicité. Les cellules MDA-MB-231, A549 et MCF-7 ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits à 5 × 10 ³ cellules mL ⁻¹ pendant 24 h. Ensuite, 0,1 mL de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Une suspension @PLGA/Cy5.5/RGD NP à des concentrations de Fe de 5, 10, 20, 40 et 80 g/mL a été ajoutée à chaque puits et incubée pendant 24  h. Enfin, 10 μL de solution de CCK8 ont été ajoutés et la suspension a été incubée pendant encore 1 h. Les résultats ont été déterminés par un lecteur de microplaques (Thermo Scientific, USA) à 450 nm.

Imagerie échographique à contraste amélioré

L'imagerie par ultrasons des nanoparticules a été réalisée en utilisant un système à ultrasons Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canada). Les NP ciblées et non ciblées par RGD ont été ajoutées au modèle d'agarose, et du PBS a été utilisé comme contrôle. Les images ont été enregistrées en mode B et en mode CEUS avec différents tampons de pH de 7,2 et 6,8. La zone d'intérêt a été dessinée et la valeur de gris moyenne a été mesurée dans les images en mode B.

Pour l'imagerie par ultrasons in vivo, les souris ont été anesthésiées avec 2 % d'isoflurane (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., Chine) et la température corporelle a été maintenue à 37°C avec un coussin chauffant. Un total de 200 μL de NP ciblées par RGD a été injecté via la veine caudale. Les animaux témoins ont reçu une injection sous-cutanée avec la même quantité de NP. Les images ultrasonores ont été enregistrées à l'aide d'un transducteur à 7 MHz pour acquérir en continu des images échographiques des tumeurs, du foie et des zones sous-cutanées. La zone de focalisation acoustique a été placée au centre de la tumeur avec la plus grande section transversale, et un champ de vision contenant la tumeur et ses tissus adjacents a été obtenu.

Imagerie par résonance magnétique

Examens IRM de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD Les NP ont été réalisées à l'aide d'un MR 3.0 T (GE Healthcare, USA) et d'une bobine animale (RF TECH LIMITED, Chine). Les NP avec différentes concentrations en Fe de 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 et 1 mM ont été scannées dans des tubes Eppendorf de 1 mL et du PBS a été utilisé comme contrôle. L'IRM T2 a été réalisée pour chaque tube en utilisant une séquence FSE pondérée en T2 (épaisseur de coupe de 3 mm, TR/TE 2000/74,4 ms, FOV 8 × 8 cm et matrice 320 × 256). Les relaxivités (r2) ont été calculées par un ajustement linéaire du temps de relaxation inverse en fonction de la concentration en Fe.

Pour l'IRM in vivo, les souris ont été réparties au hasard en deux groupes (n =3) pour l'IRM qui a reçu soit (1) une injection locale de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs dans les tissus musculaires et tumoraux sous-cutanés ou (2) injection de Na₂ dans la veine caudale CO₃ /Fe₃ O₄ @ NPs PLGA/Cy5.5/RGD. Des images de base des souris ont été prises avant l'injection des nanoparticules. Pour le groupe un, la même quantité de NP a été injectée dans les tissus sous-cutanés et tumoraux, et une IRM a été réalisée toutes les 30 min pour enregistrer la transition du signal des tissus. Pour le groupe deux, l'imagerie tumorale a été réalisée dans les positions axiale et coronale, et les paramètres IRM étaient les mêmes que ceux utilisés pour l'imagerie in vitro. L'intensité du signal (SI) dans la région d'intérêt (ROI) a été mesurée et comparée aux signaux tissulaires à différents moments avant et après l'injection.

Imagerie de fluorescence tumorale

Pour l'imagerie par fluorescence in vivo, un système d'imagerie par fluorescence in vivo (FX PRO, Bruker, Suisse) a été utilisé pour la numérisation, et les souris ont été réparties au hasard en deux groupes (n =3) :(1) NP ciblées par RGD et (2) NP non ciblées. Les images ont été capturées toutes les 30 min pendant une période de 4 h après l'injection. Par la suite, d'importants organes et tumeurs ont été prélevés et imagés, et la distribution de la fluorescence dans les organes du corps a été observée. L'analyse quantitative de l'intensité de fluorescence a été réalisée à l'aide d'un logiciel d'imagerie moléculaire (Bruker, Suisse). Ces organes importants ont ensuite subi une coloration H&E pour évaluer la toxicité tissulaire. Des coupes de tumeurs congelées ont également été soumises à une immunocoloration par fluorescence avec des anticorps contre l'intégrine αv et l'intégrine β3.

Disponibilité des données et des matériaux

Les conclusions tirées dans ce manuscrit sont basées sur les données qui sont toutes présentées et montrées dans cet article.

Abréviations

Cy5.5 :

Sulfo-Cyanine5.5 NHS ester

DAPI :

4′,6-diamidino-2-phénylindole

EDC :

Chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide

FSE :

Écho de rotation rapide

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PB :

Phosphate buffer

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

PEG :

Polyéthylène glycol

PVA :

Alcool polyvinylique

RGD:

Arginine–glycine–aspartate

TE :

Echo time

TR:

Repetition time