Détection du microARN-335-5p sur une surface d'électrode interdigitée pour la détermination de la gravité des anévrismes de l'aorte abdominale

Introduction

Les anévrismes de l'aorte abdominale (AAA) sont des maladies potentiellement mortelles qui sont définies comme une aorte abdominale d'un diamètre> 3 cm ou plus grand que la normale [1, 2]. Cette condition se produit avec l'athérosclérose ou l'accumulation de plaque, qui affaiblit les parois de l'aorte abdominale et entraîne un renflement vers l'extérieur, semblable à un ballon. Au fil du temps, la paroi de l'artère s'élargit, et cette situation est comparable au vieillissement des tuyaux d'arrosage. La pression du sang pompant à travers l'aorte fait gonfler cette zone affaiblie vers l'extérieur, ce qui s'appelle un anévrisme. L'AAA se forme lorsque la partie affaiblie de l'aorte entraîne des complications [3,4,5,6]. Les AAA peuvent entraîner la mort par rupture de petits anévrismes. Actuellement, les examens physiques, les angiographies par tomographie axiale informatisée, l'imagerie par résonance magnétique et l'échographie sont utilisés pour diagnostiquer cette affection [7,8,9,10]. Cependant, il n'existe aucune méthode de détection pour l'AAA, qui est couramment identifié lors de l'analyse d'autres problèmes de santé. Cette situation entraîne un retard dans l'identification des AAA, provoquant en fin de compte des problèmes de santé inutiles. Pour surmonter ce problème, les chercheurs doivent développer des méthodes de détection précoce, et une stratégie potentielle est le développement d'un système de détection.

La détection précoce, rapide et sensible de la maladie de manière quantitative est un objectif vital pour les diagnostics cliniques. Les plates-formes de biodétection actuelles ont répondu à plusieurs demandes et nécessitent des paramètres de laboratoire et une formation appropriés. Ainsi, la plupart des méthodes ne sont pas portables, ce qui est nécessaire pour une détection idéale au point de service [11, 12]. De plus, pour aider les médecins à prendre des décisions de manière précise et rapide, une analyse de l'évolution des niveaux de biomarqueurs est hautement souhaitable. Les biomarqueurs circulants qui sont exprimés dans des zones spécifiques doivent être étudiés plus avant pour diagnostiquer les AAA et suivre les progrès du traitement. L'identification de ces types de biomarqueurs circulants permettra de diagnostiquer la maladie et d'effectuer le suivi des patients après le traitement. Pour répondre à ces besoins, cette étude propose de générer des capteurs de biomarqueurs appropriés pour l'AAA. Le capteur (électrode interdigitée) proposé dans cette étude a le potentiel pour une analyse haute performance avec une large gamme de biomarqueurs. Il s'agit d'un système de diélectrodes avec des écarts et des doigts alternés qui fonctionnent sous des mesures diélectriques [13,14,15].

Les biomarqueurs peuvent être n'importe quelle biomolécule, qui comprend l'ADN, l'ARN, les protéines, les glucides, les lipides et leurs formes modifiées [16, 17]. De plus, des chercheurs ont proposé que différents biomarqueurs, tels que les ARN non codants, soient exprimés dans le système cellulaire, mais qu'ils ne soient pas traduits en protéines [18]. Les ARN non codants ne sont généralement pas traduits en protéines et ont généralement des séquences courtes [18,19,20,21]. Différentes classes d'ARN non codants, tels que les microARN (miARN), les ARN ribosomiques, les ARN de transfert, les petits ARN nucléolaires, les petits ARN nucléaires, les ARN de télomérase, les ARNsn, les ARN Xist, les ARN de voûte et les ARN 7SL, ont été rapportés. Les miARN fonctionnent principalement dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle de l'expression des gènes et entraînent souvent un silençage génique [22]. Récemment, des chercheurs ont décrit l'importance des miARN pour la prédiction des AAA et ont rapporté une réduction de l'expression des miARN-335-5p chez les patients AAA [23]. Il a été prouvé que la combinaison de facteurs cliniques et l'expression de microARN amélioraient considérablement la prédiction des maladies et présentaient une précision accrue [24]. Les chercheurs se sont spécifiquement concentrés sur le miARN-335-5p, qui affichait une plage significativement minimale chez les individus atteints d'AAA à croissance rapide [2, 23]. De plus, une diminution des niveaux de miARN-335-5p a amélioré la confiance dans la détection d'AAA en croissance. En d'autres termes, la sortie négative (niveaux plus élevés) de miR-335-5p indique la gravité de l'AAA et minimise le dépistage laborieux. Ce résultat a été démontré par Wanhainen et al. [23] et ont révélé que les miARN sont des biomarqueurs utiles pour le dépistage des AAA et l'élimination du risque d'AAA à croissance rapide. L'étude actuelle démontre l'application de la détection de miARN-335-5p par un capteur à électrodes interdigitées (IDE) pour déterminer la gravité de l'AAA chez les personnes touchées.

Matériaux et méthodes

Réactifs et biomolécules

La streptavidine, le 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) et la solution tampon phosphate (PBS) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich, USA. L'éthanolamine a été achetée auprès de Fisher Scientific, Royaume-Uni. Tous les oligos ont été synthétisés commercialement par Apical Scientific Sdn. Bhd., Malaisie.

Conception de motifs sur un masque chromé

Initialement, le motif du capteur diélectrique a été conçu à l'aide du logiciel AutoCAD. Les dimensions souhaitées étaient une longueur de 7 500 m, une largeur de 4 100  μm, 20 paires d'écartement des doigts, une taille d'écart de 85  μm, une taille d'électrode de 100 m, une épaisseur d'électrode de 40  nm et une longueur de doigt de 4 000  μm. Le motif a été imprimé sur un photomasque vierge et collé sur la surface du verre chromé. Ce verre chromé a été fixé sous un système d'exposition aux UV pour la procédure de transfert de motif. Un substrat de dioxyde de silicium déposé avec un film mince d'aluminium a été placé dans la direction opposée contre le verre chromé et exposé à la lumière UV pendant 10 s. Le motif a été transféré suivi du processus de développement à l'aide du développeur de résine.

Fabrication de l'électrode interdigitée

L'électrode de surface a été produite via un procédé de fabrication microélectronique conventionnel pour fabriquer la surface comme suit :(i) Une plaquette de 4 pouces avec de l'oxyde natif existant a été préparée. (ii) La plaquette a été nettoyée à l'aide d'une gravure à l'oxyde tamponné (BOE) et d'une solution de piranha pour éliminer l'oxyde natif et les contaminants inorganiques. (iii) Une couche d'oxyde d'une épaisseur de 2 800  a été développée via une heure d'oxydation thermique humide à une température de 1 000 °C. (iv) La plaquette avec la couche d'oxyde a été divisée en quatre pour une meilleure manipulation. (v) La couche métallique a été déposée avec l comme couche d'adhésion pour la couche conductrice. La couche d'aluminium (40 nm) a été produite à 3 cm de long avec un diamètre de 0,5 mm via une méthode de dépôt physique basée sur un évaporateur thermique, (vi) Une couche de résine photosensible positive était une couche de centrifugation sur le substrat, (vii) La plaquette a été cuit doux à 90 °C pendant 60 s. (viii) La plaquette a été alignée avec un masque chromé et exposée à la lumière UV pendant 10 s. (ix) La plaquette a été rincée dans une solution de développement RD6 dans les 15 s pour éliminer la zone non exposée, ce qui a donné le motif d'électrodes interdigitées (IDE) avec de l'oxyde. (x) La plaquette a été cuite à 90 °C pendant 120 s. (xi) La plaquette a été gravée à l'eau régale pour éliminer la zone exposée des deux couches. (xii) Le motif de surface a été produit et la résine photosensible restante a été lavée à l'aide d'acétone. Ensuite, une analyse par nanoprofilométrie 3D (Hawk 3D-profilometric, USA) a été réalisée pour observer l'image nette des espaces entre les électrodes. Les mesures de courant (A) ont été effectuées en utilisant Keithley 6487 avec un balayage linéaire de 0 à 2 V au pas de 0,1 V (à 20 s).

Fonctionnalisation chimique de surface :stratégie tétravalente streptavidine-biotine

Pour la fonctionnalisation chimique de surface, la surface de silice a d'abord été soigneusement lavée avec de l'hydroxyde de potassium 1 M (pH 9,0) pour activer la surface. Cette surface a été encore modifiée par CDI (0,5 M) avec une période d'incubation de 1 h pour réagir avec 100 nM de streptavidine (pendant 1 h), diluée à partir du stock d'origine dans 10 mM de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4). Suite à cette étape, les espaces n'ayant pas réagi ont été bloqués à l'aide d'éthanolamine 1 M (pendant 1 h). Ensuite, la streptavidine tétravalente a été mise à réagir avec 1 μM de sonde biotinylée miARN-335-5p (pendant 10 min) à température ambiante. À la fin de chaque modification, la surface a été soigneusement lavée avec du PBS, sauf indication contraire.

Conception de la sonde et des séquences cibles à partir de miRNA-335-5p

Le miARN pleine longueur-335-5p (5′-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3′) avec le code d'accession MIMAT0000765, a été collecté à partir de la banque de données. La région souhaitée pour cette étude comme cible est 5′-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3′. Pour capturer la région miRNA-335-5p cible, la sonde a été conçue comme 5′-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3′. À l'extrémité 3', la biotine a été marquée pour interagir avec la streptavidine immobilisée sur la surface de détection. La structure secondaire du miARN-335-5p pleine longueur a été prédite par le logiciel en ligne mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).

Interactions sonde-cible :séquences miRNA-335-5p

Lors de la liaison de la sonde biotinylée à la surface de la streptavidine comme détaillé ci-dessus, la séquence miARN-335-5p cible a interagi (pendant 10 min) à température ambiante de la faible concentration femtomolaire à la faible concentration nanomolaire. Ces concentrations allaient de 1 fM à 1 nM avec des dilutions en série de 10 fois dans du PBS. Les attachements ont été testés indépendamment des concentrations les plus faibles aux plus élevées, et lors de la formation du duplex, la surface a été lavée avec des volumes 5 fois de PBS, et des mesures ont été prises.

Mesures I-V

Les caractérisations électriques ont été effectuées par des mesures I-V à l'aide d'un Picoampèremètre Keithley 6487 avec une alimentation en tension/courant. Les mesures ont été enregistrées aux volts précités sur la surface nue puis sur chaque surface une modification chimique. De même, pour l'analyse interactive entre la sonde et le miARN-335-5p cible à chaque concentration, la mesure a été réalisée après l'étape de lavage avec 10 volumes de réaction. Toutes les modifications, interactions et mesures ont été maintenues dans des conditions humides, sauf indication contraire.

Résultats et discussion

Fabrication du capteur IDE et analyse de surface

L'étude actuelle a utilisé le miARN-335-5p comme outil pour élucider la gravité de l'AAA par analyse interactive sur un capteur à électrodes interdigitées (IDE) (Fig. 1). Pour l'analyse interactive avec la sonde et la cible conçue à partir de toute la longueur du miARN-335-5p, une surface IDE a été conçue et fabriquée à l'aide de techniques photolithographiques conventionnelles. Des modifications de surface étape par étape ont été réalisées et mesurées par un ampèremètre (Fig. 2b, c). L'alignement du masque conçu pour la fabrication de l'IDE et l'uniformité ont été confirmés par une analyse nanoprofilométrique 3D haute résolution. Cette observation a confirmé que la fabrication et la distance entre chaque doigt étaient bien alignées (Fig. 2d). Les IDE ont une taille d'électrode d'environ 100  μm avec un espacement d'environ 85  μm, et un grand réseau intercalé avec des millions de biomarqueurs en série/parallèle est formé. Pour assurer le succès des IDE fabriqués, nous avons utilisé différents dispositifs nus pour déterminer la reproductibilité sous le système diélectrique. Ce système mesure les vibrations moléculaires entre les diélectrodes causées par le moment dipolaire (Fig. 2c). Cet IDE diélectrique est un système bien accepté qui a été largement utilisé pour différentes analyses biomoléculaires et chimiques [15, 25, 26, 27, 28]. Dans cette étude, toutes les modifications chimiques de surface et les analyses interactives ont été mesurées par le mode courant I-V.

Représentation de la détection de miARN-335-5p sur un IDE. La sonde et la cible conçues sont affichées avec la formation en duplex sur la surface IDE

Mesures de surface sur un IDE. un Étapes de mesure. b Mode de mesure. Le modèle IDE et le système de connexion sont affichés. Une mesure diélectrique est également affichée. c Mécanisme de surface pendant la mesure. Un moment dipolaire est représenté. d Le profil de profilométrie 3D de l'IDE fabriqué

Assemblage moléculaire de surface haute densité :stratégie streptavidine-biotine

Les fixations moléculaires à haute densité sur la surface de détection ou les biopuces se sont avérées cruciales et dépendent fortement de la fonctionnalisation de la surface [29, 30]. Cette étude visait à déterminer la surface appropriée nécessaire pour un nombre élevé d'accommodations moléculaires, ce qui est obligatoire pour l'expression génique, la découverte et l'analyse moléculaire. Pour ces applications potentielles, la génération de surfaces de systèmes analytiques nécessite le bon couplage des molécules pour les immobiliser dans des formats appropriés. Ces surfaces matérielles ont été étudiées pour étudier le mécanisme interactif de surface, car elles sont bon marché et fournissent des degrés variés de densités de tassement, de morphologie et d'épaisseur. Cette découverte facilitera la bonne fixation des molécules et empêchera la perte d'activité biomoléculaire. De plus, la bonne orientation de l'immobilisation biomoléculaire est conservée avec une confirmation structurelle secondaire appropriée.

Pour obtenir des molécules à haute densité sur la surface, nous avons d'abord soigneusement lavé la surface de silice avec une solution alcaline et l'avons modifiée par CDI. Pour capturer des niveaux élevés de sondes de biotinylation sur la surface CDI, nous avons immobilisé la sonde avec de la streptavidine. La streptavidine est une protéine tétravalente avec quatre sites pour se lier à la biotine et est considérée comme une molécule de haute affinité dans les sciences biologiques [31, 32]. La surface de l'IDE avait un niveau actuel de 2,08E− 10 A, et après la fixation du CDI, elle a été augmentée à 9,2E− 06 A.Ce résultat indique clairement que la surface de l'IDE modifiée par CDI est appropriée pour nos analyses. Lorsque la streptavidine a été ajoutée, le niveau actuel a encore augmenté à 2,36E- 05 A. En utilisant cette stratégie, nous avons immobilisé un nombre plus élevé de sondes biotinylées conçues à partir de miARN-335-5p pleine longueur sur la surface IDE (Fig. 3a). Des interactions de biotine ont été réalisées après l'étape de blocage sur la surface de l'IDE pour masquer les zones n'ayant pas réagi. A chaque modification de surface, les changements du courant ont été déterminés (Fig. 3b). Comme le montre la figure 3c, après l'ajout d'éthanolamine, les changements de courant étaient de 2,53E- 05 A, et lorsque 1 nM de séquence de capture biotinylée a été ajouté, le niveau du courant a été diminué à 1,29E- 08 A. le courant a confirmé l'immobilisation de la sonde de capture sur la surface de détection IDE. Généralement, un oligonucléotide simple brin porte une charge plus négative avec le squelette phosphate 5-carbonaté exposé (sonde), tandis que la charge nette d'éthanolamine est neutre, comme indiqué par le fournisseur. Cette grande différence de charge a entraîné une variation apparente du courant mesuré, comme le montre la figure 3c. En outre, ce paramètre a été à nouveau inversé lors de la formation du duplex avec le brin cible. Cette découverte est due à la réduction de l'exposition du squelette phosphate, et les charges positives supplémentaires proviennent des nucléobases dans le brin miARN (Fig. 4a).

un Structure secondaire prévue de miARN-335-5p. Le miARN-335-5p pleine longueur est affiché avec les régions de tige et de boucle. La région cible sélectionnée pour l'analyse interactive est indiquée. b Mesures I-V sur l'IDE pour les modifications chimiques et biologiques de surface (cercle noir, nu; cercle rouge, CDI; cercle bleu foncé, streptavidine; cercle vert, éthanolamine). L'encadré de la figure est représenté schématiquement. c Mesures I-V sur l'IDE pour la fixation de la sonde. (cercle vert, éthanolamine; cercle rouge foncé, sonde). L'image de la complication AAA est présentée dans l'encadré de la figure

Analyse interactive de la sonde et de la cible. un Interaction à plus forte dose de la sonde et du miARN-335-5p (cible). (cercle rouge foncé, sonde; cercle noir, cible). b Analyse dose-dépendante du miARN-335-5p. Test de la gamme femtomolaire inférieure à la gamme nanomolaire inférieure. (cercle rouge foncé, sonde; cercle orange, 1 fM; cercle bleu, 10 fM; cercle vert, 100 fM; cercle violet, 1 pM; cercle rose, 10 pM; cercle bleu clair, 100 pM; cercle noir, 1 nM)

Analyse interactive dose-dépendante sur l'IDE

Lors de la fixation de la sonde biotinylée sur la surface de détection, l'analyse interactive de la cible a été réalisée avec différentes doses. Cette validation a été effectuée de la gamme basse femtomolaire à la gamme basse nanomolaire. Pour garantir cette plage, nous avons effectué l'analyse préliminaire avec 1 nM de séquences cibles de miARN-335-5p. Après ajout de 1 nM de la séquence miARN-335-5p cible sur la surface modifiée par sonde de capture, le niveau de courant est passé de 1,29 E− 08 A à 1,29E− 07 A (Fig. 4a) ; ce résultat indiquait que l'hybridation s'était produite entre la sonde de capture et la séquence cible. Après cette confirmation, pour déterminer la limite de détection, nous avons titré la séquence cible de 1 fM à 1 nM, qui a chuté indépendamment sur les surfaces modifiées par la sonde de capture. Les changements actuels ont été détectés avant et après l'immobilisation. Les différences de courant pour les hybridations 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM et 1 nM étaient respectivement de 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 et 11,61E- 08 A. Sur la base des résultats obtenus, des changements de courant dose-dépendants clairs ont été détectés dans toutes les concentrations testées de la séquence cible (Fig. 4b).

Haute performance analytique :sensibilité, spécificité et reproductibilité

Sur la base des résultats ci-dessus avec des incréments dépendants de la concentration, une analyse de régression linéaire a été réalisée. La sensibilité de la détection a été estimée à l'aide du calcul 3σ, et elle est tombée à 1 fM (Fig. 5a, b). La concentration était inférieure à 1 µfM, montrant le signal de fond et des valeurs inférieures. En outre, une analyse de spécificité a été effectuée pour discriminer les séquences cibles des séquences non complémentaires et à mésappariement simple et triple. Il était évident que la sonde conçue présentait une réaction plus forte avec les séquences complémentaires miARN-335-5p parfaites que les autres séquences (Fig. 6a). Une séquence à mésappariement unique a entraîné une réponse en courant plus élevée que les séquences non complémentaires et à mésappariement triple en raison de la formation de duplex partiel par la séquence à mésappariement unique sur la séquence sonde. Des analyses de reproductibilité ont été effectuées avec toutes les modifications chimiques et biologiques sur la surface de l'IDE en triple, et les données ont été moyennées. Les données moyennes indiquent qu'il n'y a eu aucun changement significatif lorsque les différentes expériences ont été réalisées (Fig. 6b). De plus, pour soutenir les performances de l'IDE, les caractéristiques des méthodes actuellement disponibles ont été comparées (tableau 1).

Dépendance à la dose. un Interaction dose-dépendante du miARN-335-5p avec la sonde. b Analyse de régression linéaire avec différentes concentrations de miARN-335-5p. La LOD était considérée comme la concentration la plus faible d'un analyte par rapport au signal de fond (S/N =3:1)

Analyse performante. un Analyse de spécificité. Les séquences cibles ont été discriminées des séquences non complémentaires et à mésappariement simple et triple. b Test de reproductibilité. Les valeurs moyennes sont affichées avec des expériences en triple

Conclusions

Le développement d'une méthode analytique utilisant des biomarqueurs biologiques aide au diagnostic d'AAA lors d'examens physiques. Dans la recherche actuelle, la détection médiée par le miARN-335-5p pour prédire la gravité de l'AAA a été développée, car le miARN-335-5p s'est avéré être exprimé avec l'AAA. La sortie de la détection IDE générée affichait des niveaux de détection inférieurs à supérieurs pour faciliter la prédiction de la gravité de l'AAA. Le niveau de détection inférieur était de 1 µfM avec une spécificité et une reproductibilité élevées pour l'analyse haute performance. La méthode streptavidine-biotine tétravalente utilisée dans cette recherche a donné un bon résultat et peut être utilisée pour d'autres analyses de biomarqueurs.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données sont entièrement disponibles sans restriction.

Abréviations

AAA :

Anévrisme de l'aorte abdominale

CDI :

1,1′-Carbonyldiimidazole

PBS :

Solution tampon phosphate

IDE :

Électrode interdigitée

UV :

Ultraviolet