Nanoparticules hybrides magnétiques à nanocoquilles d'or fonctionnalisées par Her2 :un agent théranostique pour l'imagerie bimodale et la thérapie photothermique du cancer du sein

Résumé

La plate-forme théranostique ciblée qui intègre l'imagerie multimodale et la fonction thérapeutique apparaît comme une stratégie prometteuse pour la détection précoce et le traitement précis du cancer. Ici, nous avons conçu des nanoparticules hybrides magnétiques ciblées en poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) portant des anticorps anti-récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (Her2) (Her2-GPH NPs) pour l'échographie bimodale (États-Unis) /Imagerie par résonance magnétique (RM) et thérapie photothermique du cancer du sein. L'agent a été fabriqué en enrobant une nanoshell d'or autour de nanoparticules de PLGA co-chargées avec du bromure de perfluorooctyle (PFOB) et des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO), suivi d'une conjugaison avec des anticorps anti-Her2. Des études de ciblage cellulaire ont démontré une liaison spécifique médiée par le récepteur de l'agent aux cellules SKBR3 de cancer du sein humain Her2-positives, et son taux de liaison était significativement plus élevé que celui des cellules Her2-négatives (P < 0,001). In vitro, l'agent avait des capacités pour l'imagerie américaine à contraste amélioré ainsi que T ₂ -IRM pondérée avec une relaxivité relativement élevée (r ₂ = 441,47 mM⁻¹ s⁻¹ ). De plus, la fonctionnalisation Her2 de l'agent a fortement amélioré l'effet d'imagerie moléculaire US/MR des cellules ciblées par liaison spécifique à la cellule. Le dosage des cellules vivantes/mortes et des expériences de cytotoxicité photothermique ciblées ont confirmé que les NP Her2-GPH pourraient servir de photoabsorbeurs efficaces pour induire spécifiquement la mort des cellules SKBR3 lors d'une irradiation laser dans le proche infrarouge. En résumé, il a été démontré que les NP Her2-GPH sont de nouveaux agents théranostiques ciblés avec un grand potentiel pour faciliter le diagnostic précoce non invasif et le traitement adjuvant du cancer du sein.

Introduction

Le cancer du sein est la principale cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde [1]. La clé pour réduire efficacement la mortalité par cancer du sein est un diagnostic précoce et précis [2]. Malgré les avancées des dernières décennies, les stratégies diagnostiques et thérapeutiques actuelles ont encore des limites dans la détection précoce et le traitement précis du cancer du sein [3]. Par conséquent, il est nécessaire d'exploiter de nouvelles stratégies créatives pour le cancer du sein aux stades précoces et subcliniques.

La théranostic, qui implique la combinaison d'approches diagnostiques et thérapeutiques au sein d'une même plateforme, devrait jouer un rôle important dans l'avancement de la médecine personnalisée [4]. Généralement, les agents théranostiques intègrent l'imagerie moléculaire et la fonction thérapeutique dans une seule nanoparticule, étant donné le potentiel de surveiller et de traiter simultanément le cancer du sein au niveau cellulaire ou moléculaire [5]. En clinique, l'échographie (US) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) sont les deux méthodes couramment utilisées pour le diagnostic et la stadification du cancer du sein [6]. L'imagerie américaine montre les avantages d'une sécurité élevée, d'une mesure en temps réel et d'une disponibilité immédiate, et l'échographie à contraste amélioré (CEUS) a amélioré la sensibilité et la spécificité dans la détection des lésions mammaires [7]. Mais l'application de l'imagerie américaine est encore limitée à une résolution spatiale et anatomique relativement limitée. L'IRM pourrait fournir une image avec une excellente résolution spatiale et un contraste des tissus mous, tout en souffrant d'un temps d'imagerie relativement long et d'une sensibilité limitée [8, 9]. Il est donc important de combiner les capacités de l'échographie et de l'IRM pour fournir des informations plus complémentaires, synergiques et précises sur le cancer du sein [10]. De plus, la chirurgie et la chimiothérapie adjuvante sont les principaux traitements du cancer du sein, mais elles comportent également des inconvénients tels que des complications graves et une résistance accrue à plusieurs médicaments. La thérapie photothermique (PTT) utilisant des lasers et des photoabsorbeurs dans le proche infrarouge (NIR) a récemment suscité un intérêt généralisé en tant qu'alternative efficace aux traitements conventionnels en raison de son caractère peu invasif et de sa bonne contrôlabilité [11, 12]. Par conséquent, il sera très utile de combiner l'imagerie US/MR et PTT en une seule plate-forme pour réaliser une ablation photothermique guidée et surveillée par imagerie bimodale du cancer du sein.

Récemment, la préparation de nanomatériaux a fait des progrès significatifs dans les applications potentielles de la théranostique du cancer. Comme nous le savons tous, en raison de sa biocompatibilité et de sa biodégradabilité exceptionnelles, les nanostructures à base de poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) ont été largement étudiées pour une utilisation dans les systèmes d'administration de médicaments et l'imagerie moléculaire [13, 14]. Le bromure de perfluorooctyle (PFOB), un perfluorocarbure liquide (PFC), a été encapsulé dans des coques polymères telles que le PLGA pour développer de nouveaux agents de contraste pour ultrasons (UCA) en raison de sa solubilité élevée dans l'oxygène, de son hydrophobie et de sa lipophobie [15, 16]. De plus, les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO) ont reçu une grande attention en tant que sondes moléculaires MR pour obtenir des informations anatomiques dans les organismes vivants en raison de leur grande biocompatibilité et de leur excellente amélioration du contraste [17,18,19].

Les nanostructures en or (Au) sont une autre nanoplate-forme prometteuse, qui sont largement utilisées dans les recherches biologiques et médicales en raison de leur bonne biocompatibilité et de leurs propriétés optiques et électriques uniques [20]. Le nanoshell d'or, un type de nanomatériaux d'or sphériques, a montré une absorption significative par résonance plasma de surface (SPR) dans la région NIR, permettant leur utilisation dans le PTT pour tuer sélectivement les cellules cancéreuses sans affecter les cellules saines environnantes [21]. Il a également été rapporté que des microcapsules de PLGA recouvertes de nanocoquilles d'Au pourraient être utilisées pour l'imagerie moléculaire américaine [22]. De nombreuses études se sont concentrées sur la combinaison de nanoshell Au et de polymère en tant que « structure shell-core » pour la théranostic du cancer. Ke et al. ont développé une série d'agents théranostiques à base de microcapsules de poly (acide lactique) à nanocoquilles d'Au pour l'imagerie multimodale et le PTT [23, 24]. Lu et al. préparé des nanocoquilles d'or polymères chargées de doxorubicine pour l'imagerie fluorescente et la photothermo-chimiothérapie du cancer [25]. Cependant, un problème courant auquel sont confrontées ces NP est le manque de ligands de liaison à haute affinité à la surface, ce qui entraîne leur incapacité à reconnaître ou à se lier à des cellules ciblées spécifiques avec une spécificité élevée pour maximiser les effets diagnostiques et thérapeutiques. De plus, à notre connaissance, peu d'études ont été consacrées à l'investigation d'une nanoplateforme hybride PLGA à nano-enveloppe ciblée pour le diagnostic collaboratif bimodal et le PTT du cancer du sein.

Parmi les cibles moléculaires envisagées pour le cancer du sein jusqu'à présent, le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (Her2), une tyrosine kinase liée à la surface de la membrane cellulaire, est le plus souvent utilisé comme biomarqueur important pour la localisation et l'identification du cancer du sein [26, 27 ]. Elle est surexprimée dans environ 25 à 30 % des cancers du sein primitifs humains associés à une agressivité tumorale, un taux de récidive élevé et un mauvais pronostic [28, 29]. Par conséquent, la fabrication d'un agent théranostique ciblé sur Her2 est un domaine florissant pour améliorer la détection précoce et le traitement du cancer du sein.

Dans notre étude, l'idée de base est de développer des NP hybrides magnétiques à nanocoquilles d'or fonctionnalisées Her2 (NPs Her2-GPH) qui intègrent l'imagerie US/MR bimodale et la PTT, dédiées au diagnostic précoce et au traitement précis du cancer du sein. L'agent a été construit en encapsulant du PFOB et des SPIO dans des NP PLGA, puis en revêtant des nanocoquilles d'or sur la surface, puis en les conjugant avec des anticorps anti-Her2 (Fig. 1). On s'attend à ce que l'accumulation suffisante de l'agent dans les cellules SKBR3 du cancer du sein Her2-positives puisse être obtenue par la spécificité de ciblage médiée par les anticorps et la taille nanométrique de l'agent. La présente étude a également été conçue pour vérifier la faisabilité de l'utilisation de l'agent en tant que sonde moléculaire bimodale pour fournir une imagerie par contraste US/MR in vitro, ainsi que l'effet PTT ciblé des cellules cancéreuses du sein induit par l'Au absorbé dans le NIR. nanocoquilles.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA, acide carboxylique terminé, lactide :glycolide 50:50, Mw 24 000–38 000), chlorhydrate de polyallylamine (PAH, Mw 17 500) et acide tétrachloroaurique (III) trihydraté (HAuCl₄ ·3H₂ O) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques recouvertes d'acide oléique (OA-SPIO) d'un diamètre moyen de 10 nm ont été achetées auprès de Shanghai So-Fe Biomedicine Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Bromure de perfluorooctyle (PFOB), alcool polyvinylique (PVA, 87 à 89 % en moles hydrolysé, faible poids moléculaire), chlorhydrate de 1-(3-dime-thylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC) et N -hydroxysuccinimide (NHS) ont été obtenus auprès d'Aladdin Chemistry Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Le poly (éthylène glycol) à terminaison carboxyle (SH-PEG-COOH, Mw 2000) et l'anticorps anti-Her2 marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ont été obtenus auprès de Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Chine ) et Abcam (Cambridge, MA, USA), respectivement. Tous les autres réactifs utilisés étaient de qualité analytique.

Préparation des NP PFOB/SPIOs@PLGA

Les NP PFOB/SPIOs@PLGA ont été fabriquées en utilisant une méthode d'évaporation de solvant en émulsion huile/eau adaptée [24, 30]. En bref, des SPIO enrobés d'acide oléique dans de l'hexane (0,5 µmL, 20 µg/mL) ont été ajoutés à du chlorure de méthylène (3,6 µmL) en dissolvant du PLGA (100 µmg) et du PFOB (60 µL). La phase organique résultante a été ajoutée goutte à goutte à une solution aqueuse de PVA prérefroidie (20 mL, 2 %, w /v ). Par la suite, le système a été émulsifié pendant 2 min à l'aide d'une sonication par sonde dans un bain d'eau glacée sous un réglage d'amplitude de sortie de 80 %. Ensuite, l'émulsion a été agitée à température ambiante pendant 5 h, puis centrifugée (16 000 rpm, 5 min, 15 °C, Avanti J-25, Beckman Coulter) et lavée deux fois avec de l'eau déminéralisée (DI) pour obtenir PFOB/SPIOs@ NP PLGA.

Préparation des PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs

Tout d'abord, des NP d'or stabilisées au citrate d'un diamètre moyen de 5 nm ont été préparées comme précédemment rapporté [21]. Pendant ce temps, la suspension PFOB/SPIOs@PLGA NPs (1 mL) a été mélangée dans une solution de PAH (1,0 mg/mL dans 0,5 mol/L de solution aqueuse de NaCl) pendant 30 min, suivie d'une centrifugation (15 000 rpm, 10 min, 15 °C ) et laver deux fois avec de l'eau déminéralisée. Ensuite, le mélange a été ajouté dans une suspension de NPs d'or stabilisée au citrate (100 ml) et agité pendant 30 min. Après des étapes répétées de centrifugation/lavage, les NPs Au résultantes recouvertes de PFOB/SPIOs@PLGA NPs ont été redispersées dans HAuCl₄ solution (2 mL, 1% w /v ) sous agitation magnétique. Ensuite, une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine fraîchement préparée (NH₂ OH·HCl, 0.3 mL, 0.5 mol/L) a été ajouté pour réduire HAuCl₄ pour former des nanocoquilles d'Au à la surface des NP PFOB/SPIOs@PLGA.

Préparation des NP Her2-GPH

La solution aqueuse préparée de PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs (1 mL, 1 mg/mL) a été mélangée avec SH-PEG-COOH (5 mg) et agitée à température ambiante pendant 12 h. Après centrifugation (16 000 tr/min, 20 min, 15 °C) et deux lavages, le précipité a été dispersé dans du tampon phosphate salin (PBS). Ensuite, EDC (10 mg) et NHS (10 mg) ont été introduits et agités à température ambiante pendant 2 h pour activer les groupes acide carboxyle des NPs pégylées, et les NPs activées (GPH NPs) ont ensuite été obtenues par centrifugation/lavage répétés. pas. Ensuite, des anticorps anti-Her2 marqués au FITC (10 μL, 0,38 mg/mL) ont été ajoutés aux dispersions de NP activées et laissés à incuber pendant 90 min dans un agitateur isotherme. Enfin, les anticorps libres ont été éliminés par des étapes de centrifugation/lavage pour obtenir des NPs Her2 fonctionnalisés PFOB/SPIOs@PLGA@Au (Her2-GPH NPs).

Caractérisations

La structure de surface et la morphologie des NP Her2-GPH ont été caractérisées par microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM, Hitachi S-4800, Tokyo, Japon). Un microscope électronique à transmission à haute résolution (MET, JEM-2100 ; JEOL, Tokyo, Japon) a été utilisé pour confirmer la structure interne de celui-ci en trempant un échantillon sur des grilles de Cu revêtues de carbone. La spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDS) correspondante de l'échantillon (sans processus de pulvérisation d'or) a été attachée au MET pour analyser la composition élémentaire des NP résultantes. La taille hydrodynamique et le potentiel zêta des NP Her2-GPH ont été mesurés à l'aide d'un instrument de diffusion laser dynamique (DLS) (Zetasizer Nano ZS3690; Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). Les spectres d'absorption UV-visible de l'agent à différentes étapes de préparation ont été obtenus avec un spectrophotomètre UV-visible (Beckman Coulter DU 730, USA). La quantité d'éléments Au et Fe dans les NP Her2-GPH a été évaluée par spectroscopie d'émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES, Vistampxicp Varian, États-Unis).

Mesure de la performance photothermique

Les performances photothermiques des NP Her2-GPH ont été évaluées en surveillant l'augmentation de la température sous irradiation laser NIR. Différentes concentrations de solutions aqueuses de Her2-GPH NPs (50, 100, 150, 200 μg/mL) ont été irradiées par un laser 808 nm (1 W/cm² ) pendant 10 min dans des cuvettes en quartz (volume total de 1 mL), et la température des solutions a été mesurée par une caméra thermique FLIR A300 toutes les 10 s. Afin d'évaluer la stabilité photothermique de l'agent, les spectres d'absorption des matériaux ont été acquis avant et après le processus d'irradiation. L'eau DI a été irradiée dans les mêmes conditions à des fins de comparaison.

Culture cellulaire

La lignée cellulaire SKBR3 de carcinome du sein humain (cellules SKBR3) surexprimant Her2 et la lignée cellulaire MDA-MB-231 de cancer du sein humain (cellules MDA-MB-231) exprimant faiblement Her2 provenaient de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire (Shanghai, Chine). Ils ont été cultivés dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, USA) contenant 20 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Toutes les cellules ont été cultivées à l'environnement de 37 °C et 5% CO₂ .

Dosage de cytotoxicité in vitro

La cytotoxicité in vitro des NP Her2-GPH a été évaluée par des tests du kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Japon) sur des cellules SKBR3 et MDA-MB-231. Les deux types de cellules ont été ensemencées respectivement dans des plaques 96 puits à une densité de 1 × 10⁴ par puits et incubé pendant 24 h. Après avoir retiré le milieu de culture, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations (0, 10, 20, 50, 100, 200 µg/mL) de Her2-GPH NPs et encore incubées pendant 12 ou 24 µh. Ensuite, la solution de CCK-8 (10 μL de CCK-8 dans 100 μL de DMEM) a été ajoutée et incubée pendant 2 h supplémentaires. Enfin, la densité optique (DO) de chaque puits a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Thermo Scientific Multiskan MK3) à la longueur d'onde de 450 nm.

Études de ciblage spécifiques aux récepteurs in vitro

Microscopie confocale à balayage laser

Les cellules SKBR3 et MDA-MB-231 ont été étalées dans des boîtes de culture cellulaire à fond de verre (Φ = 20 mm) à une densité de 2 × 10⁴ cellules/puits pendant 24 h, puis ils ont été divisés en trois groupes, respectivement, comprenant un groupe non ciblé, un groupe ciblé et un groupe d'inhibition ciblé. Deux types de cellules en tant que groupe non ciblé ont été traités avec 100 L de NP GPH, et les cellules du groupe ciblé ont été traitées avec 100 L de NP Her2-GPH. Dans les groupes d'inhibition ciblés, les cellules ont été incubées avec des anticorps anti-Her2 libres (20 μL) pendant 30 min avant d'être traitées avec des NP Her2-GPH. Après une incubation respective de 30 min, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min. Ensuite, les cellules ont été colorées avec un agent de coloration de noyau (DAPI; Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Chine) pendant 10 min et lavées à nouveau avec du PBS. Enfin, les cellules ont été observées à l'aide d'une microscopie confocale à balayage laser (LSCM) (Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems Ltd., Mannheim, Allemagne).

Cytométrie en flux

Les cellules SKBR3 et MDA-MB-231 ont été cultivées et traitées comme décrit ci-dessus, et les groupements étaient cohérents avec le test LSCM. Toutes les cellules ont été digérées avec de la trypsine puis remises en suspension dans du PBS avant cytométrie en flux (FCM) avec une densité de 2 × 10⁵ cellules par tube. L'intensité de fluorescence des cellules a été déterminée par un cytomètre en flux (FC500MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Des cellules SKBR3 et MDA-MB-231 ont été utilisées comme témoins à blanc pour régler les portes. Ensuite, la tension et la compensation de fluorescence de FL1 ont été ajustées pour s'assurer que la fluorescence spontanée des cellules était dans les 10¹ de l'histogramme de fluorescence. Après incubation des cellules avec les NP, les écarts de l'intensité de fluorescence des groupes témoins reflétaient le taux de liaison des NP aux cellules. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Imagerie américaine in vitro et analyse quantitative

Imagerie échographique en solution in vitro

L'imagerie par ultrasons en solution in vitro des NP Her2-GPH a été réalisée à l'aide de l'unité Mylab Twice Ultrasound System (Esaote SpA, Gênes, Italie). Les NP Her2-GPH ont été dispersées dans de l'eau dégazée dégazée à différentes concentrations (0,1, 0,5, 1, 1,5, 2 mg/mL) et injectées dans un tube Eppendorf (2 mL), puis le tube a été immergé dans un réservoir d'eau ultrapure. L'échographie a été réalisée à l'aide du transducteur LA522 à la fois en mode d'échelle de gris bidimensionnel (2D) et en mode de contraste amélioré selon les paramètres suivants :l'indice mécanique (MI) = 0,01 et la plage de fréquence était de 3 à 9 MHz. Les images ont été acquises à partir de la coupe longitudinale du tube et enregistrées pour une analyse quantitative de la courbe temps-intensité (TIC) à l'aide du logiciel QontraXt V3.06.

Imagerie américaine ciblée des cellules du cancer du sein

Les cellules SKBR3 et les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées dans des plaques 6 puits à une densité de 2 × 10⁶ /puits pendant 24 h, et ils ont été divisés en trois groupes, y compris le groupe témoin, le groupe non ciblé et le groupe ciblé. Les cellules du groupe non ciblé et du groupe ciblé ont été traitées avec des NP GPH (100 g/mL) et des NP Her2-GPH (100 μg/mL) pendant 30 min, respectivement. Par la suite, les cellules ont été lavées avec du PBS, digérées et redispersées dans des tubes à essai avec du PBS (0,5 µmL). Des gels d'agarose (1 %) ont été préparés dans des boîtes en verre de 20 ml. Pour simuler l'effet d'imagerie ultrasonore ciblé des NP sur la surface cellulaire, les suspensions cellulaires dans les six groupes de tubes à essai ont été extraites séparément avec des seringues de 1 ml et injectées lentement dans le gel d'agar. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un transducteur SL3116 en mode niveaux de gris (gain = 70%; fréquence centrale = 22 MHz; MI = 0,06). Après la numérisation, la région d'intérêt (ROI) dans chaque groupe d'images échographiques a été dessinée. La valeur en niveaux de gris de chaque retour sur investissement a été analysée quantitativement à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images (DigSubAna ; Université Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, Chine) pour évaluer l'effet d'imagerie ultrasonore ciblé des NP Her2-GPH.

Imagerie IRM in vitro et analyse quantitative

T ₂ Mesure et imagerie par résonance magnétique des NP Her2-GPH

L'imagerie par résonance magnétique des NP Her2-GPH et des mesures de relaxivité ont été effectuées à l'aide d'un système à 0,5 T (ration NM120-Analyst de Shanghai Niumag Corporation). Les NP Her2-GPH ont été suspendues dans de l'eau DI à diverses concentrations de Fe (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04, 0,08 mM) et T ₂ Les images IRM pondérées des échantillons ont été acquises en utilisant la séquence spin-écho (TR = 2000 ms; TE = 100 ms; épaisseur de coupe = 3 mm; FOV = 3 × 3 cm). Le temps de relaxation transverse (T ₂ ) des protons d'eau de la solution aqueuse de NPs a également été mesurée, et la relaxivité transversale (r ₂ ) a été déterminé par l'ajustement de courbe de 1/T ₂ (s⁻¹ ) versus la concentration de Fe (mM).

Imagerie IRM ciblée des cellules du cancer du sein

Les groupements et le traitement des cellules SKBR3 et MDA-MB-231 étaient cohérents avec le test d'imagerie américain ciblé. Après incubation avec des NPs GPH non ciblées (100 μg/mL) ou des NPs Her2-GPH ciblées (100 μg/mL) pendant 30 min, les cellules ont été lavées avec du PBS, digérées et dispersées dans de la gomme xanthane (1 mg/mL) . Tous les échantillons ont été scannés en utilisant une séquence spin-écho avec les mêmes paramètres que ceux décrits ci-dessus. Le retour sur investissement de chaque image a été défini pour une analyse quantitative de l'intensité du signal avec le logiciel Image J.

Évaluation PTT ciblée in vitro

Pour visualiser l'effet PTT ciblé des NP Her2-GPH, les cellules SKBR3 ont été étalées dans des boîtes de culture cellulaire à fond de verre (Φ = 20 mm) à une densité de 1 × 10⁵ cellules/puits pendant 24 h, et ils ont été divisés en cinq groupes respectivement, y compris les groupes témoins DMEM avec ou sans irradiation laser, les groupes de matériaux ciblés avec ou sans irradiation laser et les matériaux non ciblés avec irradiation laser. Les groupes ciblés ont été traités avec des dispersions DMEM contenant des NPs Her2-GPH (100 μg/mL) pendant 30 min et les groupes non ciblés ont été traités avec des NPs GPH (100 μg/mL) dans les mêmes conditions. Les cellules des groupes d'irradiation laser ont été irradiées avec un laser NIR (808 nm, 1 W/cm² ) pendant 10 min et encore incubé à 37 °C pendant 2 h. Ensuite, la viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant un kit d'analyse de cellules vivantes/mortes (Life Technologies, Grand Island, NY). Enfin, les images des cellules colorées ont été acquises avec un LSCM. Pour quantifier la cytotoxicité photothermique, les cellules SKBR3 (1 × 10⁴ par puits) ont été étalés dans des plaques à 96 puits et incubés pendant 24h. Les groupements étaient cohérents avec ce qui précède, et la viabilité cellulaire a été testée par dosage CCK-8. Évaluer davantage quantitativement la cytotoxicité photothermique des NP Her2-GPH sous différentes concentrations et irradiation laser. Les cellules ont été incubées avec des dispersions DMEM contenant des NP Her2-GPH de différentes concentrations (0, 50, 100, 150, 200 µg/mL). Après lavage au PBS (10 mM, pH 7,0), les cellules ont été irradiées par laser NIR (808 nm, 1 W/cm² ) pendant 10 min et encore incubé pendant 2 h. Ensuite, la viabilité cellulaire a également été déterminée par dosage CCK-8. Les résultats sont affichés sous forme de moyenne ± écart type (n = 4).

Pour simuler l'expression hétérogène de Her2 dans les tissus tumoraux du sein, nous avons co-cultivé des cellules SKBR3 et des cellules MDA-MB-231 dans différentes proportions (0 : 100 %, 25 : 75 %, 50 : 50 %, 75 : 25 %, 100 :0%). Toutes les cellules ont été traitées avec des NP Her2-GPH (200 μg/mL) pendant 30 min, et irradiées avec un laser NIR (808 nm, 1 W/cm² ) pendant 10 min. Après une incubation supplémentaire pendant 2 h, les viabilités cellulaires ont été analysées avec des tests CCK-8. Les résultats sont affichés sous forme de moyenne ± écart type (n = 4).

Analyse statistique

Les données quantitatives ont été exprimées comme la moyenne ± écart-type (moyenne ± SD). Les différences statistiques entre plusieurs groupes ont été déterminées par analyse de la variance (ANOVA), et les données de deux échantillons indépendants ont été comparées à l'aide du t de Student. test. P <0,05 a été considéré comme une différence statistiquement significative. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS v17.0 (IBM, Armonk, NY, USA).

Résultats et discussions

Caractérisations

Les NP PFOB/SPIOs@PLGA ont été fabriquées via le procédé d'évaporation de solvant en émulsion huile/eau. L'image SEM (Fig. 2a) a révélé que les NP PFOB/SPIOs@PLGA possédaient une morphologie sphérique uniforme et une surface lisse. Comme le montre le TEM (Fig. 2b), il y avait une différence évidente de densité électronique entre le noyau et la coque des NP PFOB/SPIOs@PLGA, suggérant l'encapsulation de PFOB à l'intérieur des NP. En outre, comme le montre l'image en médaillon à plus fort grossissement, la présence de SPIO a été démontrée sous forme de taches grises profondes dans la région centrale de la coque et du PFOB liquide des NP PFOB/SPIOs@PLGA. Le diamètre moyen des NPs PFOB/SPIOs@PLGA était d'environ 248,3 nm avec un indice de polydispersité de 0,037, et le potentiel zêta était d'environ - 14,7 mV selon la mesure DLS. Par conséquent, les NP PFOB/SPIOs@PLGA pourraient facilement absorber les HAP chargés positivement afin d'attacher par la suite des nanoparticules d'Au chargées négativement d'une taille moyenne de 5 à 7 nm, qui ont été utilisées comme graines pour nucléer la croissance de nanoshell d'or autour de la surface de PFOB. /SPIOs@PLGA NPs via la procédure d'amorçage.

Les NP Her2-GPH ont été préparées en liant des anticorps anti-Her2 aux NP PFOB/SPIOs@PLGA@Au via SH-PEG-COOH. Dans ce processus, la technologie classique du carbodiimide a été utilisée pour activer les groupes acide carboxylique des NP PEGylés PFOB/SPIOs@PLGA@Au et promouvoir la liaison covalente des groupes amino aux anticorps [31]. Comme illustré dans les images SEM et MET (Fig. 2c, d), les NP Her2-GPH maintenaient une morphologie sphérique bien définie avec une surface rugueuse, et des NP Au denses d'un diamètre de dizaines de nanomètres pouvaient être clairement vues à la surface de la NPs, qui ont indiqué la fabrication réussie des nanoshells d'or. La cartographie des éléments EDS (Fig. 2e) et les résultats de l'analyse des éléments (Fig. 3a) des NP Her2-GPH ont clairement révélé la grande quantité d'éléments Au et la présence d'éléments Fe, F et Br, indiquant l'encapsulation réussie des SPIO et PFOB et la formation de nanocoquilles d'Au. De plus, la teneur en éléments Au et Fe dans les NP Her2-GPH a été évaluée à 67,71 ± 7,34% en poids et 2,13 ± 0,52% en poids par ICP-AES, respectivement.

De plus, les spectres d'absorption UV-Vis des NP Her2-GPH à différentes étapes de préparation ont également été examinés (Fig. 3b). Les NPs PFOB/SPIOs@PLGA n'ont montré aucun pic d'absorption évident dans la plage de 400 à 800 nm tandis que les NPs Au présentaient un pic de résonance plasmatique à environ 520 nm. Les NP PFOB/SPIOs@PLGA@Au et les NP Her2-GPH présentaient un large pic continu allant de 600 à 900 nm (région NIR) en raison des graines Au attachées devenues suffisamment grosses au cours du processus d'ensemencement pour se regrouper. Le large spectre d'absorption dans la région NIR a permis aux NP Her2-GPH de fonctionner comme des photoabsorbeurs pour la thérapie photothermique NIR. De plus, par rapport aux NP PFOB/SPIOs@PLGA, les NP Her2-GPH avaient une distribution de taille accrue de 282,3 nm avec un indice de polydispersité de 0,18 (Fig. 3c). Et le potentiel zêta était de − 31,3 mV (Fig. 3d), ce qui implique la bonne stabilité de celui-ci.

Mesure de la performance photothermique

L'effet de conversion photothermique de la solution Her2-GPH NPs a été évalué sous l'irradiation du laser NIR (808 nm, 1 W/cm² ), et la variation de température a été surveillée avec une caméra thermique IR toutes les 10 s. Après 10 min d'irradiation laser, la couleur de l'imagerie thermique de différentes concentrations de solution de NP Her2-GPH a changé, ce qui signifie que la température augmentait avec l'augmentation de la concentration de NP Her2-GPH (Fig. 4a). La mesure de la température photothermique était cohérente avec les données d'imagerie. Il a pu être observé que la température de la solution de NP augmentait avec l'augmentation du temps d'exposition et de la concentration (Fig. 4b). Dans le détail, l'augmentation de température de la solution de Her2-GPH NPs était de 18,5 °C à la concentration de 0,2 mg/mL, alors qu'il n'y avait que 1,2 °C d'augmentation pour l'eau DI. Afin de tuer les cellules cancéreuses, la température devait être élevée jusqu'à la plage de température d'hyperthermie (40–47 °C) selon des études antérieures [32]. Cependant, en raison de la perte thermique in vitro, une augmentation de température d'environ 10 °C n'est pas suffisante pour induire la mort cellulaire [33]. Les NP Her2-GPH pourraient augmenter la température d'environ 18 °C à une concentration relativement faible, donnant ainsi le potentiel de tuer les cellules cancéreuses par hyperthermie. De plus, pour vérifier la stabilité photothermique des NP Her2-GPH, des spectres d'absorption UV-visible NIR des échantillons ont été collectés avant et après l'irradiation laser. Et les spectres d'absorption sont presque inchangés avant et après l'exposition au laser (Fig. 4c), garantissant que les NP Her2-GPH pourraient servir de photoabsorbeur efficace pour le PTT du cancer.

In Vitro Cytotoxicity Assay

It is well known that biocompatibility of NPs is one of the primary concerns in biomedical applications and should be determined first. Thus, CCK-8 assays were used to evaluate the cytotoxicity of Her2-GPH NPs in breast cancer MDA-MB-231 and SKBR3 cells, as shown in Fig. 5a and b. Compared with controls, the viability of Her2-GPH NPs-treated MDA-MB-231 and SKBR3 cells remained more than 90% at the concentration ranging from 10 to 200 μg/mL for 24 h, indicating the low cytotoxicity and good biocompatibility of the resulted NPs, which could ensure their safety for further cell experiments and clinical studies.

In Vitro Receptor-Specific Targeting Studies

Confocal Laser Scanning Microscopy

Fluorescein isothiocyanate (FITC) is widely used as green fluorescence probes for immune detection and it can easily bind several kinds of monoclonal antibodies. Thus, we choose FITC-labeled anti-Her2 antibody, and the connection of NPs with antibody could be observed more visually by immunofluorescence assay. To verify the binding of anti-her2 antibodies to GPH NPs, GPH NPs and Her2-GPH NPs were placed on dishes (Φ = 20 mm) for CLSM analysis. As illustrated in Fig. 6, both Her2-GPH NPs and GPH NPs could be clearly observed in bright field. GPH NPs showed no fluorescence signal, while Her2-GPH NPs exhibited bright green fluorescence in the FITC and merged channel, which confirmed the successful conjugation of anti-her2 antibody with GPH NPs.

We utilized LSCM to confirm the targeting specificity of Her2-GPH NPs in vitro. As can be seen from the Fig. 7, compared with non-targeted group (b), SKBR3 cells incubated with targeted Her2-GPH NPs (a) exhibited bright green fluorescence signals on the surface of cell membranes, indicating the NPs carrying Her2 antibodies could effectively bind to Her2-positive cells [34]. To clearly observe the distributions of Her2-GPH NPs in SKBR3 cells, we provided a bright image (a1), FITC fluorescence image (a2), nuclear image (a3), and an overlay image (a4) of it. Because of the short incubation time of NPs, they were mainly distributed on the surface of cell membranes and aggregated into black spots. In competition study, there were negligible fluorescence signals when SKBR3 cells were pre-treated with excess free anti Her2 antibodies and then incubated with Her2-GPH NPs (Fig. 7c). These results demonstrated that the targeting behavior of Her2-GPH NPs was receptor-mediated and could be blocked by excess free anti-Her2 antibodies [26]. In addition, little fluorescence is detected in MDA-MB-231 cells treated with Her2-GPH NPs under the same conditions (Fig. 7d), which confirmed that Her2-GPH NPs specifically bind to SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors.

Flow Cytometry

The binding rate of Her2-GPH NPs towards cells was further assessed quantitatively via FCM. As clearly illustrated in Fig. 7, the binding rate of targeted NPs to SKBR3 cells (e) was remarkably higher than that of MDA-MB-231 cells (h) (86% ± 3.72% vs 2.31% ± 0.36%, P < 0.001), indicating the specific targeting capability of Her2-GPH NPs to Her2-positive cells. In addition, Her2-GPH NPs had little targeting binding to SKBR3 cells which were pre-treated with excess free anti-Her2 antibodies (Fig. 7g), and there was significant difference between the targeted inhibition group and targeted group (3.16% ± 0.41% vs 86% ± 3.72%, P < 0,001). Based on the above, the FCM results provided further strong evidence that Her2-GPH NPs had specific targeting capability of recognizing and combining with SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors and the targeting behavior was receptor-mediated.

In Vitro US Imaging and Quantitative Analysis

In Vitro Solution Ultrasound Imaging

In our study, the US imaging effect of Her2-GPH NPs solution was assessed in vitro under different modes using Mylab Twice Ultrasound System unit. Observed from Fig. 8a, the tubes filled with Her2-GPH NPs solution displayed strong dotted echo in both 2D gray-scale and CEUS modes. By contrast, DI water exhibited as an echo. Furthermore, with the increasing concentration of Her2-GPH NPs, the ultrasound contrast enhancement signal gradually increased. As illustrated in TIC, the mean signal intensity of the Her2-GPH NPs gradually increased as the concentration of NPs increased and it kept correspondence with the CEUS result. The agent at the concentration of 2 mg/mL had significantly stronger contrast enhancement signals than the NPs at 0.1 mg/mL (82 ± 0.69 dB vs 27 ± 6.7 dB, P < 0.01), indicating the stronger backscattering is produced by higher concentration of the NPs. The above indicated that the Her2-GPH NPs possessed satisfactory contrast enhancement effect in vitro and such contrast enhancement was concentration-dependent. In addition, the length of ultrasound imaging time of Her2-GPH NPs at the concentration of 2 mg/mL was also investigated (Fig. 8b). Her2-GPH NPs exhibited exquisite contrast-enhanced signal before 2 min, and the signal intensity gradually decreased with time elapsing. However, there was still obvious enhancement signal within 5 min, which can meet the requirement of clinical contrast-enhanced ultrasonography. Conventional gas-filled microbubbles as UCAs could enhance the backscattering signal of blood by non-linear oscillations under ultrasound but are not suitable for tissue molecular evaluation due to its limitation in intravascular imaging and poor stability [35]. Compared with gas-filled agent, the liquid fluorocarbon-filled PLGA nanocapsules have acoustic stability with prolonged circulation half-time [16]. Besides, our previous research found that Au nanoshells have good reflection properties because of its high atomic number and density [36]. Therefore, we combined the ultrasonic resonance properties of PFOB-filled PLGA nanocapsules with the great echogenicity of Au nanoshells, which prominently enhanced the backscattering signal of Her2-GPH NPs in vitro.

Targeted US Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted ultrasound imaging ability of Her2-GPH NPs on breast cancer cells was evaluated in 2D gray-scale mode using Mylab Twice Ultrasound System unit. As shown in Fig. 9a, both the NPs-treated and the control cells displayed uniform, hyperechoic bands in the gel with clear boundaries. It could be clearly observed that the echogenic band of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs was brighter and denser than those of non-targeted and control SKBR3 cells. However, no significant echo signal differences were observed in MDA-MB-231 cells treated with targeted or non-targeted NPs. We further quantified the average gray-scale value of the images based on the defined ROI, and the results were exhibited in Fig. 9b. The gray-scale value of SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs was significantly higher than that of SKBR3 non-targeted and control group (P < 0.01). Moreover, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs showed higher gray-scale values compared to MDA-MB-231 cells treated with the same NPs (P < 0,05). These results demonstrated that Her2-GPH NPs could specifically bind to Her2-positive SKBR3 cells and had the potential to enhance the ultrasound molecular imaging effect of targeted cells.

In Vitro MR Imaging and Quantitative Analysis

T ₂ Measurement and MR Imaging of Her2-GPH NPs

SPIOs have been intensively investigated in T ₂ -weighted MR imaging due to their capability to shorten transverse relaxation times of the surrounding water protons, which results in the decrease in the MR signal intensity and enables to provide negative contrast enhancement of the target lesion [37, 38]. The T ₂ contrast imaging capabilities of Her2-GPH NPs with various Fe concentrations were evaluated at a 0.5 T magnetic field. Figure 10 a displayed the transverse relaxation rates (1/T ₂ ) of water protons as a function of the iron concentration in Her2-GPH NPs aqueous solution. And the relaxivity (r ₂ ) was calculated based on the slope to be 441.47 mM⁻¹ s⁻¹ , which is more than 2 times as high as commercial SPIO-based MR imaging contrast agent Feridex (152 mM⁻¹ s⁻¹ ) under the same magnetic field strength [39]. The higher T ₂ relaxivity may be due to the fact that the aggregation of SPIOs inside the polymeric matrix results in a relatively enlarge in the size of the magnetic NPs and enhances the magnetic interactions [37, 40]. In addition, the signal intensity of T ₂ -weighted MR imaging gradually decreased along with the increase of the iron concentration (Fig. 10b), which further confirmed Her2-GPH NPs had the capability for T ₂ -weighted MR contrast imaging.

Targeted MR Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted MR imaging effect of Her2-GPH NPs on SKBR3 and MDA-MB-231 cells was confirmed by in vitro T ₂ -weighted MR imaging. As shown in Fig. 10 c and d, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs exhibited noticeable negative contrast enhancement, and the signal intensity decreased by 48% compared to the control cells (P < 0,001). However, the MR signal intensity of non-targeted GPH NPs-treated SKBR3 cells showed little reduction. In addition, the signal intensity of MDA-MB-231 cells labeled with Her2-GPH NPs or GPH NPs did not change significantly compared with the control group (P> 0,05). Furthermore, Her2-GPH NPs-treated SKBR3 cells showed a higher degree of signal intensity reduction than that of MDA-MB-231 cells (P < 0.001), which could be used to distinguish the two cells from each other. The above results together indicated that Her2-GPH NPs could enhance T ₂ -weighted MR imaging through receptor-mediated cell-specific uptake [41].

In Vitro Targeted PTT Evaluation

Initially, calcein-AM/propidium iodide (PI) staining was used to visually evaluate targeted photothermal cytotoxicity in vitro. Calcein AM, a non-fluorescent live cell stain, can permeate the cell membrane and hydrolyze to produce a green fluorescent calcein dye in live cells. Propidium iodide (PI) is a dead cell stain, which binds to the DNA of dead cells to generate red fluorescence [33]. As shown in Fig. 11a, there were no obvious dead cells when NIR laser irradiation or the Her2-GPH NPs was used separately, indicating that neither laser irradiation nor the NPs itself was cytotoxic. Likewise, cells treated with non-targeted GPH NPs in combination with NIR laser showed little cell death. On the contrary, a large number of dead cells could be observed when Her2-GPH NPs were treated in the presence of laser irradiation, which suggested that the agent could induce hyperthermic cell death by targeting photothermal effect. The cell viabilities were further quantitatively evaluated by CCK-8 assay. As illustrated in Fig. 11b, SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs and laser irradiation exhibited a (62 ± 4.56%) decrease in cell viability compared with the control group (P < 0,001). Furthermore, under the laser irradiation for 10 min, the cell viability of targeted Her2-GPH NPs group was significantly lower than that of the non-targeted group (38 ± 4.56% vs 87.6 ± 4.06%, P < 0,05).

In addition, we used the CCK-8 assay to further quantitatively assess the photothermal cytotoxicity of Her2-GPH NPs at various concentrations. As shown in Fig. 11c, the viabilities of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs without NIR laser irradiation remained more than 90%, whereas the viabilities of laser irradiated cells decreased significantly with increasing concentrations of Her2-GPH NPs. Only less than 20% of laser-irradiated cells remained viable at the concentration of 200 μg/mL compared with the non-laser-irradiated cells at the same concentration (P < 0,001). These results further confirmed that relatively low concentrations of Her2-GPH NPs were sufficient to provide enough temperature increase to kill SKBR3 cells.

Furthermore, we co-cultured SKBR3 and MDA-MB-231 cells in different proportions to simulate the heterogeneous expression of Her2 in breast tumor tissues. Results showed that the total cell viabilities after photothermal induction of Her2-GPH NPs decreased with the increasing proportions of SKBR3 cells, and the total cell viability of the other proportion group was significantly higher than that of the 100% SKBR3 cells group (P < 0.05) (Additional file 1:Figure S1). Besides, in the presence of Her2-GPH NPs for 30 min, the total cell viabilities after induction with NIR laser was significantly lower than that of the non-laser irradiation cells (P < 0.05), except for the 100% MDA-MB-231 cells group. Taken together, Her2-GPH NPs could specifically bind to SKBR3 cells and had great potential to induce cancer cells to death by photothermal effect. The possible mechanism of photothermal hyperthermia for SKBR3 cells should be mainly attributed to the exposure of the cancer cells to higher temperatures, which inhibited normal cellular growth and proliferation by denaturing intracellular proteins [42].

Conclusions

Her2-GPH NPs, a Her2 functionalized theranostic agent that integrated dual-modal US/MR imaging and targeted PTT has been successfully designed, fabricated and investigated in vitro. By conjugation with anti-Her2 antibodies, the agent could recognize or bind to breast cancer SKBR3 cells overexpressing Her2 with high specificity and sensitivity. In addition, through the co-loading of PFOB and SPIOs, and the construction of Au-nanoshelled PLGA “shell-core structure”, the resulting Her2-GPH NPs provide excellent contrast enhancement in vitro US and T ₂ -weighted MR imaging. Furthermore, the formation of Au nanoshells enables the agent to be served as efficient photoabsorber for targeted NIR PTT in breast cancer cells. Our results provide a preliminary exploratory study for the integration of collaborative diagnosis and adjuvant therapy of breast cancer, and further studies in vivo are still needed.