Complémentation d'ELISA et d'une surface d'électrode interdigitée dans la fonctionnalisation de nanoparticules d'or pour une détection efficace des défauts de coagulation du sang humain

Introduction

L'amélioration de tous les aspects à la pointe de la médecine est obligatoire pour maintenir une vie humaine saine et prolonger la durée de vie. Le diagnostic des maladies est l'un des domaines majeurs du domaine médical, qui devrait être encore amélioré pour une identification plus facile des maladies et des traitements. D'autre part, les maladies épidémiques telles que la grippe et la dengue doivent être détectées dès les premiers stades pour éviter la propagation [1,2,3]. Il existe différents diagnostics qui ont été démontrés capables d'une véritable détection via un large éventail de biomarqueurs [4, 5]. Parmi les systèmes de diagnostic précédemment générés, le dosage immuno-enzymatique (ELISA) est largement considéré comme le «gold standard» pour identifier les principales maladies virales et bactériennes et les espèces moléculaires [6, 7]. Différentes stratégies ont été développées avec ELISA avec des caractéristiques attrayantes telles que la facilité d'utilisation, la précision et la limite de détection inférieure. De plus, la détection simultanée de diverses maladies et l'utilisation pour le dépistage des principales maladies sont courantes en pratique [8,9,10]. ELISA est un immunoessai utilisé pour détecter la cible d'intérêt en utilisant l'anticorps approprié sur des plaques 96 puits en polystyrène (PS). La sensibilité et la sélectivité des molécules cibles dépendent fortement de divers facteurs en ELISA, tels que l'affinité de liaison de la cible et de l'anticorps, l'interaction des anticorps primaires et secondaires et l'immobilisation efficace de la cible sur la surface ELISA. En particulier, l'immobilisation de la cible sur la plaque PS joue un rôle crucial pour limiter la détection. L'anticorps ou la protéine peut s'adsorber physiquement sur la surface du PS par l'interaction de groupes hydrophobes avec l'anticorps [11]. Il existe certaines possibilités, par exemple impliquant une faible liaison de l'anticorps (ou de la protéine) ou l'instabilité de l'anticorps sur la plaque PS et la distribution non uniforme de l'anticorps (ou de la protéine) conduisant à des défauts de détection. Il a été prouvé qu'une bonne orientation de l'anticorps sur la plaque immobilisée améliore la détection de plus de 64 fois par rapport aux molécules immobilisées au hasard [12, 13]. Trouver la procédure appropriée pour l'immobilisation efficace de la protéine ou de l'anticorps sur la plaque PS avec uniformité est donc un besoin crucial. Différents chercheurs utilisent l'immobilisation de protéines sur des plaques PS ELISA par des processus chimiques ou physiques, tels qu'une réaction photochimique assistée par du polyvinylbenzyllactonoylamide et l'immobilisation de protéines en présence de détergent [14,15,16]. Dixit et al. [8] ont immobilisé les anticorps sur la plaque PS modifiée par amine pour améliorer la limite de détection, et ils ont démontré que le prémélange de (3-aminopropyl)triéthoxysilane (APTES) et d'anticorps avant l'étape d'immobilisation améliorait la sensibilité de 54 fois par rapport à l'ELISA conventionnel et atteint la limite de détection de 10 pM [8, 17].

Dans le présent travail, nous avons introduit une nouvelle méthode d'immobilisation de protéines sur des plaques PS ELISA assistée par des nanoparticules d'or (PNB). Les PNB sont l'un des outils les plus puissants dans le domaine du développement de capteurs. Ils offrent des propriétés positives, telles que la facilité de dispersion dans l'eau, l'inertie biologique et une bonne compatibilité avec la fonctionnalisation de surface, et ils peuvent être adaptés à des nanotailles uniformes [18,19,20,21,22,23]. Il a été prouvé que les anticorps conjugués au GNP amélioraient la limite de détection avec le virus de la grippe et le FIX sur le capteur en mode guide d'ondes [21,22,23]. Les GNP sont utilisés dans toutes sortes de capteurs, y compris les capteurs en mode guide d'ondes, la résonance plasmonique de surface et la spectroscopie Raman pour une détection haute performance. De plus, les GNP ont également été utilisés dans des dosages colorimétriques, dans lesquels la conjugaison d'aptamère ou d'anticorps sur des surfaces de GNP a été suivie pour détecter l'analyte à l'œil nu. Les chercheurs se concentrent également sur l'utilisation des PNB dans les méthodes ELISA pour améliorer la détection [24]. Auparavant, l'anti-IgG-HRP de souris conjugué au GNP améliorait la détection de Pb(II) et atteignait la limite de détection de 9 pg/mL [25]. Lakshmipriya et al. ont découvert que la conjugaison d'anticorps primaires et secondaires sur les GNP améliorait la détection de la protéine ESAT-6, qui est impliquée dans l'apparition de la tuberculose [9, 26]. Ici, nous avons utilisé des GNP pour immobiliser la protéine sur la surface PS ELISA avec la modification chimique assistée par APTES. Cette approche implique deux étapes :la fonctionnalisation de la surface du PS avec des groupes amine à l'aide d'APTES suivie de l'immobilisation de la protéine conjuguée au GNP sur la plaque PS modifiée par amine. Les groupes amine de l'APTES peuvent se lier aux groupes COOH sur la surface PS ELISA. D'autre part, les protéines conjuguées au GNP stabilisées avec des ions citriques anioniques peuvent se lier aux APTES cationiques par interaction électrostatique [11, 27, 28]. Les groupes amino-terminaux de l'APTES déplacent les groupes citrate sur les GNP et se fixent chimiquement sur la plaque PS [29]. Les groupes amine chargés positivement dans APTES attirent également les GNP chargés négativement. De plus, le traitement APTES modifie le substrat du PS pour le rendre plus hydrophobe [30].

Une plaque ELISA modifiée chimiquement et une conjugaison GNP ont été utilisées pour détecter le facteur IX (FIX) de la cascade de coagulation du sang humain. Le FIX est une protéine importante dans le système de coagulation du sang, et des concentrations plus faibles de FIX dans le sang entraînent un déficit de la coagulation. L'immobilisation améliorée du FIX sur la plaque ELISA par le biais des GNP permet une voie potentielle pour la détection des niveaux inférieurs de FIX. La plaque ELISA modifiée par GNP a montré une amélioration drastique de la détection du FIX. De plus, nous avons également démontré la détection de FIX dans le sérum humain, et la stratégie actuelle peut être utilisée avec ELISA pour détecter d'autres biomarqueurs. Pour compléter l'étude ci-dessus avec le substrat ELISA, nous avons également appliqué la stratégie ci-dessus sur une autre surface d'électrode interdigitée (IDE) largement utilisée dans un capteur diélectrique électrochimique pour détecter le FIX et le FIX purs dans un échantillon de sérum humain dilué (Fig. 1a, b) .

un Représentation schématique de l'ELISA assisté par GNP. Le GNP a été prémélangé avec la protéine et immobilisé sur une surface ELISA modifiée par APTES. Des anticorps ont ensuite été ajoutés. Enfin, un substrat pour HRP a été utilisé pour détecter la cible. b Représentation schématique de l'IDE assisté par GNP

Matériaux et méthodes

Réactifs et biomolécules

Le (3-aminopropyl)triéthoxysilane (APTES) et le sérum humain ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (USA). La protéine FIX et l'anticorps anti-FIX provenaient d'Abcam (Malaisie). La peroxydase de raifort anti-souris-IgG conjuguée (anti-immunoglobuline de souris HRP) a été achetée auprès de Thermo-Scientific (USA). La plaque ELISA a été achetée chez Becton Dickinson (France). Le tampon de revêtement ELISA 5X a été obtenu auprès de BioLegend (Royaume-Uni). L'albumine de sérum bovin (BSA) et le substrat HRP ont été obtenus auprès de Promega (USA). Des nanoparticules d'or (PNB) (10, 15 et 80  nm) ont été obtenues auprès de Nanocs (USA). Le lecteur ELISA analytique provenait de Fisher Scientific (Malaisie).

Optimisation avec le réactif Silane et les PNB

Pour optimiser les concentrations appropriées d'APTES et de GNP, nous avons effectué le processus d'immobilisation avec différentes combinaisons d'APTES et de GNP sur la plaque ELISA. Initialement, la plaque ELISA a été hydroxylée avec 1% de KOH pendant 1hh. Ensuite, 1,25, 2,5 et 5 % d'APTES ont été liés sur des puits séparés de la plaque ELISA à température ambiante (RT) pendant 5 h. Après cela, les PNB dilués (dans de l'eau distillée) avec une concentration de 25, 50 et 100 % ont été immobilisés sur les surfaces modifiées par APTES. FIX, à 200  nM, a ensuite été autorisé à se lier aux surfaces GNP. Les sites de liaison restants ont ensuite été bloqués en utilisant 2% de BSA, puis une dilution 1:1000 d'anticorps FIX a été introduite, suivie par l'ajout d'une dilution 1:1000 d'anti-IgG-HRP de souris. Enfin, le substrat a été ajouté pour détecter l'interaction FIX. Les puits ont été lavés 5 fois entre chaque étape en utilisant du tampon de lavage (tampon PBS contenant 0,05 % de Tween 20, pH 7,4). Enfin, la densité optique (DO) a été mesurée par lecteur ELISA à 405 nm. Des PNB de 15  nm ont été utilisés dans cette expérience.

Détermination de la taille nécessaire du PNB

Après avoir déterminé la concentration appropriée d'APTES et la dilution du GNP dans les conditions optimales, des GNP de 10, 15 et 80  nm ont été testés pour l'immobilisation FIX afin de déterminer la taille la plus appropriée. Les mêmes conditions expérimentales ont été utilisées que celles indiquées ci-dessus. APTES à 2,5% et une dilution PNB de 50% ont été utilisés pour l'immobilisation FIX.

Détection spécifique et sélective de FIX

Nous avons également confirmé la liaison spécifique de la protéine et de l'anticorps sur la plaque ELISA. Pour cela, nous avons utilisé trois types différents d'expérience de contrôle. Nous avons immobilisé l'ordre suivant de biomolécules sur la plaque ELISA pour servir de contrôles et de conditions spécifiques :contrôle 1 (C1), FIX-BSA-anti-souris IgG-substrat; témoin 2 (C2), substrat d'anticorps FIX-BSA-FIX; contrôle 3 (C3), anticorps BSA-FIX-anti-substrat IgG souris, spécifique (S), anticorps FIX-BSA-FIX-substrat IgG anti-souris.

Détection du FIX conjugué au GNP sur plaque ELISA vs ELISA conventionnel

Le FIX a été détecté à l'aide de la plaque ELISA modifiée par GNP par deux méthodes différentes, telles que APTES-GNP-FIX et APTES-GNP prémélangé FIX, et ces méthodes ont été comparées avec l'ELISA conventionnel. Les étapes suivantes constituent les procédures. ELISA conventionnel :(i) la protéine FIX a été diluée dans un tampon de revêtement 1× avec des concentrations de 0 à 200  nM, (ii) bloquée avec 2 % de BSA, (iii) une dilution 1:1000 d'anticorps FIX a été ajoutée, (iv) 1 :Une dilution à 1000 d'anti-IgG-HRP de souris a été ajoutée, (v) un substrat pour HRP a été ajouté et mesuré à 405  nm.

APTES-GNP-FIX (méthode 1) :(i) la plaque PS a été activée par 1% de KOH, (ii) 2,5% d'APTES a été ajouté sur la plaque ELISA à température ambiante pendant 5 h, (iii) 25% des 15 nm reçus Le GNP a été ajouté et maintenu à 4 °C pendant la nuit, (iv) le FIX avec des concentrations de 0 à 200  nM a été autorisé à se lier indépendamment sur la surface du GNP, (v) la surface restante a été bloquée par 2% de BSA, (vi) 1 :Une dilution à 1000 d'anticorps FIX a été ajoutée, (vii) une dilution 1:1000 d'anti-IgG-HRP de souris a été ajoutée, (vii) un substrat pour HRP a été ajouté et mesuré à 405  nm.

FIX prémélangé APTES-GNP (méthode 2) :(i) la plaque PS a été activée par 1% de KOH, (ii) 2,5% d'APTES a été ajouté à température ambiante pendant 5 h, (iii) prémélange de solutions de GNP à 25 % 15  nm avec différentes concentrations de FIX (incubés à TA pendant 30 min ; 0 à 200  nM) ont été immobilisés sur la surface modifiée par APTES, (iv) la surface restante a été bloquée par 2% de BSA, (v) une dilution 1:1000 d'anticorps FIX a été ajoutée, (vi) une dilution 1:1000 d'anti-IgG-HRP de souris a été ajoutée, (vii) un substrat pour HRP a été ajouté et mesuré à 405  nm.

Détection de FIX dans le sérum humain et après ajout de FIX

Pour détecter le FIX dans le sérum humain, nous avons prémélangé le sérum avec des GNP au lieu du FIX ici. Des dilutions de sérum de 20 à 1280 ont été titrées et mélangées avec des GNP pour évaluer la détection de FIX. D'autres conditions et concentrations expérimentales ont été utilisées, de manière similaire aux expériences précédentes.

L'expérimentation de dopage a été menée en dopant différentes concentrations de FIX (0 à 8 nM) dans la dilution optimisée de sérum humain et en prémélangeant avec des GNP avant l'immobilisation sur la plaque ELISA. D'autres conditions et concentrations expérimentales ont été utilisées comme dans les expériences précédentes.

Fabrication de surface d'électrode interdigitée

Le processus de fabrication de surface d'électrodes interdigitées (IDE) comprend le nettoyage de la plaquette, la croissance de la couche d'oxyde, le revêtement par centrifugation de la résine photosensible négative, la mise en forme de la résine photosensible, le dépôt d'aluminium métallique, l'élimination de la résine photosensible et le découpage des tranches. Le processus a été initié sur une plaquette nettoyée par gravure à l'oxyde tamponné suivi de l'oxydation sur les plaquettes de silicium (310 nm) à haute température (1000 °C), puis le processus de gravure a été effectué en utilisant de l'aluminium. Une résine photosensible négative a été déposée par spin coater avec une vitesse de rotation de 2000 rpm. Le résist a été développé par RD-6 après exposition à la lumière UV (240 s). Ensuite, 240 nm d'aluminium a été déposé par un évaporateur thermique (Edwards Auto 306) à 3,0E-5 Torr. La résine photosensible a été décapée à l'aide d'acétone jusqu'à l'apparition d'un IDE solide, puis coupée en dés pour créer un seul IDE. Enfin, la couche d'oxyde de zinc a été superposée sur le dessus pour une immobilisation biomoléculaire ultime [31]. Avant de procéder à la fixation de l'oxyde de zinc, la surface de détection a d'abord été lavée avec de l'hydroxyde de potassium 1 M (pH 9,0).

Détection de FIX sur une surface modifiée par le PNB

Après l'optimisation et la confirmation de l'efficacité de détection de FIX avec un substrat ELISA modifié par GNP, la même modification de surface a été effectuée sur la surface IDE pour compléter la détection ci-dessus. Initialement, la surface d'oxyde de zinc IDE a été modifiée avec de l'amine en ajoutant 2,5% d'APTES dilué dans de l'éthanol pendant 3 h à TA. Après cela, la surface a été lavée cinq fois avec de l'éthanol et le prémélange de GNP (25 %) et de FIX a été ajouté. Ensuite, les surfaces restantes ont été bloquées par de l'éthanolamine et l'anticorps FIX a été ajouté ensuite pour détecter le FIX. Les changements concomitants du signal de courant ont été remarqués. Pour vérifier la limite de détection, différentes concentrations de FIX ont été mélangées indépendamment avec des GNP, immobilisées sur la surface IDE modifiée par amine, puis détectées par l'anticorps; la limite de détection a été déterminée par le calcul de 3σ. L'abondance de FIX dans le sérum humain dilué mélangé avec des GNP a été immobilisée sur la surface de l'IDE modifiée par une amine puis détectée par son anticorps. La fabrication de la surface ci-dessus a suivi comme indiqué avant [31].

Résultats et discussion

Prétraitement sur une surface PS ELISA

L'immobilisation efficace de la protéine ou de l'anticorps sur la surface ELISA en polystyrène (PS) améliore apparemment la limite de détection de l'interaction cible-sonde. Différentes méthodes d'immobilisation ont été utilisées pour la fixation des protéines ou des anticorps sur la plaque ELISA. Dans ce travail, nous avons introduit une surface ELISA modifiée chimiquement avec des PNB pour l'immobilisation de protéines ou d'anticorps. Nous souhaitions utiliser l'un des facteurs de coagulation importants, tel que le facteur IX (FIX), qui a été largement rapporté comme étant important [32,33,34,35,36]. La figure 1 montre la représentation schématique de l'immobilisation de la protéine sur la surface ELISA en polystyrène. Tout d'abord, la surface ELISA a été activée par 1% de KOH. En l'absence de prétraitement KOH, le nombre de molécules APTES à lier à la surface du PS est minime. Ceci est dû à l'absence de groupes accepteurs de liaisons polaires et hydrogène, qui facilitent l'adsorption initiale de l'APTES sur les polymères [11]. Après traitement KOH, la surface a été modifiée avec une amine par la concentration appropriée d'APTES afin de capturer les PNB.

Caractérisation des PNB

Avant d'aller plus loin, nous avons caractérisé les PNB tels que reçus (15 nm) par des mesures optiques, morphologiques et de distribution de taille. La figure 2a affiche l'analyse par spectrophotométrie UV-Vis des PNB, qui ont apparemment affiché les pics maximaux à 550  nm. Les observations au microscope électronique à transmission montrent que la taille des PNB est de ~ 15 nm et que la forme est bonne (Fig. 2b et encadré). L'analyse par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier a été réalisée à partir du nombre d'onde de 500 jusqu'à 4000 cm ⁻¹ (Fig. 2c). Un seul pic apparent à 1650 cm ⁻¹ a été remarquée pour l'or avec un autre pic mineur, tandis que la présence de pics pour les groupes amine représentant l'attachement d'APTES. Un soutien supplémentaire a été apporté par la distribution de volume et les analyses de potentiel zêta. Sur la base de cette analyse, la distribution de volume indique qu'il existe une légère variation dans la distribution de taille (Fig. 2d) et que le potentiel zêta était de − 6,9, représentant la stabilité des PNB utilisés dans cette étude (Fig. 2e).

Caractérisation des nanoparticules d'or. Réalisé avec la taille optimale 15 nm. un Analyse par spectrophotométrie UV-Vis. Un pic unique proéminent a été trouvé à 550  nm. b Observation au microscope électronique à transmission. L'encart de la figure montre l'image agrandie. La barre d'échelle s'affiche. c Analyse par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Positions de pic apparentes pour l'or et le NH₂ sont indiqués. d Analyse de la distribution des volumes du PNB. La distribution obtenue est indiquée. e Analyse du potentiel zêta. La valeur s'est avérée être − 6,9

Préparation et optimisation de la surface d'amine pour capturer les PNB

La quantité d'APTES influence grandement l'immobilisation du GNP ou des anticorps sur la surface du PS. En général, les molécules APTES très encombrées ont une probabilité de créer des résultats faussement positifs. Puisque APTES a été utilisé de 1 à 2% pour immobiliser l'anticorps dans plusieurs surfaces de capteurs, ici, nous avons titré de 1,25 à 5% APTES, préparé dans l'éthanol absolu. Ensuite, notre objectif était d'immobiliser les GNP sur les surfaces modifiées par APTES. Il est possible que les nombres plus élevés de PNB produisent l'effet d'encombrement, de sorte que les PNB avec 25, 50 ou 100 % de 15  nm ont été testés sur la surface modifiée par APTES pour optimiser la dilution appropriée. Sur ces surfaces modifiées, 250 nM de FIX ont été détectés avec l'anticorps FIX. Comme le montrent les figures 2a et b, 1,25% APTES montre moins d'absorbance optique (DO) avec toutes les dilutions de GNP (25, 50 et 100%), tandis que 2,5 et 5% APTES ont montré une absorbance plus élevée avec 50 et 100% de PNB. Dans le même temps, le rapport signal sur bruit s'est amélioré avec l'augmentation des concentrations d'APTES et de GNP (Fig. 3a, b). Les 5 % APTES avec 50 et 100 % de GNP ont montré une liaison non spécifique, et 50 et 100 % de GNP avec 2,5 % d'APTES ont affiché une absorbance similaire. Sur la base de ces valeurs obtenues, nous avons choisi 2,5 % d'APTES et une dilution de 25 % des PNB pour d'autres expériences.

Détermination des montants de l'APTES et du PNB. Trois concentrations différentes (1,25, 2,5 et 5 %) d'APTES ont été utilisées avec trois dilutions de GNP (25, 50 et 100 %). un Détection visuelle du FIX après ajout du substrat. Des voies de contrôle sans FIX ont été incluses. b Représentation graphique du niveau APTES optimal. 2,5% APTES et 25% PNB ont été jugés optimaux

Détermination de la taille potentielle du PNB

Après APTES et optimisation de la dilution du PNB, nous avons ensuite évalué la taille appropriée des PNB. Étant donné que la surface joue un rôle crucial dans l'immobilisation des protéines, nous avons essayé ici d'immobiliser trois tailles différentes de PNB, dont 10, 15 et 80  nm. Différentes tailles de GNP ont différentes surfaces et différentes charges pour attirer la protéine, et la capacité de liaison sur la surface modifiée par APTES est également différente. Comme le montre la figure 4a, 250 nM de FIX ont été détectés avec la surface ELISA modifiée avec des GNP de 10, 15 et 80  nm. Il a été constaté que les GNP de 15 et 80 nm présentent presque la même absorbance de 0,4 (DO) pour la détection de 250  nM de FIX, mais les GNP de 10 nm ne montrent que 0,34 OD. À partir de cette expérience, nous avons confirmé que les PNB de 15 ou 80  nm conviennent à d'autres expériences, et nous avons continué avec des PNB de 15  nm.

un Déterminer la taille idéale du PNB. Parmi 10, 15 et 80 nm, 15 et 80 nm ont montré des résultats similaires. Quinze nanomètres ont été utilisés pour déterminer la limite de détection avec FIX. b Une expérience de contrôle pour la détection de FIX. Trois expériences de contrôle différentes (C1 - sans anticorps FIX; C2 - sans IgG anti-souris; C3 - sans FIX) ont été réalisées. Aucun signal significatif n'a été trouvé dans aucune des expériences de contrôle. Les encarts de chiffres affichent les résultats visuels

Stratégies expérimentales pour confirmer le non-encrassement et les hautes performances

Avant de détecter le FIX sur la surface ELISA modifiée par GNP, nous avons effectué trois types d'expériences de contrôle différents, comme expliqué dans la section « Matériaux et méthodes ». Comme le montre la figure 4b, nous n'avons pas pu observer d'absorbance significative dans les puits pour les expériences témoins 1, 2 et 3 (C1, C2 et C3). Dans l'expérience spécifique (S), le niveau d'absorbance le plus élevé est clairement associé à des changements de couleur apparents. Dans le cas de C1, nous n'avons pas ajouté d'anticorps FIX, ce qui confirme que l'anticorps FIX interagit spécifiquement avec le FIX (en S). Aucun signal observable n'a été trouvé en l'absence d'IgG anti-souris dans C2, ce qui donne un ancrage supplémentaire pour l'interaction appropriée du FIX et de l'anticorps suivi d'IgG anti-souris. En C3, en l'absence de FIX, nous n'avons pas pu mesurer l'absorbance significative. A partir de ces résultats, la bonne interaction du FIX avec son anticorps sur la surface ELISA a été confirmée sans liaison non spécifique.

ELISA assisté par GNP vs ELISA conventionnel :Détermination de la sensibilité

Après avoir effectué les expériences de contrôle, nous avons détecté FIX avec des surfaces modifiées GNP et comparé les résultats avec la méthode ELISA conventionnelle. Nous avons mené trois expériences différentes pour la détection du FIX. Tout d'abord, le GNP a été immobilisé sur des surfaces modifiées par APTES, puis le FIX a été attaché à la surface du GNP par interaction électrostatique. En raison de l'interaction électrostatique, la plupart des protéines ont la possibilité de se lier à la surface du GNP; de cette façon, nous pourrions immobiliser FIX sur la surface ELISA PS. L'immobilisation des protéines dépend également des charges provenant des acides aminés et du PNB. Gopinath et al. [37] ont prouvé la forte liaison du FIX à la surface du GNP et ont également constaté qu'il est stable dans des conditions de salinité élevée. Dans la seconde méthode, le GNP et la protéine ont d'abord été prémélangés avant d'être immobilisés sur la surface aminée de PS ELISA. On s'attendait à ce que davantage de protéines puissent se lier de cette manière, car il existe une plus grande possibilité que les molécules de protéines soient capables de se lier à la surface du GNP à l'état de solution. La solution prémélangée a ensuite été immobilisée sur les surfaces d'aminé modifiées par APTES. Ces méthodes ont été comparées à la méthode ELISA conventionnelle. Comme le montre la figure 5a, lorsque nous avons titré la concentration de FIX de 0 à 200 nM, l'ELISA conventionnel (méthode 1) a montré la limite de détection de 6 nM. La méthode APTES-GNP-FIX (méthode 2) affiche la limite de détection de 200 pM, soit une sensibilité plus de 30 fois supérieure à celle de l'ELISA classique. L'amélioration de la sensibilité est obtenue grâce à une orientation appropriée d'un nombre élevé d'antigènes immobilisés sur la plaque ELISA PS, et finalement plus d'anticorps interagiront. Dans cette recherche, des nanoparticules d'or ont été utilisées pour immobiliser plus d'antigènes grâce à la modification par amine de la plaque ELISA. Dans l'ELISA conventionnel, les antigènes sont directement immobilisés sur la plaque ELISA, ce qui réduit le nombre de molécules se liant à la surface et entraîne une sensibilité réduite par rapport à la stratégie actuelle à médiation par les nanoparticules d'or. De plus, la résonance plasmonique de surface localisée améliore encore la sensibilité, comme l'ont révélé les études avec les GNP. Lorsque nous prémélangons les PNB avec le FIX, comme prévu, la limite de détection a été fortement améliorée et a atteint le niveau de 100 pM, ce qui est 60 fois plus sensible que l'ELISA conventionnel. Comme le montre la figure 5a, on peut clairement voir que lorsque nous utilisons des GNP pour l'immobilisation des protéines, l'absorbance maximale atteint ~ 0,6 pour les protéines prémélangées et directement immobilisées sur les surfaces GNP, mais l'absorbance trouvée avec l'ELISA conventionnel était ~   0,4 en utilisant la concentration similaire (200 nM) de FIX. Même avec d'autres concentrations, la méthode 3 a montré une différence d'absorbance plus élevée par rapport à l'ELISA conventionnel, et cela était également raisonnablement plus élevé que la méthode 2. Dans le cas de l'ELISA conventionnel, la détection visible a été trouvée à partir de 25 nM et de 3 nM dans la méthode 2. Avec la méthode 3, nous pouvions voir visiblement le changement de couleur à partir de 200 pM de FIX en raison d'une absorbance plus élevée (Fig. 5a). L'absorbance était saturée à 25  nM dans la méthode 3. Comme nous pouvions visualiser les changements de couleur à partir de 200 pM de FIX, nous avons évalué la limite de détection et titré en utilisant les concentrations les plus faibles de FIX. Il était évident que la limite de détection atteignait 100 pM lorsque nous prémélangions les PNB et le FIX (Fig. 5b).

un Comparaison de la sensibilité du FIX en ELISA modifié par GNP par rapport à l'ELISA conventionnel. Le FIX a été titré de 0,2 à 200  nM. L'ELISA conventionnel présente la limite de détection de 6 nM. Sur l'ELISA modifié GNP, le signal a été observé jusqu'à 200 pM. L'encart de la figure affiche les résultats visuels. b Limite de détection du FIX sur plaque ELISA modifiée GNP. Le FIX a été titré de 25 à 100 pM. La limite de détection s'est avérée être de 100 pM. Les encarts de chiffres affichent les résultats visuels

Détection de FIX dans le sérum humain et amélioration par ajout de FIX

Comme le FIX s'est avéré jouer un rôle important dans la cascade de coagulation [38, 39], après vérification de la limite de détection, nous avons également détecté du FIX dans le sérum humain. Pour cette analyse, nous avons titré le sérum humain dans la plage entre des dilutions de 1:1280 et 1:20. Le sérum dilué a été prémélangé avec des GNP et immobilisé sur la surface ELISA modifiée par APTES, comme indiqué ci-dessus. Il était évident que le FIX a été détecté à partir d'une dilution de sérum au 1:640, ce qui équivaut à 125 pM de FIX (Fig. 6a). Le sérum humain sain contient généralement environ 87  nM de FIX, ainsi que d'autres protéines majeures telles que l'albumine et la globuline. Avec notre stratégie, nous avons atteint la limite de détection spécifique de 125 pM dans le sérum humain, ce qui est utile pour identifier un défaut de coagulation du sang. D'un autre côté, lorsque nous avons ajouté du FIX de 1 à 8  nM dans la dilution 1:640 de sérum humain, il a affiché des augmentations de l'absorbance qui augmentaient simultanément avec les concentrations de FIX (Fig. 6b).

un Détection du FIX dans le sérum humain. Le sérum humain a été dilué de 1:20 à 1:1280. Le FIX a été détecté dans du sérum humain dilué au 1:640 (la figure à l'intérieur indique la représentation schématique). b Dosage de FIX (0,125 à 8  nM) dans une dilution 1:640 de sérum humain. Avec des augmentations de la concentration de FIX, l'absorbance a été augmentée. Les encarts de chiffres affichent les résultats visuels

Détection de GNP-FIX sur la surface IDE :analyse de complémentation

Puisqu'il a été constaté que le FIX conjugué au GNP améliorait la limite de détection, nous avons appliqué une stratégie similaire en utilisant le capteur électrochimique avec une surface IDE pour compléter ces résultats. Nous avons titré le FIX de 25 à 200 pM (mélangé avec des GNP), l'avons immobilisé sur la surface IDE modifiée par une amine, puis l'avons détecté par l'anticorps FIX. Comme le montre la figure 7a, avec l'augmentation de la concentration de FIX, le niveau actuel a également augmenté de manière concomitante par rapport à la ligne de base. Le niveau de FIX était saturé à partir de 200 pM, et la limite de détection s'est avérée être de 25 pM. Cette détection est quadruple par rapport à ELISA (100 pM). De plus, la détection du FIX a été mise en évidence dans le sérum humain dilué (Fig. 7b). Pour cette expérience, le sérum humain a été dilué de 1:80 à 1:1280. Comme le montre la figure, la dilution de 1:1280 (courbe rouge) montre une différence apparente par rapport à la ligne de base (courbe noire) avec l'estimation 3σ, indiquant que la détection évidente de FIX à partir de sérum humain avec la dilution de 1:1280 correspond avec les résultats de l'ELISA (détecté à 1:640). La détection à partir de l'IDE avec une dilution moindre montre l'augmentation de la sensibilité.

un Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. b Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280

Conclusion

Efficient immobilization of protein or antibody on the PS ELISA surface is a crucial step to improve the limit of detection. Here, we introduced a new and easy protein immobilization strategy on the PS ELISA surface assisted by GNPs. Two different methods were used:one is the direct immobilization of FIX on the GNP-modified surface, and another one is premixing of FIX with GNPs before attachment. It was found with the former method that improvement of the limit detection is 30-fold higher compared with the conventional ELISA. The latter method showed a 60-fold improved limit of detection compared to the conventional ELISA. We also demonstrated the detection of FIX in 1:650 diluted human serum, which is equivalent to 125 pM. Obviously, these strategies proved that the higher binding of proteins on the ELISA surface was able to improve the sensitivity and to be useful for detecting a wide range of biomarkers on the ELISA surface.

Disponibilité des données et des matériaux

All of the data are fully available without restriction.

Abréviations

APTES :

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

BSA :

Sérum albumine bovine

COOH:

Carboxyl

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

Fc:

Fragment crystallizable

GNP:

Gold nanoparticle

HRP :

Peroxydase de raifort

IDE:

Interdigitated electrode

IgG:

Immunoglobulin

OD :

Densité optique

PEG :

Polyéthylène glycol

PS :

Polystyrène

PVLA:

Polyvinyl benzyl lactonoylamide

TMB:

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine