Nanoparticules composites à base de polydopamine avec coques polymères redox-labiles pour une libération contrôlée de médicaments et une thérapie chimio-photothermique améliorée

Introduction

La thérapie photothermique (PTT), un traitement local non invasif du cancer, a attiré une grande attention dans le traitement du cancer pour sa sélectivité élevée et ses effets indésirables minimes [1]. Dans le PTT, l'exposition au laser dans le proche infrarouge (NIR) administrée est absorbée par les agents de conversion photothermique (PTC) et convertie en hyperthermie locale conduisant à l'ablation de la tumeur [2,3,4]. Une variété de nanomatériaux ont été révélés l'effet PTC, tels que les nanostructures d'or [5,6,7], les nanomatériaux à base de carbone [8,9,10,11,12], Fe₃ O₄ des nanoclusters [13,14,15], des nanocristaux de CuS [16] et de la mélanine naturelle [17], qui présentent tous une forte absorbance optique dans la fenêtre optique tissulaire NIR. Parmi ces agents PTC, la polydopamine (PDA), un imitateur des protéines adhésives trouvées dans les moules, montre une forte absorption NIR, une efficacité PTC élevée (40 %), une excellente biocompatibilité et une biodégradabilité, qui ont été largement explorées dans l'application du PTT [ 18, 19]. Cependant, l'utilisation unique du PTT montre une efficacité clinique limitée en raison d'un apport de chaleur insuffisant dans la région cible sans endommager les tissus normaux environnants [20]. Pour résoudre ce problème, la thérapie chimio-photothermique avec la combinaison d'hyperthermie et d'agents chimiothérapeutiques a été exploitée par de nombreux chercheurs pour son effet synergique résultant de l'administration de médicaments dans les tumeurs et de la toxicité accrue des médicaments par hyperthermie [21, 22].

Pour obtenir un effet de traitement optimisé, les travaux actuels sont consacrés au développement d'une nouvelle nanoparticule thérapeutique avec une conversion photothermique haute performance, une excellente capacité de charge médicamenteuse et un comportement de libération de médicament contrôlé. Une couche de polymère « intelligente » a été introduite dans notre système, qui s'est réticulée par un lieur clivable, pour permettre la dégradabilité et la libération contrôlée de médicaments des supports de manière déclenchée. La liaison disulfure, qui peut être clivée par des thiols libres, est un candidat prometteur en tant que lieur clivable en raison de sa réponse sensible à l'état redox, de sa stabilité élevée dans la circulation sanguine et de sa bonne biocompatibilité [23]. Les porteurs de médicaments incorporant des liaisons disulfure peuvent subir une dégradation sélective lors de l'entrée dans les cellules tumorales, dans lesquelles la concentration de glutathion réducteur (GSH) (environ 2 à 10 mM) est beaucoup plus élevée que celle des fluides extracellulaires [24,25,26]. Ici, un nouveau type de nanoparticules composites composées de sphères de PDA en tant que noyau et de poly(acide méthacrylique) réticulé par liaison disulfure (PMAA) en tant que coque a été préparé, noté PDA@PMAA, qui maintient l'efficacité PTC du noyau PDA et le propriété redox-labile de la coque polymère. La structure, les propriétés et les comportements de libération de médicaments des nanoparticules composites PDA@PMAA ont été étudiés, et l'effet thérapeutique chimio-photothermique a été démontré par le test MTT.

Méthodes/Expérimental

Matériaux

Le chlorhydrate de dopamine (DA-HCl) et le chlorure de méthacryloyle et le glutathion (GSH) ont été obtenus auprès d'Aladdin Reagent Corporation, Shanghai, R.P. Chine. Acide méthacrylique (MAA) et N,N' -bis(acryloyl)cystamine (BAC) a été acheté chez Sigma-Aldrich. Le 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN) a été obtenu auprès de Sinopharm Chemical Reagent Company et recristallisé à partir d'éthanol. Solution aqueuse d'ammoniac (NH₃ •H₂ 0, 30 %), l'acétonitrile et l'éthanol anhydre ont été achetés auprès de Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Company. La doxorubicine (DOX) sous forme de chlorhydrate a été obtenue auprès de Beijing Huafeng United Technology Company. Le test MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) et d'autres réactifs biologiques ont été achetés auprès d'Invitrogen Corp. Le Calcein-AM a été acheté auprès de Bojin Biotech, Inc. (Xi'an) . Tous les réactifs chimiques étaient de qualité analytique ou supérieure et utilisés sans autre purification, sauf comme mentionné ci-dessus.

Caractérisation

Des images de microscopie électronique à transmission (MET) ont été observées sur un microscope électronique à transmission Tecnai G2 20 TWIN (FEI, USA). Les diamètres hydrodynamiques et les potentiels zêta des particules ont été déterminés par un analyseur de taille de particules à diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Malvern Nano-ZS90) à un angle de diffusion de 90°. Les spectres UV-vis ont été réalisés par un spectrophotomètre Perkin-Elmer Lambda 750 à température ambiante. Les spectres infrarouges à transformée de Fourier (FT-IR) ont été enregistrés à l'aide de plaques pressées au KBr sur une spectroscopie FTIR Nicolet 6700. Les effets de chauffage NIR des nanoparticules PDA et PDA@PMAA ont été caractérisés à l'aide d'un laser NIR à onde continue de 808 nm (Changchun New Industries Optoelectronics Technology, Changchun, Chine ; taille du spot :6 mm × 7 mm) avec une irradiation laser à une puissance densité de 5 W cm ⁻² pendant 300 s. Les températures avant et après l'éclairage ont été mesurées par un thermocouple avec une précision de 0,1 ^° C. Les images cellulaires ont été acquises avec un microscope confocal à balayage laser (CLSM, Leica TCS SP8 STED 3X).

NPA@PMAA Composite Nanoparticules

La synthèse des sphères PDA a été réalisée dans une solution mixte d'eau déminéralisée (90 ml), d'éthanol (40 ml) et de NH₃ •H₂ O (3 ml), en ajoutant 0,5 g de chlorhydrate de dopamine. La solution a été agitée à 30 ^° C pendant 24 h, et le produit a été centrifugé et lavé. L'enveloppe de PMAA a été synthétisée par polymérisation-distillation-précipitation référée à nos travaux précédents. Du MAA (100 mg), du BAC (10 mg) et de l'AIBN (3 mg) ont été dissous dans 25 ml d'acétonitrile, suivis de l'ajout de 50 mg de sphère PDA telle que préparée. Ensuite, le mélange a été chauffé à 100 ^° C agité pendant 2 h, et le produit a été centrifugé et lavé. Le rapport de masse du PDA et du MAA a varié de 0,5 à 6 pour ajuster l'épaisseur de la coque PMAA, et les détails de la recette ont été répertoriés dans le tableau 1.

Effets photothermiques de PDA@PMAA

La dispersion aqueuse de PDA@PMAA (50 g mL ⁻¹ ) placé dans une plaque cellulaire à 96 puits (100 L par puits) a été illuminé par un laser NIR 808 nm (5 W cm ^-2 ), et les températures avant et après l'éclairage ont été mesurées.

Chargement et libération du médicament

La DOX a été choisie comme médicament modèle pour étudier la charge de médicament et les performances de libération contrôlée des nanoparticules PDA ou PDA@PMAA. Des étapes spécifiques se sont référées à nos travaux antérieurs [27, 28]. Brièvement, 10 mg de nanoparticules PDA ou PDA@PMAA-1 ont été dispersés dans 1 mL de solution aqueuse de DOX (1 mg mL ⁻¹ ), qui a été préalablement ajusté à pH 8,0. Après une agitation douce pendant 24 h à température ambiante, la dispersion a été centrifugée pour collecter les nanoparticules PDA@PMAA chargées en DOX (12 000 tr/min, 10 min) puis lavée deux fois avec de l'eau déminéralisée pour éliminer la DOX non chargée. Les spectres d'absorbance UV du surnageant ont été mesurés et l'intensité à 480 nm a été utilisée pour analyser la charge et la libération de DOX. La teneur en charge médicamenteuse (LC) et l'efficacité d'encapsulation (EE) ont été exprimées selon les formules suivantes :LC (%) =(poids de médicament chargé)/(poids total de nanoparticules); EE (%) =(poids du médicament chargé)/(poids du médicament initialement ajouté).

L'étude de libération in vitro a été réalisée à 37 °C dans un tampon phosphate (pH 7,4 et 5,5) avec ou sans GSH. Typiquement, les nanoparticules PDA@PMAA chargées en DOX dispersées dans le tampon correspondant ont été placées dans un sac de dialyse (seuil de masse moléculaire 14 000 Da) puis immergées dans 100 ml du milieu de libération. Les échantillons ont été conservés à 37 ^° C sous agitation continue. À différents moments, 2 ml de tampon externe ont été prélevés pour l'analyse des spectres UV-vis et reconstitués avec un volume égal de milieu frais. Toutes les données de libération de DOX ont été moyennées sur trois mesures, et le contenu de libération a été calculé par la formule :Contenu de libération (%) =(quantité de médicament dans le milieu de libération)/(quantité de médicament chargée dans les nanoparticules) × 100. La libération de médicament Le comportement des nanoparticules PDA@PMAA chargées de DOX avec irradiation laser dans un tampon phosphate pH7,4 a été réalisé en suivant une procédure similaire. La lumière NIR a été appliquée pendant 5 minutes par heure.

Dosage cellulaire in vitro

Des cellules HEK-293T (cellules rénales embryonnaires humaines, cellules normales) et des cellules A549 (cellules épithéliales d'adénocarcinome pulmonaire humain, cellules cancéreuses) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de FBS (sérum bovin fœtal), de pénicilline (100 U ml ⁻¹ ) et streptomycine (100 mg mL ⁻¹ ) en atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂ à 37 °C.

Pour observer l'absorption cellulaire, les cellules A549 (1 × 10 ⁴ cellules par puits) ont été ensemencés en plaque 6 puits dans 1,5 mL de milieu. Le milieu a été remplacé par le milieu contenant des nanoparticules PDA@PMAA chargées en DOX après 24 h. Après 1 h ou 4 h, du DMEM frais et du PBS ont été ajoutés pour laver les nanoparticules libres non internalisées par les cellules avant l'observation de la fluorescence. La distribution intracellulaire des nanoparticules a été observée par CLSM. La fluorescence a été imagée à λ _EX (488 nm) pour la DOX, et la fausse couleur a été fixée artificiellement au rouge.

La cytotoxicité des nanoparticules chargées en DOX et vierges PDA@PMAA contre les cellules A549 a été évaluée par le test MTT standard. Les cellules (avec une densité de 10 ⁴ cellules par puits) ont été incubés dans des plaques à 96 puits pendant 24 h pour permettre la fixation des cellules. Ensuite, des nanoparticules PDA@PMAA chargées de DOX et vierges et de la DOX libre à diverses concentrations ont été ajoutées aux cellules, respectivement. Pour les groupes laser NIR, le laser (λ =808 nm) a été appliqué pour irradier les cellules à une densité de puissance de 5 W cm ⁻² pendant 300 s après 1 h d'incubation. Puis, après un temps d'incubation de 24 h à 37 ^° C, 20 L de solution de MTT (5 mg mL ⁻¹ dans du tampon phosphate) a été remplacé par du DMEM frais contenant du MTT (5 mg mL ^-1 ), et les cellules ont été incubées pendant encore 4 h. Ensuite, le surnageant a été retiré et 150 L de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés dans chaque puits pour dissoudre le formazan. L'absorbance a été contrôlée à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre après 10 min d'incubation. Chaque point de données a été collecté en faisant la moyenne de celui de cinq puits, et les cellules non traitées ont été utilisées comme témoins. Le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé en comparant l'absorbance des cellules témoins à celle des cellules traitées. Le même processus de cytotoxicité des nanoparticules composites vierges contre les cellules HEK-293T a été effectué comme mentionné ci-dessus.

Pour visualiser les effets antitumoraux des nanoparticules PDA@PMAA et des nanoparticules PDA@PMAA chargées de DOX avec ou sans irradiation laser NIR, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 3 × 10 ⁴ cellules par puits. Les cellules ont été exposées aux nanoparticules PDA@PMAA-1, aux nanoparticules PDA@PMAA-1 chargées de DOX ou à la DOX libre pendant 24 h à une concentration de nanoparticules de 100 μg mL ⁻¹ ou concentration de DOX équivalente de 5 g mL ⁻¹ . Pour les groupes laser NIR, le laser (λ =808 nm) a été appliqué pour irradier les cellules à une densité de puissance de 5 W cm ⁻² pendant 300 s après 1 h d'incubation. Par la suite, les cellules ont été incubées avec Calcein-AM pendant 30 min, lavées trois fois à l'aide de PBS et observées à l'aide de CLSM à λ _EX (490 nm).

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation des nanoparticules PDA@PMAA

La sphère PDA est préparée dans des conditions de base via méthode d'oxydation en solution. Le revêtement chimique de la sphère PDA avec une couche de polymère réticulé au disulfure a été réalisé par une méthode de polymérisation par distillation-précipitation qui utilise respectivement le MAA et le BAC comme monomère et agent de réticulation (Fig. 1). Cette nanoparticule composite multifonctionnelle offre de nombreux avantages par rapport aux autres nanoparticules thérapeutiques sous trois aspects. Premièrement, le cœur du PDA présente des performances photothermiques exceptionnelles sous irradiation NIR. Deuxièmement, l'incorporation d'une liaison disulfure offre une dégradation sélective des enveloppes polymères ainsi qu'une libération contrôlée de médicament lors de l'entrée dans les cellules cancéreuses. Troisièmement, la coque PMAA fournit aux nanoparticules une excellente stabilité colloïdale. L'épaisseur de la couche de PMAA peut être contrôlée en ajustant le rapport de masse des sphères MAA et PDA. La figure 2 montre les images MET des sphères PDA obtenues et des nanoparticules PDA@PMAA. Il est clair que les nanoparticules PDA et PDA@PMAA sont mono-dispersées et de forme sphérique. Les sphères PDA avaient un diamètre moyen de ~ 100 nm, et la taille des nanoparticules hybrides PDA@PMAA variait de 120 ± 5 à 200 ± 10 nm avec le rapport de masse de PDA à MAA allant de 0,5 à 6. La taille hydrodynamique (D _h ) et la distribution de la taille des nanoparticules PDA et PDA@PMAA ont également été caractérisées par la diffusion dynamique de la lumière (DLS), comme indiqué dans le tableau 2. Les nanoparticules PDA@PMAA avaient une distribution de taille étroite, généralement avec une valeur IP de 0,09 à 0,14. Le D_h de la série de nanoparticules PDA@PMAA allaient de 176 à 349 nm en faisant varier le rapport de masse de PDA à MAA, ce qui était conforme à la tendance de croissance de la taille de l'observation MET. Notamment, le D_h des nanoparticules composites étaient plus grandes que la taille déterminée par MET, suggérant que les nanoparticules composites sont fortement gonflées en milieu aqueux [29]. Le potentiel des nanoparticules de PDA était de − 26,8 mV en raison des groupes catéchol à la surface du PDA. Le potentiel ζ des nanoparticules PDA@PMAA est passé de − 30,2 à 33,2 indiquant l'existence de groupes carboxyle provient de la coque PMAA.

Illustration schématique de la synthèse, de l'effet photothermique, du chargement de médicament et de la libération de médicament sensible aux stimuli de nanoparticules PDA@PMAA

Images MET de nanoparticules PDA@PMAA (barre d'échelle, 200 nm). un PDA. b [email protected]. c PDA@PMAA-1. d PDA@PMAA-2. e PDA@PMAA-4. f PDA@PMAA-6

Étant donné que le MAA est sensible au pH, on peut en déduire que les nanosphères PDA@PMAA ont également une sensibilité au pH. Comme le montre la figure 3, les nanoparticules PDA@PMAA-1 ont été prises comme exemple pour étudier la dépendance au pH de la taille hydrodynamique des nanoparticules revêtues de PMAA. On constate qu'en tampon phosphate de pH 8,5, les nanoparticules PDA@PMAA-1 ont un diamètre hydrodynamique d'environ 240 nm; tandis que dans un environnement acide de pH 3,0, leur taille hydrodynamique a considérablement diminué à env. 150 nm. Parce que les chaînes polymères PMAA sont fortement ionisées à pH élevé, et la forte répulsion électrostatique entre les chaînes polymères a entraîné une augmentation de la taille hydrodynamique, tandis qu'à faible pH, le faible degré d'ionisation des chaînes PMAA conduit à un rétrécissement de la taille [30]. Les nanoparticules PDA@PMAA sensibles au pH présentent un grand potentiel de libération contrôlée de médicament dans les cellules tumorales (pH inférieur à 6,5) car l'effondrement de la couche de polymère en forme d'éponge pourrait faciliter la libération de médicament. Les structures chimiques des nanoparticules PDA@PMAA ont été caractérisées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Fig. 4). Dans les spectres des nanoparticules BAC et PDA@PMAA, les bandes apparaissant à 1650 et 1550 cm ⁻¹ , qui sont attribuées aux bandes amide I et II typiques de BAC, ont démontré que l'agent de réticulation BAC avait été introduit avec succès dans la nanoparticule composite [25]. Le pic à 1706 cm ⁻¹ , qui appartient à la vibration d'étirement des groupes C=O dans PMAA, peut être clairement vu dans la nanoparticule PDA@PMAA autre que la nanoparticule PDA, suggérant le revêtement réussi de la couche PMAA.

Diamètre hydrodynamique des nanoparticules PDA@PMAA-1 dans un tampon phosphate à différents pH

Spectres FTIR des agents de réticulation BAC, des nanoparticules PDA et des nanoparticules PDA@PMAA (de haut en bas)

Effet photothermique des nanoparticules PDA@PMAA

L'intensité d'absorbance dans la région NIR est le principal facteur qui détermine la capacité PTC d'un agent PTC. Pour explorer la capacité d'absorption de la lumière des nanoparticules PDA@PMAA, leurs spectres UV-vis sont résumés sur la figure 5a. On peut voir que chaque échantillon a une absorption évidente dans la région NIR de 600 à 1000 nm. Par rapport au PDA@PMAA, le PDA présente l'absorption la plus élevée à 808 nm à une concentration massique équivalente. L'absorbance des nanoparticules PDA@PMAA augmentait avec la diminution de l'épaisseur de la coque PMAA (de PDA@PMAA-6 à PDA@PMAA-0,5). La forte absorption optique dans la région NIR nous a encouragés à approfondir l'étude de l'effet photothermique du PDA@PMAA. Comme le montre la figure 5b, l'effet photothermique de la dispersion aqueuse PDA et PDA@PMAA a été mesuré à la concentration de 100 g mL ⁻¹ irradié avec un laser 808 nm à 5 W cm ⁻² pendant 300 s. De l'eau pure a été utilisée comme témoin négatif. La température de dispersion du PDA a été augmentée de 41 ^° C et supérieur à tous les échantillons PDA@PMAA, ce qui était cohérent avec son absorption maximale à 808 nm. La température augmentée par les dispersions PDA@PMAA pourrait atteindre de 17 à 33 ^° C avec la diminution de l'épaisseur de la coque PMAA (de PDA@PMAA-6 à PDA@PMAA-0,5), bien supérieure à celle provoquée par le contrôle de l'eau pure (n'atteignant que 3,5 ^° C). Des études antérieures ont suggéré que la thérapie thermique avec une température supérieure à 55 ^° C a montré de grands avantages dans l'ablation thermique des tumeurs solides [31]. En comparant l'élévation de température maximale d'une série de nanoparticules PDA@PMAA, seul PDA@PMAA-0,5 (58 ^° C) et PDA@PMAA-1 (56 ^° C) peut atteindre jusqu'à 55 ^° C. Considérant que la coque PMAA doit avoir une certaine épaisseur pour assurer sa capacité de chargement de médicament, PDA@PMAA-1 a été choisi comme représentatif dans les expériences suivantes.

un Spectres UV-vis des dispersions aqueuses PDA et PDA@PMAA à une concentration de 100 g mL ⁻¹ . b Effet photothermique des dispersions aqueuses PDA et PDA@PMAA à une concentration de 100 μg mL ⁻¹ ont été mesurés par irradiation laser (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² )

Libération de médicament in vitro

La doxorubicine (DOX) a été choisie comme médicament modèle pour confirmer la capacité potentielle des nanoparticules composites PDA@PMAA-1 à libérer le médicament encapsulé dans des conditions réductrices. Le chargement de DOX dans des nanoparticules composites a été effectué à une teneur théorique en médicament de 9,1 % en poids et à une concentration de polymère de 10 mg mL ⁻¹ , et la teneur finale en médicament et l'efficacité d'encapsulation étaient respectivement de 5,1 % et 53,7 %. Il a indiqué que la DOX peut être chargée efficacement dans le réseau polymère. Des nanoparticules de PDA chargées en DOX ont également été préparées à des fins de comparaison, dont la teneur en charge en DOX était de 3,7%. La capacité de charge médicamenteuse plus élevée des nanoparticules PDA@PMAA-1 peut être attribuée à la forte interaction électrostatique entre le groupe amino des molécules DOX et les groupes carboxyle des chaînes PMAA [25]. Compte tenu de cela, la coque PMAA porte des liaisons disulfure clivables redox, les médicaments préchargés seront déclenchés pour libérer efficacement les médicaments préchargés dans des conditions réductrices. Compte tenu du microenvironnement tumoral légèrement acide et de l'énorme différence de concentration de GSH entre l'intracellulaire (1 à 10 mM) et le plasma (20 à 40 M), les expériences de libération de médicament in vitro ont été conçues et menées en utilisant des tampons phosphate de pH 7,4 et 5,5 avec ou sans GSH 10 mM pour imiter l'environnement des cellules tumorales et de la circulation sanguine [23, 32, 33]. Comme le montre la figure 6, la quantité de médicament libérée n'est que de 10,8 % sur une période de 24 h, ce qui suggère que la DOX était maintenue de manière stable dans les nanoparticules PDA@PMAA-1 lorsqu'elles étaient dispersées dans des conditions physiologiques. En présence de 10 mM de GSH, une libération remarquablement rapide du médicament a été détectée, où la libération cumulative de DOX était d'environ 72,8% en 24 h, en raison de la dégradation des coquilles de PMAA liées par disulfure dans un environnement réducteur. Pourtant, la structure du noyau du PDA conserve son intégrité après la dégradation sensible à l'oxydoréduction (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). De plus, une libération brutale (environ 87 % en 24 h) de DOX a été observée dans des tampons phosphate de pH 5,5 avec 10 mM de GSH, en raison de la protonation des groupes carboxyle du PMAA dans des conditions acides, ce qui a en outre provoqué l'effondrement du polymère. réseaux. Ces profils de libération impliquaient la caractéristique prometteuse des nanoparticules PDA@PMAA pour la libération contrôlée de médicaments, car les nanoparticules présentent une faible fuite de médicaments dans le plasma, libérant cependant des médicaments rapidement lorsqu'elles pénètrent dans les cellules tumorales. De plus, une libération lente du médicament (environ 13% en 24 h) pour les nanoparticules PDA@PMAA chargées de DOX avec irradiation NIR dans des tampons phosphates de pH 7,4 a été détectée, indiquant que les nanoparticules PDA@PMAA maintiennent l'intégrité structurelle lors de l'irradiation. Le comportement de libération des nanoparticules de PDA en présence de 10 mM de GSH a montré une remarquable faible libération de médicaments (environ 30 % en 24 h) par rapport aux nanoparticules PDA@PMAA-1 (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). L'énorme différence dans les comportements de libération des nanoparticules PDA et PDA@PMAA a suggéré que l'introduction d'une coque polymère dégradable réticulée par une liaison disulfure a donné lieu à la libération efficace de médicaments déclenchée par Redox.

Profils de libération DOX des nanoparticules PDA@PMAA-1 à 37 ^° C dans 7.4 tampon phosphate (○), dans 7.4 tampon phosphate avec irradiation laser NIR (□, dans 7.4 tampon phosphate avec 10 mM GSH (cercle rouge), ou dans 5.5 tampon phosphate avec 10 mM GSH (cercle vert)

Dosages cellulaires

L'étude de l'absorption cellulaire et de la libération intracellulaire de médicaments de nanoparticules PDA@PMAA chargées de DOX a été menée contre la lignée cellulaire A549. Comme le montre la figure 7, une fluorescence rouge pour la DOX peut être observée dans le cytoplasme cellulaire après 1 h d'incubation, indiquant une internalisation rapide des nanoparticules contre les cellules tumorales. Après 4 h d'incubation, une forte fluorescence rouge a été observée dans tout le cytoplasme et le noyau de la cellule. Il a suggéré que davantage de nanoparticules étaient endocytisées par les cellules et libéraient efficacement la DOX par la dégradation des enveloppes polymères dans l'environnement réducteur des cellules tumorales.

Images CLSM de cellules A549 cultivées avec des nanoparticules PDA@PMAA chargées en DOX pour (a ) 1 h et (b ) 4h. Dans chaque rangée, des images de microscopie à contraste d'interférence différentielle, des images de fluorescence et des images de superposition ont été affichées de gauche à droite, respectivement. (barre d'échelle, 50 m)

Pour évaluer la biocompatibilité de PDA@PMAA, une cellule normale typique (cellules HEK-293T) a été choisie pour le test de viabilité cellulaire par dosage MTT. Comme le montre la figure 8, aucune cytotoxicité évidente des nanoparticules vierges PDA@PMAA-1 n'a été détectée à une large plage de concentrations de 0,1 à 100 g mL ⁻¹ , indiquant la bonne biocompatibilité des nanoparticules PDA@PMAA-1 qui assure leur application dans le domaine biomédical. Ensuite, la viabilité cellulaire contre les cellules A549 (cellules tumorales) en fonction de la concentration d'incubation du blanc ou des nanoparticules chargées en DOX PDA@PMAA-1 a été mesurée, et chaque groupe a été subdivisé en groupes avec ou sans exposition au laser NIR (Fig. 9 ). Presque aucun effet sur la viabilité cellulaire n'a été observé pour le groupe blanc PDA@PMAA-1 sans laser, indiquant que les nanoparticules composites vierges n'ont aucune cytotoxicité. Après 5 W cm ⁻² Irradiation laser NIR pendant 300 s, la viabilité cellulaire du groupe vierge PDA@PMAA-1 a manifestement diminué et ~   54,3 % des cellules ont été tuées à une concentration de 100 g mL ⁻¹ . Les résultats impliquaient que ces nanoparticules PDA@PMAA-1 étaient cytotoxiques contre les cellules A549 par irradiation NIR induisant une hyperthermie. En ce qui concerne les groupes chargés en DOX, les nanoparticules PDA@PMAA-1 chargées en DOX montrent une diminution de la viabilité cellulaire d'une manière dose-sensible, qui ont une efficacité similaire à la DOX libre, indiquant une libération complète de médicaments à partir de PMAA réticulé par liaison disulfure coquilles. Pour les cellules traitées par des nanoparticules PDA@PMAA-1 chargées de DOX avec une exposition au laser NIR, la viabilité cellulaire montre une diminution plus importante par rapport au groupe sans irradiation, en particulier à une dose élevée de médicament. Par exemple, lorsque les cellules ont été traitées avec 100 g mL ⁻¹ PDA@PMAA-1 chargé en DOX (contenant 5 μg mL ⁻¹ DOX), la viabilité cellulaire a été réduite à environ 15,7%, ce qui était bien inférieur au traitement photothermique (~ 54,3%) ou à la chimiothérapie (~ 38,1%) seul avec la même dose de nanoparticules. Notamment, l'inhibition cellulaire à 50% (IC₅₀ ) la valeur du PDA@PMAA-1 chargé de DOX avec une exposition au laser NIR à court terme a été déterminée à 2 μg mL ⁻¹ , qui était bien inférieure à celle de la DOX libre (6,3 μg mL ⁻¹ ). Cela suggère que la thérapie chimio-photothermique des nanoparticules PDA@PMAA chargées en DOX a démontré un effet synergique, qui peut être attribué à la cytotoxicité accrue de la DOX à température plus élevée [34, 35]. En revanche, le groupe DOX libre avec laser NIR ne montre pas un effet synergique similaire car il n'y a pas d'hyperthermie locale causée par l'irradiation laser NIR. Les images de fluorescence de cellules colorées à la Calcéine-AM (cellules vertes et vivantes) après traitement montrent que le nombre de cellules vivantes traitées par des nanoparticules PDA@PMAA chargées de DOX lors d'une irradiation laser NIR était significativement inférieur à celui des autres groupes, ce qui a encore confirmé l'antitumoral synergique effet des nanoparticules PDA@PMAA chargées en DOX avec une irradiation lumineuse NIR (Fig. 10). Bénéficiant de l'effet synergique positif du traitement combiné chimio-photothermique, il permet à une dose de médicament cytotoxique plus faible d'obtenir le même effet antitumoral, évitant ainsi les effets secondaires graves sur les tissus normaux à une dose élevée de médicament. Prises ensemble, les données ci-dessus suggèrent que ces nanoparticules PDA@PMAA peuvent efficacement libérer des médicaments dans des conditions de réduction intracellulaire et afficher un effet synergique de destruction des cellules tumorales pour la thérapie chimio-photothermique combinée, qui a démontré leur grand potentiel pour le traitement du cancer.

Viabilité cellulaire des cellules HEK-293 exposées à des nanoparticules vierges PDA@PMAA-1 pendant 24 h

Viabilité cellulaire des cellules A549 traitées avec des nanoparticules DOX libres, PDA@PMAA-1 et des nanoparticules PDA@PMAA-1 chargées en DOX à diverses concentrations sans ou avec irradiation laser NIR (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) pendant 300 s

Images de fluorescence confocale de cellules A549 vivantes traitées avec du PBS, des nanoparticules PDA@PMAA-1, des nanoparticules PDA@PMAA-1 chargées en DOX et du DOX libre avec ou sans irradiation laser NIR (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) pendant 300 s. Les cellules vivantes ont été colorées avec de la Calcéine-AM (vert). La barre d'échelle est de 50 μm

Conclusion

Les nanoparticules composites multifonctionnelles core-shell PDA@PMAA ont été synthétisées en enduisant une couche de PMAA réticulée au disulfure sur des nanoparticules de PDA via une polymérisation par distillation-précipitation. Les nanoparticules composites ont présenté un excellent effet de conversion photothermique et une dégradation redox-labile de la couche de PMAA. Pour un échantillon type PDA@PDA@PMAA-1, la température des dispersions PDA@PMAA a été augmentée de 31 ^° C à la concentration de 100 μg mL ⁻¹ irradié avec un laser 808 nm à 5 W cm ⁻² pendant 300 s. The DOX-loaded PDA@PMAA-1 nanoparticles were stable under the physiological environment with low leakage of DOX (10.8% in 24 h), while a rapid and full release of DOX was triggered in the reducing and weakening acidic condition (pH5.5 + 10 mM GSH). The cell viability of A549 cells treated with PDA@PMAA-1 nanoparticles under NIR irradiation was reduced significantly to about 15.7% at relatively low equivalent drug concentration (5 μg mL ⁻¹ ), which was much lower than photothermal (~ 54.3%) or chemotherapy (~ 38.1%) treatment alone under the same dose of nanoparticles and drugs. So the DOX-loaded composite nanoparticles realized a synergistic inhibition effect against cancer cells by the combination of photothermal therapy and traditional chemotherapy. This work demonstrated the feasibility of such composite nanoparticles to be a powerful platform for controlled drug delivery and could be exploited as combined chemo-photothermal therapy with improved therapeutic efficacy.

Disponibilité des données et des matériaux

The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on request.

Abréviations

AIBN:

2,2-Azobisisobutyronitrile

BAC:

N,N' -bis(acryloyl)cystamine

DA-HCl:

Dopamine hydrochloride

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

DOX:

Doxorubicin

FBS :

Sérum fœtal bovin

FT-IR :

Infrarouge à transformée de Fourier

GSH :

Glutathione

MAA:

Methacrylic acid

NIR :

Proche infrarouge

PDA :

Polydopamine

PMAA:

Poly(methacrylic acid)

PTC:

Photothermal conversion agents

PTT :

Thérapie photothermique

TEM :

Microscopie électronique à transmission