Utilisation de nanoparticules magnétiques chargées positivement pour capturer des bactéries à très faible concentration

Contexte

Les maladies infectieuses sont parmi les défis de santé les plus urgents au monde. La contamination microbienne des ressources en eau est une menace majeure pour la santé publique. Escherichia coli (E. coli ), une bactérie gram-négative, est très courante dans l'eau et les aliments contaminés. Certaines souches de E. coli peut même provoquer de graves infections bactériennes. Les bactéries à de faibles concentrations sont difficiles à détecter et nécessitent généralement un processus de pré-enrichissement avant une analyse plus approfondie. Les méthodes microbiologiques basées sur la culture sont laborieuses et peuvent prendre plusieurs jours. De plus, certaines souches bactériennes peuvent entrer dans un état viable mais non cultivable où elles sont viables mais non cultivables sur gélose de routine, ce qui empêche leur détection par des méthodes basées sur la culture [1]. Inversement, la capture et la décontamination rapides des agents pathogènes bactériens pourraient fournir des résultats en temps réel pour atténuer les épidémies de maladies infectieuses.

Une variété de matériaux est développée pour la capture et l'élimination rapides des bactéries de la source contaminée. Des nanotubes de carbone et des billes d'oligoacyllysine liées à une résine ont été utilisés pour éliminer les bactéries de l'eau [2, 3]. Les nanoparticules magnétiques, qui peuvent être facilement séparées de diverses ressources par l'emploi d'un processus magnétique, ont été largement utilisées pour la détection et la décontamination des bactéries après fonctionnalisation avec des molécules organiques [4,5,6]. Les techniques à base magnétique présentent les avantages d'une capture de cible par un gain de temps (temps de séparation commun inférieur à 1 h), une récupération élevée, une automatisation possible et une séparation à grande échelle [7]. L'efficacité et la sélectivité de la séparation magnétique dépendent en grande partie des ligands, mais il est parfois difficile d'obtenir un ligand avec une affinité et une spécificité élevées pour la cible. Par conséquent, il est nécessaire de développer un système de capture bactérienne avec des nanoparticules magnétiques indépendantes du ligand pour capturer les bactéries, en particulier sous de faibles concentrations.

De nombreux scientifiques ont étudié la nature de la charge électrique des bactéries. Bechhold (1904) a été le premier à découvrir que les cellules bactériennes portent une charge négative [8]. Alors qu'il était déjà connu que les grandes populations de cellules bactériennes avaient tendance à maintenir une charge négative, on sait peu de choses sur l'électrophysiologie des bactéries au niveau des cellules individuelles. En 2011, Cohen et al. a révélé des pointes électriques dans E. coli jusqu'à 1 Hz en utilisant une protéine fluorescente indicatrice de tension [9]. Étant donné que de nombreux types de parois cellulaires bactériennes sont chargées négativement, les nanoparticules chargées positivement peuvent interagir fortement avec un large spectre de bactéries via des interactions électrostatiques.

Pour tirer parti des nanoparticules magnétiques et de la charge négative des bactéries individuelles pour une détection rapide des agents pathogènes, nous avons conçu un système pour capturer les bactéries à faible concentration. Des nanoparticules magnétiques chargées positivement ont été fabriquées par de la polyéthylèneimine (PEI), qui est composée d'abondants groupes amine. Ensuite, nous avons étudié l'affinité des nanoparticules fonctionnalisées PEI contre E. coli . Cette méthode innovante permet une liaison efficace aux bactéries par interactions électrostatiques.

Matériaux et méthodes

Nanomatériaux

Chlorure de fer (III) hydraté (FeCl₃ ·6H₂ O), hydroxyde d'ammonium (NH₄ OH, 28 % en poids), de l'acide chlorhydrique (solution aqueuse à 37 % en poids), de l'éthylène glycol et de l'acétate de sodium ont été achetés auprès de Shanghai (China) Reagent Company. L'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS), le (3-aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) et la fluorescéine tétraméthylrhodamine (TRITC) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (USA). Poly(éthylène imine) ramifié (PEI, 99%, Mw =10 000) a été acheté à Alfa Aesar. Toutes les solutions ont été préparées en utilisant de l'eau déminéralisée Milli-Q (18,2 MΩ cm à une résistivité de 25°C).

Synthèses NP

Fe₃ O₄ les nanoparticules ont été préparées par une réaction solvothermique [10]. Brièvement, 0,081 g de FeCl₃ ·6H₂ O a été dissous dans 30 mL d'éthylène glycol sous agitation magnétique. Ensuite, 0,3 µg d'acide polyacrylique (PAA) et 1,8 µg d'urée ont été ajoutés à cette solution. Après avoir été agitée pendant 30 min, la solution a été chauffée à 200 °C pendant 12 h en utilisant un autoclave en acier inoxydable revêtu de téflon. Une fois refroidi à température ambiante, un produit noir, à savoir des noyaux de nanoparticules magnétiques, a été collecté par un aimant. Suivi d'un lavage à l'éthanol et à l'eau déminéralisée trois fois, le Fe₃ O₄ les nanoparticules ont été traitées avec 0,15 M de HCl sous sonication pendant 15 min, puis ont été recouvertes de silice par hydrolyse et TEOS.

Pour préparer les nanoparticules magnétiques fluorescentes chargées négativement (NP-), le complexe APTES-TRITC (C33H44N3O6Si) a d'abord réagi dans des conditions d'obscurité pendant la nuit dans de l'éthanol. Le complexe a ensuite été greffé au Fe₃ O₄ nanoparticules par réaction entre APTES et groupes hydroxyle sur le Fe₃ O₄ @SiO₂ nanoparticule. Par la suite, 30 μL de TEOS ont été ajoutés et mis à réagir pendant 24 h dans l'obscurité. Suivi par trois lavages à l'éthanol et à l'eau déminéralisée, des NP- fluorescentes ont été produites. Grâce à la modification de NP− avec le polymère polycationique PEI, les nanoparticules magnétiques chargées positivement (NP+) ont été achevées.

Caractérisation NP

Des études de microscopie électronique à transmission (MET) ont été réalisées par un TECNAI F ^− 30 Microscope électronique à transmission haute résolution fonctionnant à 300 kV. La taille des particules et le potentiel zêta des NP ont été déterminés par la série Malvern Zeta Sizer Nano (Westborough, MA). La fluorescence a été examinée avec un microscope confocal à balayage laser Carl Zeiss LSM5 EXITER (Zeiss, Iéna, Allemagne).

Préparation des bactéries

La souche gram-négative E. coli BL21 ont été utilisées comme bactéries modèles. E. coli a été cultivé dans 100 mL de milieu de croissance Luria Broth [11]. Les bactéries ont été cultivées dans un incubateur thermostatique à 200 rpm, 37 °C pendant 16 h. Par la suite, 100 μL de la culture bactérienne ont été prélevés, dilués avec le milieu 1 × 10 ⁵ fois, enduit sur la gélose, et cultivé à 37°C pendant 24h. Le nombre d'unités formant des colonies a été compté. Les cellules bactériennes restantes ont été récoltées par centrifugation à 5000 rpm pendant 5 min, lavées trois fois avec 1 × PBS (10  mM, pH   7,4) et diluées à des concentrations d'environ 1 × 10 ³ unité formatrice de colonies (UFC)/mL. Pour des raisons de sécurité, tous les échantillons bactériens ont été placés dans un autoclave à 121 °C pendant 20 min pour tuer les bactéries avant élimination et toute la verrerie en contact avec les bactéries a été stérilisée avant et après utilisation.

Expérience de capture de bactéries

Toutes les études de capture par lots ont été réalisées dans du tampon PBS 1x stérilisé. Quarante microlitres de NP (1 μg/μL) ont été dispersés dans le sérum physiologique stérilisé sous ultrasons pendant 10 min, puis 1 mL de la solution bactérienne (environ 10 ³ UFC/mL) a été ajouté à la suspension. Après une incubation de 10 min, les bactéries liées au NP ont été capturées via un aimant permanent sur la paroi du flacon, et les bactéries libres ont été éliminées avec la solution de lavage. Les bactéries capturées ont été libérées en retirant l'aimant et remises en suspension dans du PBS. Pour l'analyse microscopique, une aliquote de bactéries a été étalée sur des lames et colorée avec Hema-3 (Fisher Diagnostics). Pour l'analyse par immunofluorescence, une aliquote de bactéries a été étalée sur des lames et colorée au 4′-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).

Efficacité de capture bactérienne des NP à différentes concentrations

Un millilitre de suspension bactérienne (environ 2 × 10 ² CFU/mL) a été incubée avec différentes quantités (5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 et 100 g/mL) de NP+ ou NP− pendant 10 min. Après séparation magnétique par les nanoparticules, la solution totale a ensuite été échantillonnée et analysée pour la concentration bactérienne via une méthode de comptage sur plaque. L'efficacité de capture bactérienne des NP a été testée en comptant le nombre d'UFC sur les plaques de gélose LB.

Capacité des NP à capturer les bactéries à faibles concentrations

Quarante microgrammes de NP+ ou NP− ont été incubés avec 1 mL de suspension bactérienne à de très faibles concentrations (10 et 10 ² UFC/mL). Après séparation magnétique par les nanoparticules, la solution totale a ensuite été échantillonnée et analysée pour la concentration bactérienne via une méthode de comptage sur plaque. L'efficacité de capture bactérienne des NP a été testée en comptant le nombre d'UFC sur les plaques de gélose LB.

Analyse statistique

Les résultats ont été exprimés en moyenne ± ± écart type (SD) comme indiqué dans les légendes des figures. Une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) avec une analyse hoc appropriée a été calculée à l'aide du logiciel GraphPad Prism avec P valeurs < 0,05 considérées comme statistiquement significatives.

Résultats

Caractérisation des NP magnétiques

Le schéma de principe pour la préparation des nanoparticules composites magnétiques chargées en surface est présenté sur la figure 1. Le Fe₃ O₄ les nanoparticules sont conjuguées à l'APTES pour former une fine couche de SiO₂ coquille à la surface des nanoparticules lors de la réaction avec TEOS et NH₄ OH. Pour visualiser et quantifier directement les cellules capturées, le complexe APTES-TRITC est d'abord mis à réagir, suivi d'un greffage à la surface du Fe₃ O₄ @silica composites par une réaction sol-gel classique. Des groupements SiOH abondants régissent la surface globale de ce produit, présentant une forte charge de surface négative, à savoir des nanoparticules magnétiques chargées négativement (NP-). Pour les nanoparticules magnétiques chargées positivement (NP+), les molécules PEI sont utilisées pour couvrir et modifier la surface de NP−. Le produit modifié montre une forte charge de surface positive en raison de la présence abondante de groupes amine.

Conception des nanoparticules. Diagramme schématique montrant la conception de nanoparticules composites (NP) fluorescentes, superparamagnétiques, chargées en surface

Comme le montre la figure 2a, la MET a démontré que les nanoparticules composites magnétiques avaient un diamètre de 450  nm, qui étaient composées de SiO₂ uniforme. revêtement (taille de 60 nm). La diffusion dynamique de la lumière (DLS) des particules de la figure 2b a affiché une distribution de taille étroite avec un diamètre moyen accru après la fonctionnalisation de la surface. Les tailles maximales des nanoparticules composites avec les charges positives et négatives sont respectivement de 620 et 700  nm. Les nanoparticules mesurées par DLS sont généralement plus grosses que celles mesurées par MET. En effet, la taille évaluée par le DLS est influencée par le mouvement brownien et dépend de la température ambiante, du rayon dynamique de la nanoparticule et de l'étendue de l'agglomération des nanoparticules déclenchée par un environnement statique via l'apparition de conflits [12]. La figure 2c montre les distributions de potentiel zêta des nanoparticules négatives et positives. Dans l'eau déminéralisée (pH 7,0), les potentiels zêta des NP− et NP+ sont respectivement de − 26,6 mV et + 28,1 mV. Les dépendances au pH des potentiels zêta pour NP+ sont décrites dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1. Ces résultats ont indiqué que les nanoparticules chargées en surface sont bien dispersées dans une solution aqueuse dans des conditions neutres, ce qui pourrait être appliqué pour la capture cellulaire.

Caractérisation des nanoparticules. un Image en microscopie électronique à transmission (MET) de nanoparticules chargées positivement (NP+) et de nanoparticules chargées négativement (NP−). b Taille de diffusion dynamique de la lumière et distribution des NP. c Distributions potentielles zêta des NPs

Capacité des NP magnétiques à capturer E. coli

La figure 3 montre la procédure expérimentale générale de capture de bactéries. Les NP ont été mélangées avec une solution de bactéries et incubées à température ambiante pendant 10 min. Par la suite, nous avons utilisé un aimant permanent pour capturer les bactéries « magnétisées » (nanoparticules magnétiques liées à la surface cellulaire) sur la paroi du tube. Après élimination de la solution restante et lavage des agrégats par PBS (avec un aimant à l'extérieur), nous avons transféré les agrégats sur une lame pour analyse microscopique. Comme le montre le schéma, NP+ fournit une réactivité électrostatique suffisante pour enrichir rapidement E. coli . Au contraire, les bactéries sont éliminées par rinçage au PBS dans l'expérience NP−.

Illustration des procédures de capture des bactéries. E. coli en suspension sont respectivement mélangés avec NP+ et NP-, suivis d'une incubation de 10 min. Les bactéries « magnétisées » ont été attirées sur la paroi du flacon par un aimant. Après l'élimination de la solution restante, les bactéries ont été capturées par les NP, lavées à l'aide de PBS et comptées à partir du nombre de colonies bactériennes

Les images optiques des nanoparticules sont présentées sur la figure 4. L'image optique de NP− a montré les particules monodispersées et uniformément réparties. Cependant, NP+ avait tendance à s'agglomérer. La distribution de taille de NP+ est évidemment plus large que celle de NP−. Ces résultats ont démontré que NP+ et NP− avaient un modèle d'interaction complètement différent avec E. coli . Pour étudier plus avant l'affinité bactérienne de NP+, la localisation NP+ dans E. coli a été examiné par analyse de fluorescence. La figure 5a montre que E. coli sont positifs pour le DAPI (couleur bleue) et le TRITC (couleur rouge). Afin de confirmer clairement l'affinité du NP+ pour les bactéries, la technologie TEM a été utilisée. Sur la figure 5b, un certain nombre de NP+ ont été observés pour s'agréger sur la paroi cellulaire bactérienne. Ces résultats suggèrent que NP+ a une forte affinité pour les bactéries.

Comparaison de E. coli capacité de liaison de NP+ et NP-. Les images de gauche sont les champs en contraste de phase des bactéries se liant à NP+. Les images de droite ne contiennent que des nanoparticules, ce qui suggère que NP− sans capacité de liaison à E. coli cellules

Images fluorescentes et MET de E. coli liaison avec NP+. un Les panneaux supérieurs montrent les images fluorescentes de E. coli cellules se liant à NP+. Le DAPI est utilisé pour colorer le noyau cellulaire. Le TRITC est étiqueté en NP. b Les panneaux inférieurs sont des images MET représentatives montrant NP+ et E. coli complexes

Détection de faibles concentrations d'E. coli

Pour caractériser davantage la dynamique des interactions bactériennes et NP+, nous avons incubé E. coli à un nombre constant (2 × 10 ² UFC/mL) avec diverses concentrations de NP allant de 5 à 100 μg/mL. Les bactéries liées aux NP ont ensuite été capturées magnétiquement et séparées. Les efficacités de capture magnétique des bactéries par NP+ et NP− sont tracées comme le montre la figure 6. Le nombre de E. coli capturé par NP− n'est que de 12% même à une concentration élevée de 100 μg/mL. Contrairement au NP−, le NP+ a montré d'importantes capacités de capture bactérienne et atteint 81 % d'efficacité de capture avec 40  μg/mL (P < 0,001). Comme on peut le voir sur les plaques de gélose LB, une augmentation dose-dépendante des colonies bactériennes avec NP+ a été démontrée.

Capturez l'efficacité de E. coli par NP+ ou NP- aux différentes concentrations indiquées. L'image de gauche est la photographie de plaques de gélose LB recouvertes de E. coli capturé par NP+ et NP−. L'image de droite montre l'efficacité de capture bactérienne des NP à différentes concentrations indiquées. E. coli (2 × 10 ² CFU dans 1 mL de solution PBS) sans incubation NP a été compté comme 100 % et a servi de contrôle. *P < 0,05, ***i>P < 0,01, ****P < 0.001

Afin de confirmer l'affinité NP+ pour E. coli à une concentration ultra-faible, nous avons mélangé 40 μg de NP avec 1 ml de solution PBS contenant seulement 10 et 100 CFU de E. coli . La figure 7 montre des photographies des colonies résultantes dans des plaques de gélose pour tous les échantillons. Comme prévu, le NP+ a en effet capturé E. coli à une concentration ultra-faible, alors que les colonies bactériennes n'étaient pas évidentes dans les plaques utilisant NP-. Les quelques colonies dans la plaque pourraient être attribuées à l'affinité non spécifique des nanoparticules. Une analyse plus poussée a indiqué que plus de 90 % d'efficacité de capture bactérienne ont été obtenues à une concentration ultra-faible (10 et 100  CFU/mL) en utilisant NP+. En revanche, l'efficacité de capture est inférieure à 4% avec NP− dans les mêmes conditions et présente une différence significative (P < 0,001). Ces résultats suggèrent que NP+ a une forte affinité pour les bactéries, ce qui pourrait s'expliquer par les attractions électrostatiques. Pour étudier les propriétés de capture bactérienne à large spectre, nous avons utilisé trois bactéries gram-positives (Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus , et Lactococcus lactis ) comme modèles. Comme illustré dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S2, les NP+ ont une capacité d'adsorption plus élevée pour les bacilles (E. coli et B. subtilis ) que les staphylocoques (S. aureus ) et les streptocoques (L. lactis ). De plus, nous avons également constaté que des molécules chargées négativement, telles que le 3-bromopyruvate (3-BP) et l'ADN, pouvaient interférer avec l'effet de capture bactérienne. Les morts E.coli n'est pas valide pour un tel système (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3).

Capturez l'efficacité de E. coli par NP+ ou NP− à des concentrations ultra-faibles. L'image de gauche est la photographie de plaques de gélose LB recouvertes de E. coli capturé par NP+ et NP−. L'image de droite montrait le E. coli efficacité de capture des NP (40 μg/mL) avec des concentrations ultrafaibles de bactéries. E. coli (10 et 100 CFU dans 1 mL de solution PBS) sans incubation NP a été compté comme 100 % et a servi de contrôle. ***P < 0.001

Discussion

Il est connu que les deux bactéries gram-négatives (telles que E.coli ) et des bactéries gram-positives (telles que B. subtilis ) interagissent beaucoup plus facilement avec des particules chargées positivement qu'avec des particules chargées négativement via des attractions électrostatiques [13, 14]. Cela a également été trouvé dans notre étude. Un avantage de notre système de capture est que les nanoparticules fonctionnalisées par PEI ont plus de groupes amine, qui ont pu capturer des bactéries à des concentrations ultra-faibles. À ce jour, il existe quelques tests généraux et satisfaisants qui pourraient détecter des bactéries à des concentrations inférieures à 10 ² CFU/mL sans pré-enrichissement des bactéries via un processus de culture. Cette étude a montré un test simple qui utilise des nanoparticules magnétiques électriques pour capturer et détecter les bactéries gram-négatives (les organismes ont une membrane cytoplasmique, une paroi cellulaire et une membrane externe intacte) en 1 h à une concentration de 10 CFU/mL.

Dans notre expérience, nous avons constaté que la charge de surface des NPs peut influencer l'efficacité de capture bactérienne. Ici, les effets de la charge à la surface des NP sur les efficacités de capture bactérienne ont été étudiés en utilisant E.coli comme bactérie modèle. Lorsque NP+ ont été utilisés dans le test de capture, ils ont présenté une capacité d'adsorption efficace des bactéries. Les efficacités de capture bactérienne ont augmenté avec le dosage de NP+. La microscopie MET montre des agrégats macroscopiques composés de nanoparticules et de cellules bactériennes. En revanche, le NP−, même à des concentrations élevées, présentait de faibles capacités de capture bactérienne. Dans l'ensemble, ces observations ont démontré que les NP+ ont une capacité de capture significativement plus élevée que les NP−.

Bien que les bactéries gram-positives et gram-négatives aient des différences dans leur structure membranaire, la plupart d'entre elles ont une charge négative lorsqu'elles sont cultivées à des valeurs de pH physiologiques [15, 16]. La charge de surface cellulaire des cellules bactériennes a été caractérisée par chromatographie d'interaction électrostatique (ESIC) [17]. La paroi cellulaire des bactéries gram-positives est principalement composée d'une épaisse couche de peptidoglycane, qui contient de l'acide téichoïque. D'autre part, les bactéries gram-négatives ont une couche de lipopolysaccharide à la surface externe suivie d'une fine couche de peptidoglycane. L'acide teichoïque et les lipopolysaccharides confèrent une charge négative à la surface des cellules bactériennes [18]. Auparavant, les nanoparticules d'argent chargées positivement (AgNPs) présentaient une efficacité remarquable contre les micro-organismes, y compris E. coli [19]. Ils ont découvert que les plus petites particules ont une plus grande activité antibactérienne. Nous avons considéré que les particules plus grosses peuvent avoir un avantage différent de l'absorbabilité bactérienne. Premièrement, les particules plus grosses atteignent difficilement le contenu nucléaire des cellules pour provoquer la toxicité pour les bactéries. Deuxièmement, ils peuvent fournir une plus grande surface et donc une interaction bactérienne plus forte. Par conséquent, nous avons conçu et appliqué des nanoparticules plus grosses chargées positivement en tant qu'agent « éponge » pour capturer les bactéries.

Conclusions

En conclusion, par nanoparticules magnétiques PEI, nous avons démontré un test simple et rapide pour permettre à E. coli à saisir et à analyser. Les archives existantes des profils optiques et MET des bactéries permettent une identification facile des bactéries capturées. La récupération élevée fournie par les nanoparticules magnétiques chargées positivement permettra la détection d'autres souches bactériennes à des concentrations ultra-faibles.

Abréviations

APTES :

3-aminopropyl triéthoxysilane

CFU :

Unité formant colonie

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

E. coli :

Escherichia coli

NP :

Nanoparticules magnétiques chargées négativement

NP+ :

Nanoparticules magnétiques chargées positivement

NP :

Nanoparticules

AAP :

Acide polyacrylique

Île-du-Prince-Édouard :

Polyéthylèneimine

SD :

Écart type

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TEOS :

Orthosilicate de tétraéthyle

TRITC :

Tétraméthylrhodamine