Effet amélioré de la combinaison d'acide chlorogénique sur des nanoparticules de sélénium pour inhiber l'agrégation amyloïde β et la formation d'espèces réactives à l'oxygène in vitro

Contexte

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative évolutive irréversible caractérisée par des troubles cognitifs progressifs et une perte neuronale [1]. Il est maintenant largement admis que l'accumulation de plaques amyloïdes extracellulaires dans le cerveau est une caractéristique pathologique courante dans la MA [2, 3]. Les plaques contiennent le mauvais repliement et l'agrégation de la protéine amyloïde-β (Aβ) [4]. Bien que le rôle exact des protofibrilles ou oligomères Aβ dans la pathogenèse de la MA ne soit pas entièrement compris, de plus en plus de preuves suggèrent que la plupart d'entre elles sont des espèces toxiques responsables du dysfonctionnement et de la mort des neurones [5,6,7,8]. De plus, les agrégats Aβ existent déjà dans le cerveau d'un patient atteint de MA. Ces agrégats continueront à former des espèces réactives de l'oxygène (ROS) neurotoxines, qui déclencheront une série de dommages aux composants cellulaires tels que l'ADN, les lipides et les protéines et provoqueront le stress oxydatif dans la MA [9]. Les dommages au neurone entraînent généralement des déficits d'apprentissage et de mémoire. Par conséquent, il est envisagé que l'inhibition de l'agrégation de l'amyloïde et de la formation d'espèces réactives de l'oxygène pourrait être des cibles thérapeutiques prometteuses pour prévenir ou atténuer la pathologie de la MA.

Les nanomatériaux ont des propriétés physico-chimiques uniques telles qu'une petite taille, une grande surface et une réactivité élevée. Récemment, la recherche a souligné qu'avec des modifications de surface appropriées, les nanoparticules (NP) peuvent être utilisées comme outils pour l'administration de médicaments, l'imagerie et les applications thérapeutiques dans la MA [10,11,12]. Généralement, les NPs ont une grande surface qui apporte de grandes capacités d'adsorption. Plus précisément, Aβ peut se lier à certaines NP pour retarder les processus de fibrillation de Aβ. Par exemple, la liaison d'un monomère Aβ sur des polyoxométalates abaisserait la concentration de monomères libres et déplacerait l'équilibre loin de la fibrillation [13]. Parmi ces nanomatériaux, les nanoparticules de sélénium (SeNP) présentent plusieurs caractéristiques qui les rendent bien adaptées aux applications biomédicales, telles que la préparation simple et la stabilité. Le sélénium est un oligo-élément essentiel, qui joue un rôle important dans la régulation redox cellulaire, la détoxification et la protection du système immunitaire [14]. Par conséquent, par rapport aux composés de sélénium inorganiques et organiques, les SeNP ont une meilleure biocompatibilité et une toxicité plus faible [15]. De nos jours, les modifications de surface des NPs facilitent l'affinité de liaison entre les NPs et Aβ et aident à remédier aux propriétés biochimiques des molécules conjuguées. Notre étude précédente a montré que la capacité anti-amyloïde des SeNPs pouvait être encore améliorée en greffant un peptide anti-amyloïde (LPFFD) sur une surface SeNP [12]. Cependant, la plupart de ces recherches ne se sont pas concentrées sur la capacité anti-oxydante des NP après des modifications de surface.

L'acide chlorogénique (CGA) est le principal composant polyphénolique des fruits comme les pommes, les poires et les baies et est particulièrement abondant dans le café [16]. Le CGA possède un certain nombre de propriétés pharmacologiques, telles qu'anticancéreuses, anti-inflammatoires et antibactériennes [16]. En particulier, le CGA a des activités anti-oxydantes et neuroprotectrices, ce qui permet une application pour traiter la maladie d'Alzheimer [17, 18]. Cependant, l'effet du CGA sur l'agrégation de Aβ n'a jamais été rapporté. De plus, l'utilisation du CGA est limitée par sa faible biodisponibilité et sa faible stabilité, et seulement un tiers du CGA absorbé par le tractus gastro-intestinal atteint la circulation sanguine [19]. Un certain nombre d'études ont rapporté qu'en raison de la petite taille des NP, elles peuvent entrer dans la circulation sanguine directement par inhalation, ingestion et transport dans la circulation vers de nombreux organes. Par conséquent, afin de résoudre ce problème, nous avons exploré la liaison du CGA aux SeNPs (CGA@SeNPs) pour améliorer l'efficacité thérapeutique potentielle du CGA. Dans ce contexte, le but de cette étude était d'étudier l'efficacité thérapeutique potentielle des CGA@SeNPs dans l'agrégation anti-Aβ et l'anti-oxydation. À notre connaissance, il n'y a aucun rapport précédent sur l'utilisation de CGA@SeNPs pour le traitement de la MA.

Méthodes/Expérimental

Matériaux et lignées cellulaires

Aβ40 a été synthétisé chez GL Biochem Ltd. (Shanghai, Chine). Dioxyde de sélénium (Na₂ SeO₃ ), NaBH₄ , le bromure de bleu de thiazolyle et de tétrazolium (MTT), la thioflavine T et le diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA) provenaient de Sigma (St. Louis, MO, USA). CGA a été acheté auprès d'Aladdin (Shanghai, Chine). Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal (FBS) et le sérum de cheval ont été obtenus auprès de Gibco (Life Technologies AG, Suisse). Des cellules PC12 (phéochromocytome de rat, American Type Culture Collection) ont été cultivées dans un milieu DMEM supplémenté avec 5% de FBS et 10% de sérum de cheval à 37 °C dans un 5% CO₂ environnement humidifié à 37 °C.

Préparation des CGA@SeNPs

Tout d'abord, des solutions mères de 25 mM de CGA, 0,1 M de Na₂ SeO₃ , et 0,1 M NaBH₄ étaient préparés. Ensuite, 200 μL d'aliquote de Na₂ SeO₃ la solution a été mélangée avec des volumes variés de CGA, et les rapports de concentration des réactifs de Na₂ SeO₃ à CGA étaient 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 et 1:8. Après cela, 200 μL de 0,1 M NaBH₄ a été ajouté au mélange et agité pendant 30 min. La couleur de la solution a été changée en rouge. Excès de CGA et de Na₂ SeO₃ ont été éliminés par dialyse. Nous avons trouvé que le meilleur rapport de concentration de Na₂ SeO₃ à CGA était de 1:6.

Caractérisation de CGA@SeNPs

Les CGA@SeNPs tels que préparés ont été caractérisés par microscope électronique à transmission (TEM ; Hitachi, H-7650), spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR ; spectromètre IR Equinox 55) et spectroscopie UV-vis (spectrophotomètre Carry 5000). La distribution granulométrique a été déterminée par l'analyseur de particules Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited). La fluorescence des nanoparticules a été réalisée avec un spectrofluoromètre JASCO FP6500 (λ ex =350 nm).

H₂ O₂ Test de génération

Le radical hydroxyle, l'acide 2,29-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS ⁺ ), et les activités de piégeage des anions superoxydes de CGA et CGA@SeNPs ont été analysées par des kits commerciaux (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). Le pouvoir réducteur des échantillons a été mesuré comme suit :2 mL de CGA ou CGA@SeNPs ont été incubés avec 2 mL de tampon phosphate (0,2 mol/L, pH 6,6) et 2 mL de K₃ Fe(CN)₆ (1%, w /v ) à 50 °C pendant 20 min. Après cela, la réaction a été arrêtée en ajoutant 2,5 mL d'acide trichloracétique (10 %, w /v ) et centrifugé à 3000 tr/min pendant 10 min. Deux millilitres du surnageant ont été mélangés avec 2 mL d'eau distillée et 1 mL de FeCl₃ (0,1 %, w /v ) à température ambiante pendant 10 min. Enfin, l'absorbance a été mesurée à 700 nm. La vitamine c (Vc) a été utilisée comme contrôle positif dans le test d'activité anti-oxydante.

Le H₂ O₂ la génération dans Aβ40 a été analysée par DCFH-DA. Solution mère de DCFH-DA (1 mM) achetée au Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Chine). Quatre micromolaires de peroxydase de raifort (HRP) ont été préparées dans du tampon (20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7,4). Des solutions d'échantillon contenant 35 μM Aβ40 avec ou sans 20, 40 et 60 μg/mL de CGA@SeNPs/CGA ont été incubées à 37 °C pendant 3 jours. De l'ascorbate (10 μM) a été ajouté à chaque échantillon et encore incubé pendant 1 h. Les analyses des échantillons ont été effectuées en ajoutant du DCFH-DA (20 μL, 100 μM) et du HRP (2 μL, 0,04 μM) à la solution d'échantillon (10 μL). Les spectres de fluorescence avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 et 525 nm ont été mesurés par un spectrofluoromètre JASCO FP6500.

Mesures de fluorescence de la thioflavine T

La cinétique de fibrillation Aβ40 a été détectée en utilisant le colorant thioflavine T (ThT). En bref, 35 μM Aβ40 ont été incubés avec 20, 40 et 60 μg/mL de CGA@SeNPs/CGA à 37 °C de 0 à 5 jours. Chaque jour, 50 μL de solution ont été prélevés et ajoutés à 200 μL de solution de ThT (15 μM de ThT dans 50 mM de PBS, pH 7,4). Ensuite, l'excitation de ThT était de 440 nm et la longueur d'onde d'émission de 490 nm a été enregistrée.

TEM

Les morphologies de Aβ40 en présence ou en l'absence de CGA@SeNPs/CGA ont été observées par MET (Hitachi, H-7650). Les échantillons ont été préparés de la même manière que dans le test de fluorescence ThT. Après 3 jours d'incubation, 10 μL de solution d'échantillon ont été déposés sur les grilles en cuivre recouvertes de carbone pendant 10 min. Ensuite, chaque grille a été colorée à 1,5% (w /v ) acide phosphotungstique (pH 7,4) et laisser sécher.

La liaison des nanoparticules à Aβ40 a également été confirmée par MET. Dans un premier temps, 35 μM Aβ40 ont été incubés pendant 3 jours pour formater les fibres. Ensuite, 20 μg/mL de nanoparticules ont été ajoutés à la solution pré-incubée et incubés pendant 6 h supplémentaires. Après cela, cet échantillon a été examiné sur MET.

Mesures de diffusion de la lumière par résonance

La diffusion de la lumière par résonance (RSL) a été mesurée selon la méthode de Yu et al. [20] avec quelques modifications. Une certaine quantité de dispersion Aβ40 a été diluée à 1 mL avec H₂ O, tandis que la concentration finale de CGA@SeNPs variait de 0,05 à 0,45 μg/mL. Le mélange a été incubé pendant 10 min. Les intensités RLS ont été enregistrées sur le fluorospectrophotomètre Cary Eclipse (Agilent technologies, USA) en balayant de manière synchrone les monochromateurs d'excitation et d'émission (Δλ = 0 nm) entre 200 et 800 nm. Les largeurs de fente d'excitation et d'émission ont toutes deux été réglées sur 5 nm.

Test de cytotoxicité

La viabilité cellulaire a été analysée en utilisant le test MTT. Les cellules PC12 ont été étalées à une densité de 5000 cellules par puits sur des plaques à 96 puits dans du milieu frais sans FBS. Aβ (35 μM) a été co-incubé avec ou sans 60 μg/mL de CGA@SeNPs/CGA pendant 3 jours. Après cela, les cellules ont été traitées avec ces échantillons pendant encore 72 h. Après incubation, les cellules ont été traitées avec 10 μL de MTT par puits, en suivant le manuel du test de prolifération cellulaire Cell Titer 96 Aqueous One Solution (Promega). La libération de lactate déshydrogénase (LDH) a été dosée à l'aide du kit de détection commercial. Les cellules PC12 ont été traitées comme ci-dessus. A la fin des traitements, la plaque 96 puits a été centrifugée à 1500×g pendant 10 minutes. L'activité LDH dans les surnageants a été mesurée selon les instructions du fabricant.

Génération intracellulaire de ROS

Les effets de CGA@SeNPs/CGA sur la génération de ROS intracellulaires induite par Aβ40 ont été surveillés par dosage DCFH-DA. Les cellules PC12 (1 × 10 ⁵ par puits) ont été traités de la même manière que dans le test MTT. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et incubées avec du DCFH-DA (10 mM) à 37 °C pendant 30 min. Le niveau de ROS intracellulaire a été examiné au microscope à fluorescence (grossissement × 200) avec les longueurs d'onde d'excitation et d'émission à 488 nm et 525 nm, respectivement. Pour mesurer le taux de ROS intracellulaire, les cellules ont été traitées de la même manière et récoltées par centrifugation, remises en suspension dans du PBS. Ensuite, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux.

Test de co-coloration TUNEL-DAPI

Les cellules PC12 ont été traitées de la même manière que dans le test MTT. Après cela, les cellules des lames de chambre ont été fixées avec du formaldéhyde à 3,7 % et perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS. Le test de coloration a été réalisé en utilisant le kit de test de terminal transferase dUTP nick end labelling (TUNEL) (KeyGen BioTECH, Nanjing, Chine) en suivant le protocole du fabricant. Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope à fluorescence (grossissement × 200).

Statistiques

La signification statistique a été estimée à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test post hoc de Bonferroni. La signification statistique a été fixée à P < 0,05.

Résultats et discussion

Caractérisation de CGA@SeNPs

Dans cette étude, nous utilisons une méthode simple pour synthétiser CGA@SeNPs en réduisant un mélange de CGA et de Na₂ SeO₃ avec NaBH₄ . Les nanoparticules d'une taille allant de 30 à 150 nm étaient plus favorables à l'absorption cellulaire [21]. La MET a montré que les CGA@SeNPs ont une structure sphérique d'un diamètre d'environ 100 nm (Fig. 1a), suggérant que la taille des CGA@SeNPs était adaptée à l'application biologique. L'analyse de la composition élémentaire a montré que Se, C et O peuvent être facilement trouvés dans le graphique de spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (EDX) de CGA@SeNPs (Fig. 1b). Le signal des atomes Se était de 30,00 %, ainsi que le signal fort des atomes C (52,60 %) et O (1,50 %) de CGA, indiquant que nous avons préparé avec succès les CGA@SeNPs.

Caractérisation des CGA@SeNPs. un Images MET de CGA@SeNPs. b Analyse EDX de CGA@SeNPs. c Spectre d'absorption UV-vis de CGA@SeNPs. d Le spectre d'émission de CGA@SeNPs

Le spectre d'absorption UV-vis du CGA montre un pic d'absorption caractéristique à 334 nm (Fig. 1c). Cependant, un léger décalage a été observé dans le spectre d'absorption UV-vis de CGA@SeNPs et le pic d'absorption a été modifié à 337 nm. Les longueurs d'onde d'émission de CGA et CGA@SeNPs ont été détectées par spectrophotomètre à fluorescence. La longueur d'onde d'émission du CGA était de 442,9 nm, qui a été déplacée à 437,5 nm dans CGA@SeNPs (Fig. 1d). Ces résultats ont confirmé la présence de CGA à la surface des SeNPs. Le spectre FT-IR de CGA@SeNPs prouve que CGA a fait partie du nanocomposite. La fréquence d'étirement O–H est située à 3353,99 cm ⁻¹ dans le spectre FT-IR de CGA (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1) ; cependant, ce pic caractéristique dans CGA@SeNPs a été modifié en 3419,00 cm ⁻¹ . Le changement a confirmé que le CGA était conjugué à la surface des SeNP par le groupe -OH.

La stabilité des CGA@SeNPs dans des conditions physiologiques est importante pour évaluer leurs applications futures. Ainsi, la distribution de taille de CGA@SeNPs dans du PBS (pH 7,4) a été surveillée à température ambiante pendant 7 jours. Comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S2, la taille des CGA@SeNPs est restée stable avec une taille moyenne d'environ 100 nm, et les CGA@SeNPs ont conservé une bonne dispersibilité dans l'eau dans le PBS en 7 jours. La stabilité favorable des CGA@SeNPs soutient leur application potentielle dans le domaine médical.

Inhibition de la génération ROS

L'Aβ déposé peut activer la microglie et stimuler la microglie pour produire des neurotoxines, telles que les ROS, qui peuvent en outre provoquer de graves dommages neuronaux dans le cerveau [22]. De plus, les ROS tels que le peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ) peut également être généré par les agrégats Aβ [23]. Ainsi, nous avons étudié les activités antioxydantes de CGA@SeNPs et l'effet de CGA@SeNPs sur H₂ induit par l'agrégat Aβ O₂ formation. Comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S3, les CGA@SeNPs ont de fortes activités de piégeage contre les radicaux d'une manière dépendante de la concentration. Lorsque la concentration atteint 60 μg/mL, le radical hydroxyle, ABTS ⁺ , et les activités de piégeage des anions superoxydes ont atteint respectivement 70,3 %, 95,2 % et 95,1 %. De toute évidence, le pouvoir réducteur des CGA@SeNPs augmentait avec l'augmentation des concentrations. Parmi tous les échantillons, les CGA@SeNPs présentaient un fort pouvoir réducteur et des capacités de piégeage sur le radical hydroxyle, ABTS ⁺ , et l'anion superoxyde que Vc et CGA. Ces résultats suggèrent que les CGA@SeNPs ont montré une activité antioxydante plus élevée, ce qui peut aider à piéger l'oxygène actif dans la MA. Le point à noter est que la modification de CGA sur les SeNPs exerce un effet synergique sur l'activité antioxydante.

L'effet de CGA@SeNPs sur le H₂ médié par Aβ O₂ la génération a été étudiée par un test DCFH-DA [24], qui peut indiquer la génération de H₂ O₂ de l'Aβ en présence ou en l'absence de CGA@SeNPs. Comme le montre la figure 2, CGA@SeNPs et CGA ont diminué H₂ O₂ de manière dose-dépendante. Plus important encore, les échantillons Aβ contenant CGA@SeNPs montrent moins de H₂ O₂ que ceux contenant du CGA, révélant que l'activité antioxydante élevée du CGA@SeNPs a montré plus d'effet que le CGA dans la réduction du H₂ induit par Aβ O₂ génération.

H₂ O₂ génération à partir de réactions d'Aβ40 en présence ou en absence de nanoparticules. Aβ =35 μM, nanoparticules/CGA =20, 40 et 60 μg/mL

Inhibition de l'agrégation Aβ par CGA@SeNPs

Bien que l'activité antioxydante du CGA soit une propriété bien connue, l'activité d'agrégation anti-amyloïde du CGA est encore inconnue. Pour vérifier la faisabilité des CGA@SeNPs pour les applications thérapeutiques de la MA, l'effet d'inhibition des CGA@SeNPs sur l'agrégation Aβ a d'abord été étudié par dosage fluorométrique basé sur ThT, qui est une méthode bien établie pour surveiller la formation de feuillets en continu. temps [25]. Comme le montre la figure 3a, l'Aβ40 s'est agrégé spontanément et la fluorescence des fibrilles d'Aβ a augmenté progressivement jusqu'à ce qu'elle atteigne un plateau après 3 jours d'incubation. Nous avons observé que les CGA@SeNPs étaient capables d'agréger lentement les protéines amyloïdes avec l'augmentation de la concentration. L'intensité de fluorescence des fibres Aβ40 environ deux fois supérieure à celle de l'Aβ40 incubée avec 60 μg/mL de CGA@SeNPs a été obtenue. Cependant, peu ou pas de changement dans l'intensité de la fluorescence ThT a été observé dans le CGA, suggérant que le CGA n'a que légèrement inhibé l'agrégation Aβ40.

Effet inhibiteur de CGA@SeNPs sur la fibrillation Aβ40. un Fluorescence ThT de la formation de fibrilles Aβ40 en présence ou non de nanoparticules/CGA de 0 à 5 jours. Aβ40 =35 μM, nanoparticules/CGA =20, 40 et 60 μg/mL. b Morphologie d'Aβ40 incubé avec ou sans nanoparticules ou CGA pendant 3 jours. Aβ40 =35 μM, nanoparticules/CGA =60 μg/mL

Les changements morphologiques de l'Aβ40 incubé avec ou sans CGA ou CGA@SeNPs sont illustrés à la Fig. 3b. Aβ40 incubé en 3 jours a formé des fibrilles abondantes, alors qu'en présence de CGA@SeNPs (60 μg/mL), aucune fibrille n'a été formée. Comme prévu, le CGA n'a pas inhibé de manière significative la fibrillogenèse de l'Aβ, alors que de grandes quantités d'agrégats ont été observées dans la solution d'Aβ40 traité au CGA, ce qui était cohérent avec le dosage fluorométrique ThT. Ces résultats ont indiqué qu'après modification du CGA sur les SeNPs, cela pourrait évidemment diminuer la formation de feuillets β.

Activité de liaison de CGA@SeNPs à Aβ40

Pour mieux comprendre l'activité inhibitrice de CGA@SeNPs sur l'agrégation Aβ, nous avons étudié l'affinité de liaison de CGA@SeNPs pour Aβ40. Premièrement, pour évaluer la liaison des nanoparticules sur les fibres Aβ40 au niveau ultrastructural, les fibres Aβ40 ont été incubées avec CGA@SeNPs. Nous avons observé que les fibrilles se liaient spécifiquement à la surface des SeNPs sans la présence de nanoparticules libres en suspension non associées (Fig. 4a).

Affinité de CGA@SeNPs pour Aβ40. un La capacité de liaison des CGA@SeNPs sur les fibres Aβ40. Les fibres de Aβ40 réalisées ont été incubées avec CGA@SeNPs et examinées en MET. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs =60 μg/mL. b Affinité et spécification de CGA@SeNPs pour le monomère Aβ40. Les spectres RLS du monomère Aβ40 en présence de différentes concentrations de CGA@SeNPs. Aβ40 =600 nM, concentration de nanoparticules, 1–9 :0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35 et 0,4 μg/mL. c Les spectres RLS de CGA@SeNPs, concentration de nanoparticules, 1-9 :0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 et 0,45 μg/mL

La diffusion de la lumière par résonance (RLS) est une technique optique puissante basée sur la diffusion élastique de la lumière et a été largement appliquée pour étudier la taille, la forme et la distribution des nanoparticules en solution [26]. Ainsi, nous avons ensuite utilisé RLS pour analyser l'interaction entre le monomère Aβ40 et CGA@SeNPs. Comme le montre la Fig. 4b, c, l'intensité RLS des NP est bien inférieure à celle des NP incubées avec 600 nM de monomère Aβ40 à la même concentration. Une fois que les CGA@SeNPs ont été exposés aux molécules Aβ, on pense que Aβ se lie à la surface des SeNPs via des donneurs N contenant des chaînes latérales d'acides aminés pour former une liaison Se-N [27]. La formation de conjugués de molécules Aβ sur les CGA@SeNPs entraîne une augmentation de la taille des diffusions, ce qui augmente l'intensité RLS du système (Fig. 4b). Combiné avec le résultat du test ThT et TEM, il est supposé que les interactions entre la grande surface CGA@SeNP et le monomère Aβ40 pourraient entraîner des conditions défavorables pour la nucléation et la croissance des fibrilles par le blocage du contact direct entre les monomères. Ainsi, les CGA@SeNPs exercent plus d'effet que les CGA pour inhiber l'agrégation Aβ40.

Inhibition de la neurotoxicité Aβ40

La cytotoxicité de Aβ40 en présence ou en l'absence de CGA@SeNPs dans les cellules PC12 a été étudiée par dosage MTT. La figure 5a montre que les fibres Aβ40 étaient toxiques pour les cellules PC12, ce qui a réduit la viabilité des cellules à 53 %. En présence de CGA@SeNPs, la survie des cellules a augmenté jusqu'à environ 95 %. Cependant, le prétraitement des cellules avec du CGA n'a que légèrement augmenté la survie des cellules à 66%. De plus, les CGA@SeNPs n'étaient pas toxiques pour les cellules PC12 (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4), ce qui suggère que les CGA@SeNPs pourraient inhiber la neurotoxicité de l'Aβ40.

La neurotoxicité de Aβ40 incubé avec ou sans CGA@SeNPs/CGA. un La viabilité cellulaire des cellules PC12 vers Aβ40 en présence de CGA@SeNPs ou CGA testée par dosage MTT. b La libération de LDH dans le milieu de culture. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs/CGA =60 μg/mL

Il a été rapporté que Aβ s'immobilisait préférentiellement sur la surface cellulaire et provoquait des dommages à la membrane cellulaire [28]. Par conséquent, pour déterminer l'intégrité de la membrane cellulaire après exposition à Aβ40 en présence ou en l'absence de NPs/CGA, nous avons mesuré les niveaux de LDH extracellulaire dans le milieu de culture cellulaire. Dans cet essai, le niveau élevé de LDH reflète les dommages de la membrane cellulaire. Comme le montre la figure 5b, par rapport au témoin, après exposition à Aβ40, la libération de LDH a augmenté à 142%. Conformément au résultat du MTT, en présence de CGA@SeNPs, la libération de LDH a été réduite à un niveau normal. Fait intéressant, nous avons observé que le CGA ne réduisait pas la concentration de LDH, ce qui suggère que le CGA ne peut pas empêcher les cellules PC12 des dommages à la membrane cellulaire induits par les agrégats Aβ.

Prévention de la génération de ROS induite par Aβ40 dans les cellules PC12

Les agrégats Aβ sont capables de produire des ROS qui pourraient provoquer un stress oxydatif dans la MA [29]. En raison des propriétés anti-oxydation et anti-agrégation de CGA@SeNPs, nous avons émis l'hypothèse qu'il serait capable de réduire la génération de ROS induite par Aβ40 dans la cellule PC12. Ainsi, l'effet des NP sur la génération de ROS induite par l'agrégat Aβ40 a été mesuré par DCFH-DA. DCF est un marqueur fluorescent dérivé de la réaction de DCFH-DA non fluorescent avec ROS, qui peut indiquer la génération de ROS induite par les agrégats Aβ40. Comme le montre le fichier supplémentaire 1 : figure S5, le traitement avec des agrégats Aβ40 a entraîné une augmentation de plus de 1,5 fois de la teneur en ROS par rapport aux cellules non traitées. Le traitement CGA@SeNP a diminué l'intensité de fluorescence DCF dans les cellules PC12, indiquant que les CGA@SeNPs ont réduit le ROS induit par les fibrilles Aβ à un niveau normal. Fait intéressant, CGA a également réduit la génération de ROS dans les cellules PC12, mais pas aussi clairement que CGA@SeNPs.

Prévention de l'apoptose cellulaire induite par Aβ40 dans les cellules PC12

Il a été rapporté que la mort des cellules neuronales causée par la fibrille Aβ est un événement critique dans la pathologie de la MA [30]. Pour approfondir l'étude de la cytotoxicité des fibrilles Aβ40, nous avons effectué une co-coloration TUNEL-DAPI pour déterminer l'effet des NP ou du CGA dans l'apoptose cellulaire induite par Aβ40. La fragmentation de l'ADN est une caractéristique de l'apoptose cellulaire, qui pourrait être détectée aux premiers stades de l'apoptose en utilisant TUNEL [31]. Comme le montre la figure 6, les noyaux apoptotiques ont été colorés en vert fluorescent brillant par TUNEL. Aβ40 a considérablement augmenté le nombre de noyaux colorés en TUNEL, tandis que le traitement CGA@SeNP a entraîné une diminution des noyaux TUNEL-positifs, démontrant que CGA@SeNPs pouvait protéger les neurones de l'apoptose des cellules PC12 induite par Aβ40. Sinon, des niveaux élevés de ROS dans les cellules participent également à l'apoptose [32]. Ainsi, ces résultats suggèrent que l'apoptose provoquée par Aβ40 pourrait être attribuée à la génération de ROS. Il convient de noter que le CGA peut également réduire l'apoptose cellulaire induite par Aβ40. D'après les tests MTT et LDH, le CGA n'a pas amélioré la survie de la cellule et n'a pas diminué les dommages à la membrane cellulaire induits par l'agrégat Aβ. Les résultats combinés des tests TEM et ThT, nous avons constaté que le CGA a une propriété anti-oxydation qui peut éliminer l'oxygène actif dans le processus d'agrégation Aβ, mais il ne peut pas entièrement inhiber l'agrégation Aβ. Par conséquent, le CGA pourrait diminuer la génération de ROS dans la solution d'incubation et les cellules PC12, protégeant l'apoptose cellulaire induite par les ROS, mais il ne peut pas diminuer les dommages à la membrane cellulaire induits par l'agrégat Aβ. Les dommages à la membrane cellulaire entraîneront une fuite de contenu intracellulaire dans les tissus environnants, ce qui pourrait entraîner des dommages tissulaires et une inflammation [33]. Ainsi, la combinaison de l'agrégation d'Aβ inhibée et de la formation d'espèces réactives de l'oxygène pourrait être considérée comme une nouvelle méthode thérapeutique.

Les CGA@SeNPs empêchent l'apoptose cellulaire induite par Aβ40 dans les cellules PC12. L'apoptose cellulaire a été détectée par le test de co-coloration TUNEL-DAPI. Le noyau cellulaire normal était coloré en bleu et le fragment d'ADN était coloré en vert. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs/CGA =60 μg/mL

Conclusions

En résumé, le CGA a une propriété pharmacologique anti-oxydante, mais il n'a aucun effet sur l'inhibition de la fibrillation Aβ. La modification de surface du CGA sur les SeNPs lui confère une nouvelle propriété anti-agrégation. Aβ40 pourrait se lier à la surface des CGA@SeNPs, ce qui entraîne des conditions défavorables pour la nucléation et la croissance des fibrilles en bloquant le contact direct entre les monomères. Dans ce cas, CGA@SeNPs a inhibé l'agrégation Aβ40, effacé les ROS et protégé les cellules PC12 de la rupture de la membrane cellulaire et de l'apoptose induite par les ROS induite par les agrégats Aβ40. Cependant, dans le groupe CGA, les agrégats Aβ se sont immobilisés à la surface cellulaire et ont causé des dommages à la membrane cellulaire, ce qui entraîne également la mort cellulaire. Dans l'ensemble, les CGA@SeNPs sont plus efficaces que les CGA pour réduire l'Aβ40 toxique lors d'une utilisation à long terme.

Abréviations

ABTS ⁺ :

2, 29-Azinobis-(acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)

AD :

Maladie d'Alzheimer

Aβ :

Amyloïde-β

CGA :

Acide chlorogénique

DCFH-DA :

Diacétate de 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescéine

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

EDX :

Spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie

FBS :

Sérum fœtal bovin

FT-IR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

HRP :

Peroxydase de raifort

LDH :

Lactate déshydrogénase

MTT :

Bromure de bleu de thiazolyle et de tétrazolium

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

RSL :

Mesures de diffusion de la lumière de résonance

SeNP :

Nanoparticules de sélénium

TEM :

Microscope électronique à transmission

ThT :

Thioflavine T

TUNEL :

Etiquetage du terminal transférase dUTP nick end

Vc :

Vitamine c