Synthèse à médiation par des semences de nanotiges en or à rapport d'aspect réglable pour l'imagerie photoacoustique dans le proche infrarouge

Contexte

Les nanostructures unidimensionnelles (1D), telles que les nanofils, les nanotiges, les nanotubes et les nanoceintures, sont particulièrement intéressantes car elles ne sont pas seulement de nouveaux éléments de base pour les nanodispositifs, mais possèdent également un rapport d'aspect géométrique élevé produisant des caractéristiques anisotropes pour des applications spéciales [1, 2,3,4,5,6]. Parmi ces nanostructures 1D, les nouvelles nanotiges métalliques (NR) ont suscité un intérêt croissant en raison de leur bande de résonance plasmonique de surface (SPR) dépendante de la forme [7, 8], de leur synthèse facile [9, 10, 11], de leur biocompatibilité favorable et modification [12,13,14]. Par exemple, Yeh et al. ont rapporté une structure en coquille de nanotige d'Au (AuNR) inférieure à 100 nm, qui présente une forte absorbance longitudinale à 600-900 nm et une bonne applicabilité pour les thérapies photo-induites [8]. Wang et al. construit avec succès des superstructures hélicoïdales AuNR anisotropes avec une chiralité sur mesure, en positionnant l'AuNR fonctionnalisé avec de l'ADN sur l'origami du motif « X » conçu de l'arrangement des brins de capture d'ADN [12].

De plus, des améliorations dans la synthèse et la purification des AuNRs ont permis un réglage facile de la bande SPR longitudinale, en ajustant la longueur et donc le rapport d'aspect [15,16,17], pour des applications spécifiques, comme l'imagerie photoacoustique (PAI) et photo-induite thérapies [18,19,20,21,22,23], qui nécessitent que le SPR longitudinal des NR Au tombe dans la fenêtre optique transparente du tissu biologique (le premier à 700-950 nm et le second à 1000-1350 nm) [8 , 18]. Par exemple, Huang et ses collègues ont synthétisé des NR d'or avec un rapport d'aspect de 2,4 à 5,6, qui ont affiché un diagnostic efficace des cellules cancéreuses et une thérapie photothermique sélective [19]. Jokerst et al. ont développé des NR d'or et des NR d'or recouverts de silice avec un rapport d'aspect d'environ 3,5, qui ont montré un signal PAI élevé pour la détection du cancer de l'ovaire et l'imagerie des cellules souches mésenchymateuses [20, 21]. Yang et ses collègues ont rapporté une nanotige d'or magnétique/PNIPAAmMA pour la PAI à double résonance magnétique et la thérapie photothermique ciblée [23]. Bien que de nombreux agents de contraste à base d'Au NR aient été développés, une synthèse facile et évolutive d'AuNR à rapport d'aspect large et accordable et leurs performances PAI dépendantes du comportement d'absorption restent des défis.

Ici, les AuNR avec un rapport d'aspect de 8,5 à 15,6 ont été synthétisés en utilisant la méthode de croissance à médiation par les semences modifiée avec l'aide d'acide ascorbique. Il a été démontré que les AuNR possèdent une biocompatibilité élevée et ont encore réduit leur cytotoxicité avec la modification SH-PEG. Bénéficiant de leur absorbance importante et réglable dans la région NIR, les AuNR synthétisés pourraient offrir un contraste plus fort et des valeurs de rapport signal-bruit (SNR) plus élevées dans les expériences PAI, à la fois in vitro et in vivo. Cette méthode facile pour construire des NR d'or à rapport d'aspect accordable peut être utilisée pour fabriquer un agent de contraste sous n'importe quelle longueur d'onde dans la première fenêtre NIR.

Expérimental

Synthèse de nanotiges d'or

Les AuNR à rapport d'aspect accordable ont été synthétisés par une méthode de synthèse modifiée à médiation par les semences [16, 17]. Dans une procédure typique, un volume de 10,3 mL de 0,025 M HAuCl₄ (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., 99,9%) et 3,644 g de tensioactif au bromure de cétyl triméthylammonium (CTAB) (Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, 99,0%) ont d'abord été ajoutés à un bécher. Ensuite, de l'eau déminéralisée (18 MΩ) a été ajoutée pour amener la concentration en HAuCl₄ être 2,5 × 10 ⁻³ M et CTAB de 0,1 M. 10 mL, 4,5 mL, 4,5 mL et 45 mL de la solution susmentionnée ont été transférés séparément dans quatre flacons étiquetés A, B, C et D. Ensuite, un volume de 350 μL , 0,01 M de NaBH glacé₄ (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., 98,0 %) a été ajouté dans le flacon A et agité pendant 3 minutes. 0,4 mL de solution de flacon A et 25 μL d'acide 0,1 M L(+)-ascorbique (AA) (Tianjin Shentai Chemical Industry Co., Ltd., ≥ 99,7%) a été transféré dans le flacon B, agité pendant 3 min supplémentaires. Ensuite, 0,4 mL de solution de flacon B et 25 μL d'AA 0,1 M ont été ajoutés dans le flacon C, agités à nouveau pendant 3 min. Enfin, 4 mL de solution de flacon C et 250 μL d'AA 0,1 M ont été ajoutés dans le flacon D, agités pendant 5 s, puis laissés au repos dans un bain-marie à 28 °C pendant 12 h. La solution supérieure a été retirée avec précaution et le précipité a été centrifugé et lavé plusieurs fois avec de l'eau distillée pour s'assurer que l'excès de CTAB a été complètement éliminé. Ainsi, les produits finaux ont été signés comme des nanotiges Au typiques (AuTR).

Répétez le processus ci-dessus et modifiez simplement le dosage d'AA, puis des NR Au avec un rapport d'aspect de 8,5 à 15,6 pourraient être développés. Les détails sont les suivants :les dosages d'AA sont (35 μL, 35 μL, 350 μL) pour Au rod1, (30 μL, 30 μL, 300 μL) pour Au rod2, (20 μL, 20 μL, 200 μL) pour Au rod3 et (15 μL, 15 μL, 150 μL) pour Au rod4.

Modification de surface des AuNR

Tout d'abord, 10 mg de SH-PEG (Nanjing Pengsheng Biological Technology Co. Ltd) ont été dissous dans 1 mL d'eau déminéralisée et soniqués pendant 10 min. Ensuite, la solution a été traitée avec 50 mL 0,1 M de NaBH₄ solution sous sonication pendant encore 15 min pour réduire le SH-PEG dimérisé possible (PEG-S-S-PEG). Deuxièmement, les Au NR nettoyés ont été dispersés dans 10 mL d'eau déminéralisée et mélangés à la solution SH-PEG ci-dessus (10 ml), agités pendant 5 min, puis placés sans être dérangés pendant 5 h. Enfin, l'échantillon a été centrifugé et lavé avec de l'eau déminéralisée pour une application ultérieure.

Méthodes de caractérisation

La morphologie et la structure des AuNR synthétisés ont été identifiées par microscopie électronique à balayage (SEM ; JEOL JSM-7001F) et microscopie électronique à transmission (TEM ; JEOL 2100F, 200 kV). Les absorbances UV-vis des différents AuNR ont été mesurées par spectrophotomètre (Shimadzu, 3100 UV-vis-NIR). Les signaux photoacoustiques ont été enregistrés par le système de détection photoacoustique à balayage par rotation de l'unité, qui contient un dispositif laser (Surelite I-20, Continuum), un oscillateur paramétrique optique (OPO) (Surelite OPO Plus), un transducteur à ultrasons non focalisé (PMUT) (V310- SU, Olympus, 5 Hz), table tournante à pas de moteur et son boîtier de commande de moteur (MC) (M600, Beijing Zolix Instrument Co., Ltd.), préamplificateur (5077PR, Olympus), carte d'acquisition de données (DAQ) PCI4732, etc. activé.

Expériences de viabilité cellulaire

Toutes les procédures bio-expérimentales ont été approuvées par le comité IACUC de l'Université de technologie de Taiyuan. Et les expériences ont été menées conformément aux directives approuvées.

Les cellules Hela ont été cultivées dans le milieu cellulaire standard recommandé par l'American Type Culture Collection (ATCC), à 37 °C sous 5% de CO₂ atmosphère. Les cellules ensemencées dans des plaques à 96 puits ont été incubées avec différentes concentrations d'AuNR et d'AuNR-PEG pendant 24 h. Les viabilités relatives des cellules ont été déterminées par le dosage standard du méthyl thiazolyl tétrazolium (MTT) et imagées au microscope optique.

In Vitro et In Vivo PAI

Deux grammes de poudre d'agar (Gene Company Ltd.) ont été dissous dans 100 ml d'eau déminéralisée et bien mélangés à l'aide d'une barre de verre dans un bécher. Le liquide trouble a été chauffé jusqu'à ébullition dans un four à micro-ondes (Midea Group Limited par Share Ltd.). Ensuite, le liquide a été retiré et agité au bain-marie pendant 20 min à 60 °C, jusqu'à ce que le liquide devienne épais. Ensuite, les matériaux visqueux ont été versés dans un moule cylindrique de 4,5 cm de diamètre, refroidis et solidifiés. Enfin, la gélose coagulée a été utilisée comme fantôme de tissu biologique, en raison de son absorbance approximative par rapport aux lasers NIR.

Un capillaire en verre de 0,9 mm de diamètre a été implanté à la surface du fantôme pour simuler un vaisseau sanguin, qui serait rempli avec du sang de bœuf frais ou du sang mélangé à diverses concentrations d'AuNR-PEG dans une expérience spécifique. Le fantôme a été placé sous l'eau et irradié par un laser à 680 nm ou 800 nm, à une densité de puissance de 11 mJ/cm ² .

Narcotiser la souris par l'isoflurane de manière transitoire, puis 0,04 mL/10 g à 10 % en poids d'hydrate de chloral a été injecté par voie intrapéritonéale pour anesthésier la souris à fond. La tête de la souris a été délicatement rasée des poils et légèrement enduite d'un agent de couplage à ultrasons (Boline Healthcare Ltd.). La longueur d'onde du laser a été ajustée à 800 nm et la souris a été placée sous l'eau. Ensuite, les vaisseaux sanguins cérébraux de la souris ont été imagés, avant et après, et les agents de contraste (1 nM, 0,1 mL/10 g) ont été injectés par voie intraveineuse (I.V) à la souris. Le laser a été changé à 680 nm et répétez l'expérience ci-dessus. Remarque :Lorsque l'agent de contraste a été changé, l'injection I.V doit prendre au moins 24 h plus tard pour laisser le résidu complètement métabolisé.

Résultats et discussions

La morphologie et la structure typiques d'AuTR ont été discutées de manière systémique par MET (Fig. 1). Comme le montre la figure 1a, les AuTR synthétisés (le dosage d'AA était de 25 μL) sont de forme homogène, avec un diamètre de 22 ± 1,5 nm, une longueur de 290 ± 13 nm et un rapport d'aspect d'environ 13,2. La figure 1b montre une image MET à fort grossissement de certains AuTR représentatifs. Une image MET haute résolution (HRTEM) de la région d'extrémité d'une seule nanotige (zone rectangulaire "1" sur la figure 1b) est illustrée sur la figure 1c. Le résultat montre que des franges de réseau perpendiculaires au grand axe de la nanotige peuvent être discernées avec des espacements d de 1,44 Å, correspondant au plan de réseau (110). La nanotige croît le long de la direction [110], telle que déterminée par la structure cubique de l'Au, à partir de l'analyse du motif de diffraction électronique à zone sélectionnée (SAED) et de l'image HRTEM [16, 17]. Les spectres d'absorption UV-vis d'AuTR sur la figure 1d montrent deux pics d'absorption, le pic caractéristique à environ 520 nm et le pic longitudinal à environ 900 nm. Lorsqu'elle est fonctionnalisée avec du HS-PEG (la ligne rouge), la bande d'absorption montre une légère baisse (environ 5 %) sur la force maximale, mais aucun changement évident sur la position maximale.

Morphologie et structure typiques de la nanotige d'Au synthétisée à 25 μL 0,1 M AA (AuTR) :a Image TEM à fond clair. b Image MET d'amplification, d'un seul bâtonnet. c Image HRTEM d'une seule tige dans la zone rectangulaire « 1 » du panneau b . d Spectres d'absorption UV-vis de AuTR et AuTR-PEG

Il est bien connu que le contrôle cinétique de la concentration en monomère et de la vitesse de croissance cristalline sont les facteurs clés pour manipuler la taille des particules ainsi que la forme du matériau initiée à partir de la croissance anisotrope [24, 25]. Ainsi, dans ce travail, des expériences dépendantes de la concentration ont été réalisées pour explorer l'influence de l'AA sur la croissance anisotrope des Au NR. Lorsque l'utilisation de l'AA est de 35 μL (0,1 M), le rapport hauteur/largeur des AuNR synthétisés est d'environ 8,5  ± 0,6 (Fig. 2a, environ 50 AuNR individuels ont été sélectionnés au hasard pour les statistiques mathématiques du rapport hauteur/largeur). En réduisant le dosage d'AA de 35 à 15 μL, le rapport hauteur/largeur des AuNR augmente de 8,5 à 15,6 (Fig. 2a–d). Généralement, l'AA est souvent utilisé comme agent réducteur pour réduire le jaune clair Au ³⁺ à Au ⁺ et n'a pas pu induire la formation de Au ⁰ nanoparticules [26, 27]. Cependant, dans notre expérience, le rapport d'aspect des AuNRs synthétisés varie avec la concentration d'AA. On soupçonne que l'AA n'agit pas seulement comme agent réducteur, mais joue également le rôle d'agent de coiffage pour aider à réguler la croissance anisotrope des AuNR dans notre expérience [28,29,30]. Avec la réduction de la concentration en AA dans le système de réaction, Au ⁺ les ions sont liés pour accélérer leur libération et induire la croissance rapide le long de l'axe longitudinal de la nanotige d'Au (Fig. 2e). La figure 2f montre les spectres d'absorption UV-vis de tous les échantillons. Avec l'augmentation du rapport d'aspect de 8,5 à 15,6, la forte bande d'absorption longitudinale SPR des AuNRs passe au rouge de ~ 680 à 1100 nm, couvrant une large gamme NIR (Fig. 2f), indiquant leur grand potentiel pour les applications biomédicales [31, 32 ].

Statistiques de morphologie et de rapport d'aspect des AuNR avec différents dosages d'AA :a–d SEM et histogramme, a Tige1, b Tige2, c Rod3 et d Rod4. e Le graphique linéaire du dosage AA correspondant au rapport hauteur/largeur. f Les spectres d'absorption UV-vis de différents AuNRs

Les propriétés photoacoustiques in vitro des AuNRs ont été présentées dans la Fig. 3. Les amplitudes photoacoustiques (PA) des AuNRs fonctionnalisés avec du HS-PEG ont été déterminées à une série de concentrations des composants optiques de 0,25 à 1,0 nM (Fig. 3a), qui a montré de bonnes relations linéaires. AuTR fournit une amélioration importante du signal PA irradié par un laser à 800 nm et Au rod1 à 680 nm. Lorsque la longueur d'onde du laser était mal ajustée (par exemple, AuTR à 680 nm et Au rod1 à 800 nm), l'intensité du signal PA était fortement affaiblie. La figure 3b montre les images PA de capillaires en verre remplis de sang de bœuf frais, ou d'un bilan sanguin mélangé avec 1 nM AuTR et Au rod1. Dont les résultats indiquent que b3 (AuTR à 800 nm) et b7 (Au rod1 à 680 nm) ont un meilleur effet d'imagerie. Apparemment, un agent de contraste approprié pourrait fournir une absorption plus forte dans le PAI, entraînant une résolution plus élevée des images PA. La figure 3c, d, présente les comparaisons quantitatives des signaux photoacoustiques entre le sang pur et le sang mélangé avec AuTR et rod1. Les résultats montrent que l'amplitude du signal photoacoustique du sang mélangé avec AuTR est 2,3 fois plus élevée que celle du sang de bœuf frais pur à 800 nm, et que le groupe Au rod1 est 2,1 fois plus élevé à 680 nm. Les grands rehaussements apparaissent aux positions de leurs pics d'absorption longitudinaux. En d'autres termes, le comportement d'absorption des AuNR domine leur performance PAI.

Propriétés photoacoustiques in vitro des AuTR et des AuNR :a Intensité du signal photoacoustique dépendante de la concentration de AuTR et Au rod1 irradiés par un laser à 800 et 680 nm, respectivement, b PAI du capillaire en verre rempli avec l'équilibre sanguin mélangé avec 1 nM AuTR ou Au rod1 irradié par un laser à 800 et 680 nm, c , d la comparaison de l'amplitude du signal photoacoustique entre le sang pur et l'équilibre sanguin mélangé avec 1 nM AuTR ou Au rod1 irradié par laser 800 et 680 nm, e1 –e6 comparaison des spectres d'absorption (ligne continue) de cinq types d'AuNR synthétisés et de sang de bœuf frais obtenus à partir d'amplitude de signaux photoacoustiques à plusieurs longueurs d'onde (points de données)

Les spectres photoacoustique et optique de cinq types d'AuNR et de sang sont présentés sur les figures 3e1–e6. Les spectres de signaux photoacoustiques à plusieurs longueurs d'onde ont été obtenus en collectant des amplitudes de signaux photoacoustiques à différentes longueurs d'onde (de 680 à 900 nm), avec une solution aqueuse de 1 nM dans des tubes capillaires en verre. Clairement, les graphiques indiquent un bon accord entre les spectres de signaux photoacoustiques et les spectres optiques des AuNRs. Ces résultats indiquent clairement la faisabilité de l'application des AuNR dans le PAI sous des lasers de longueur d'onde appropriés et donnent quantitativement l'effet photoacoustique des AuNR à diverses longueurs d'onde de 680 à 900 nm.

Pour examiner la biotoxicité de AuNR sur le ciblage actif, les cellules Hela ont été incubées avec AuTR avec des concentrations de 0,25 à 1,0 nM. Le test MTT standard a été effectué pour déterminer la viabilité des cellules (Fig. 4a). Les résultats confirment que la combinaison d'AuTR-PEG induit le plus grand taux de survie cellulaire (95,3 % à 1 nM), en comparaison avec d'autres groupes dans les 24 h. Cela suggère que l'AuNR-PEG possède une faible cytotoxicité cellulaire et une bonne biocompatibilité [33, 34] et peut-être un agent de contraste photoacoustique prometteur. Bien que l'AuTR pur n'ait pas eu de toxicité significative (la viabilité cellulaire peut atteindre 71,2% à 1 nM), la mort cellulaire est apparue aux concentrations de 0,75 et 1,0 nM (Fig. 4b), indiquant qu'une faible concentration d'AuTR est plus appropriée pour la photoacoustique. l'imagerie, tandis qu'une concentration élevée pourrait induire la mort cellulaire [35, 36]. Par conséquent, pour tenir compte à la fois de l'efficacité photoacoustique et de la biotoxicité des AuNR, la concentration de 1 nM a été choisie comme condition appropriée pour le PAI in vivo.

Viabilités relatives des cellules Hela après avoir été incubées avec diverses concentrations d'AuTR avec et sans PEG modifié dans les 24 h :a histogramme des viabilités cellulaires relatives et b images de microscopie optique de cellules Hela

L'imagerie photoacoustique est une modalité d'imagerie non invasive offrant une profondeur d'imagerie in vivo et une résolution spatiale accrues par rapport aux autres méthodes d'imagerie optique traditionnelles [37,38,39,40]. Nous avons découvert que l'AuNR-PEG avec une absorbance NIR élevée pouvait être utilisé comme un excellent agent de contraste dans l'imagerie photoacoustique (Fig. 5). La figure 5a montre la photographie des vaisseaux sanguins cérébraux d'une souris sélectionnée comme échantillon PAI in vivo. Les figures 5b1-b6 présentent les images photoacoustiques des vaisseaux sanguins du cerveau de souris pour l'échantillon avec et sans additifs AuNR-PEG, respectivement à des lasers de 800 et 680 nm de longueur d'onde. Dont les résultats montrent qu'avant l'injection d'AuNR-PEG, il n'y a que des formes approximatives de vaisseaux sanguins cérébraux principaux dans les images PA du groupe témoin (Fig. 5b1, b4), et certains vaisseaux ramifiés sont mélangés en arrière-plan et difficiles à distinguer , quelle que soit la longueur d'onde du laser utilisé. Lorsque l'agent de contraste (AuTR-PEG et Au rod1-PEG) ont été injectés, la qualité des images PA a été grandement améliorée, et certains vaisseaux de branches fines disparus du cerveau (dans le groupe témoin) ressortent clairement, en particulier les images d'AuTR-PEG capturé à 800 nm et Au rod1-PEG à 680 nm.

Photographie et images PA des vaisseaux sanguins du cerveau de souris :a photographie de souris cérébrovasculaire, b Schéma d'images PA des vaisseaux sanguins cérébraux de souris avant et après injection intraveineuse d'AuTR ou Au rod1, irradiés par un laser de longueur d'onde de 800 et 680 nm

Les images photoacoustiques des Fig. 5b1–b6 ont également été analysées quantitativement (Tableau 1) à partir des aspects du contraste et du rapport signal-bruit (SNR). Le contraste moyen de l'image entière correspondant à chaque pixel a été calculé à partir de dix points, qui ont été sélectionnés au hasard sur la même position des vaisseaux sanguins du cerveau de la souris. Le contraste moyen des images du groupe témoin est de 1,113 sur la figure 5b1 et de 1,076 sur la figure 5b4. Après avoir été injecté avec AuNR-PEG, la qualité de toutes les images est améliorée à différents degrés. Dans le groupe AuTR/800 nm, l'aorte est claire à observer (Fig. 5b2), et le contraste moyen peut atteindre jusqu'à 3,451, 3,1 fois pour le groupe témoin. Dans une comparaison parallèle au groupe Au rod1/800 nm (Fig. 5b3), le contraste moyen n'est que de 1,514, 1,36 fois par rapport au groupe témoin. Cependant, lorsque la longueur d'onde du laser est passée à 680 nm, le contraste de AuTR n'est que de 1,925, bien inférieur à celui de Au rod1 (3,692, 3,6 fois pour le groupe témoin). Le SNR des images du groupe AuTR a été optimisé 5,6 fois à 800 nm pour le groupe de contrôle, et le groupe Au rod1 a également été amélioré 5,7 fois à 680 nm. Ces résultats sont fondamentalement cohérents avec ceux in vitro, c'est-à-dire que les grandes améliorations de la qualité de l'image peuvent être attribuées à leurs grands pics d'absorption longitudinaux respectifs.

Conclusions

À l'aide d'acide ascorbique, des nanotiges d'or à rapport d'aspect ajustable, allant de 8,5 à 15,6, ont été synthétisées par une méthode de synthèse modifiée à médiation par les semences. Ces nanotiges d'or pourraient fournir des pics d'absorption réglables de 680 à 1100 nm, couvrant la première fenêtre NIR biologique. Lorsqu'ils sont modifiés avec SH-PEG, les AuNRs synthétisés présentent une excellente biocompatibilité et stabilité, ce qui préfigure le grand potentiel de leur application dans le proche infrarouge comme agent de contraste photoacoustique. Les deux expériences in vitro et in vivo confirment que les AuNR synthétisés du rapport hauteur/largeur accordable pourraient offrir un contraste plus fort et des valeurs SNR plus élevées dans le PAI, sous des lasers de longueur d'onde appropriés. Ce travail fournit un moyen possible de synthétiser de manière contrôlée l'agent de contraste sous n'importe quelle longueur d'onde dans la première fenêtre NIR et utilisé pour visualiser des maladies telles que l'hémorragie intracérébrale et le thrombus.

Abréviations

1D :

Unidimensionnel

AA :

acide l(+)-ascorbique

AuNR :

Au nanotige

AuTR :

Au nanotiges typiques

CTAB :

Bromure de cétyl triméthylammonium

ADN :

Acide désoxyribonucléique

MTT :

Méthyl thiazolyl tétrazolium

NIR :

Proche infrarouge

NR :

Nanotiges

OPO :

Oscillateur paramétrique optique

PA :

Photoacoustique

PAI :

Imagerie photoacoustique

SAED :

Diffraction électronique à zone sélectionnée

SEM :

Microscopie électronique à balayage

SH-PEG :

Thiol-polyéthylène glycol

SNR :

Rapport signal-bruit

SPR :

Résonance plasmonique de surface

TEM :

Microscopie électronique à transmission