L'administration de nanoparticules magnétiques Fe3O4 modifiées de CpG inhibe la croissance tumorale et les métastases pulmonaires spontanées pour améliorer l'immunothérapie

Contexte

Les tumeurs malignes sont l'une des principales maladies menaçant la santé et la vie humaines, et l'incidence des tumeurs ne cesse d'augmenter [1, 2]. Malheureusement, les résultats des traitements traditionnels tels que la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie des tumeurs malignes n'ont pas été remarquablement efficaces. Contrairement à la chimiothérapie et à la radiothérapie, qui ciblent les cellules à prolifération rapide pour la mort, les immunothérapies sont conçues pour renforcer le propre système de défense immunitaire de l'hôte afin de cibler et d'éliminer les cellules tumorales.

Il est à noter que les CpG immunothérapeutiques ont été largement étudiées pour leur efficacité dans la prévention et la régression tumorale [3]. Malgré des données cliniques encourageantes, l'utilisation de CpG libres présente encore plusieurs inconvénients. Premièrement, les CpG sont sensibles à la dégradation induite par la nucléase dans des conditions biologiques. Deuxièmement, ils manquent de spécificité pour cibler les cellules après administration systémique et ont une faible absorption cellulaire. Par conséquent, des améliorations seront probablement nécessaires. Étant donné que les TLR9 se localisent sur les endosomes, nous avons émis l'hypothèse que la faible absorption de CpG par les cellules inflammatoires associées aux tumeurs provoque une faible réponse clinique. Ainsi, les méthodes qui améliorent l'internalisation des CpG pourraient potentialiser sa réponse immunostimulante.

A l'exception des inconvénients du CpG libre, la voie d'administration du CpG affecte la capacité antitumorale et la toxicité. Les CpG libres et autres oligonucléotides phosphorothioates stables administrés par injection intraveineuse sont éliminés rapidement et ont une large distribution tissulaire [4, 5]. De plus, le CpG libre administré par voie systémique peut induire une activation immunitaire non spécifique, entraînant des effets secondaires graves, notamment l'épuisement des cellules immunitaires, la destruction des follicules lymphoïdes, des lésions hépatiques et l'exacerbation de maladies auto-immunes [6,7,8]. Ces propriétés peuvent expliquer l'échec des CpG libres administrés par voie systémique chez les patients humains [9]. Des études antérieures ont démontré que l'injection intratumorale de CpG avait un grand effet antitumoral en « focalisant » la stimulation immunitaire sur les sites tumoraux [10]. Comment contrôler le temps de rétention du CpG injecté dans la tumeur est un problème.

En utilisant le récepteur de type péage-9, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules NK peuvent reconnaître les CpG, qui sont courantes dans l'ADN bactérien [11]. Les CpG induisent les cellules immunitaires à produire des chimiokines et des cytokines, ainsi que les molécules de surface cellulaire costimulatrices régulées à la hausse des cellules T [12,13,14,15]. Ainsi, les CpG sont devenus de puissants adjuvants polarisants de type 1 [16, 17]. De plus, l'injection de CpG directement dans les tumeurs est une forme d'immunisation qui utilise la tumeur in situ comme source d'antigène et introduit le CpG comme adjuvant pour activer une réponse immunitaire au sein de la tumeur. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que l'injection intratumorale de CpG abolirait le privilège immunitaire des tumeurs via le recrutement et l'activation de cellules dendritiques locales, en fonction de la voie de réponse des cellules T antitumorales de type 1.

Pour surmonter les problèmes susmentionnés, nous avons développé une plate-forme de particules magnétiques modifiée basée sur Fe₃ O₄ particules pour diriger et contrôler la libération de CpG par injection intratumorale au niveau des sites tumoraux. En raison de certaines caractéristiques uniques de Fe₃ O₄ particules magnétiques, en particulier leur bonne histocompatibilité [18], leur superparamagnétisme [19, 20], leur faible toxicité [21] et leur préparation facile et leur administration ciblée de médicaments avec un champ magnétique externe [22, 23], leur mouvement et leur concentration peuvent être contrôlés dans le corps avec un champ magnétique externe, permettant au Fe₃ O₄ particules à utiliser comme supports de médecine génique avec une efficacité de transfection génique améliorée [24]. De plus, enduction APTES sur Fe₃ O₄ particules par liaison covalente empêche la formation d'agrégats et offre plus de sites de modification (groupes amino) [25, 26] pour une aide supplémentaire dans la liaison de CpG. Dans cette étude, Fe₃ O₄ les particules magnétiques ont été préparées par une méthode de co-précipitation [27] et modifiées avec APTES. Les CpG ont été fermement liés à la surface du Fe₃ modifié O₄ particules par interaction électrostatique pour former des particules FeNP/CpG d'un diamètre d'environ 50 nm. D'autres études ont montré que les systèmes d'administration de particules de FeNP ont une efficacité d'absorption améliorée de CpG par rapport à celle de CpG libre dans les cellules dendritiques, et l'injection intratumorale de particules de FeNP/CpG stimule une réponse immunitaire antitumorale efficace de type Th1 non seulement pour restreindre la tumeur dans croissance in situ mais aussi pour inhiber les métastases tumorales dans les modèles de cancer du côlon C26 et de cancer du sein 4T1 in vivo. Par conséquent, la thérapie de nanopréparation peut être une stratégie potentielle d'immunothérapie tumorale.

Matériaux et méthodes

Matériaux et animaux

Le 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) a été obtenu auprès d'Aladdin Company, Inc. Chlorure ferrique hexahydraté (FeCl₃ 6H₂ O) et chlorure ferreux tétrahydraté (FeCl₂ ∙4H₂ O) ont été achetés auprès de l'Institut de recherche de l'industrie chimique fine de Tianjin Guangfu. Le CpG suivant a été synthétisé par Invitrogen Co. :5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'. L'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) a été acheté chez Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).

Une lignée cellulaire de rein embryonnaire humain (293T), une lignée cellulaire de tumeur mammaire murine (4T1) et une lignée cellulaire de cancer du côlon (C26) ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC), et des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC) ont été obtenues de souris BALB/c. Des souris femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines ont été achetées auprès de Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltd. Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes. Tous les protocoles animaux ont été réalisés conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health.

Préparation de FeNP

La méthode de co-précipitation a été utilisée pour la synthèse de Fe₃ O₄ particules [29]. Dans la procédure expérimentale, 11,68 g de FeCl₃ 6H₂ O et 4,30 g FeCl₂ ∙4H₂ O ont été ajoutés dans un ballon tricol contenant 200 mL d'eau déminéralisée à 80 °C, suivis de l'ajout de 15 ml de NH 25 %₃ ·H₂ O. Au cours du processus de réaction d'une heure, le mélange a été purgé avec du N₂ et agité. Trente milligrammes de Fe₃ préparé O₄ a été dispersé dans un mélange de 60 ml d'eau déminéralisée et d'éthanol absolu par vibration ultrasonique pendant 30 min. 0,3 g de Fe₃ préparé O₄ a été dispersé dans un mélange de 4 mL d'eau déminéralisée et 600 mL d'éthanol absolu par vibration ultrasonique pendant 30 min. Ensuite, 1,2 ml d'APTES ont été ajoutés au mélange sous agitation mécanique constante pendant 7 h. Le Fe₃ modifié par APTES fonctionnalisé résultant O₄ Les nanoparticules (FeNP) ont été séparées magnétiquement du surnageant par un aimant, puis lavées à l'éthanol et séchées à 40 °C sous vide pendant 24 h. Enfin, le précipité de FeNP a été préparé pour une utilisation ultérieure.

Caractérisation des particules FeNP/CpG

Les spectres de distribution granulométrique de Fe₃ O₄ Les particules , FeNP et FeNP/CpG ont été déterminées à l'aide d'un granulomètre laser Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni) à 25 °C. Chaque test a été effectué trois fois, et la valeur moyenne a été prise. Un microscope électronique à transmission (H-6009IV ; Hitachi Ltd., Tokyo, Japon) et un microscope électronique à balayage (MEB) ont été utilisés pour observer la morphologie des particules préparées.

Un dosage retardateur d'agarose a été réalisé pour évaluer la capacité de liaison CpG des particules de FeNP. En bref, le Fe₃ modifié APTES fonctionnalisé O₄ particules (FeNP) a été mélangé avec 1 μg CpG à différents ratios (FeNP:CpG, w /w ) dans de l'eau distillée. Après une co-incubation de 30 min à température ambiante, les mélanges ont subi une électrophorèse sur un 1% (w /v ) gel d'agarose à 120 V pendant 30 min. Le gel a ensuite été coloré avec Golden View™ (0,5 mg/mL) et photographié par un enlumineur UV (Bio-Rad ChemiDox XRS, USA).

Test MTT

La cytotoxicité des particules de FeNP pour les lignées cellulaires C26, 4T1 et 293T a été évaluée avec un test MTT. Les cellules C26, 4T1 et 293T ont été étalées à une densité de 5 × 10 ³ cellules par puits dans 100 μL de milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS dans des plaques à 96 puits et cultivées pendant 24 h ou 72 h. Les cellules préparées ont été exposées à une série de particules de FeNP à différentes concentrations :1,25, 0,625, 0,3, 0,15, 0,07, 0,03, 0,01 et 0 mg/ml en sextuplé. Après avoir cultivé pendant des périodes précises, 100 μl de milieu complet et 10 μl de MTT ont été pipetés dans chaque puits et incubés à 37 °C pendant 4 h. Du DMSO a été ajouté au soluté pendant 30 minutes et du formazan s'est formé. Ensuite, l'absorbance a été mesurée à 570 nm avec un luminomètre à plaque de microtitration Spectramax M5 (Molecular Devices, USA). La viabilité cellulaire des cellules non traitées a été considérée à 100 %.

Transfection In Vitro

Les BMDC ont été préparées à partir de souris BALB/c. En bref, les cellules de moelle osseuse du fémur et du tibia ont été rincées avec des milieux de culture libres contenant du FBS 1640 à l'aide d'une seringue. Les cellules ont été centrifugées à 1500 tr/min pendant 3 min, traitées avec du tampon de lyse ACK (Lonza Inc.) pour éliminer les globules rouges et remises en suspension dans du milieu de culture RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine ( 100 U/mL) à 37 °C dans 5 % de CO2 avec 20 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF). Les cellules ont ensuite été ensemencées dans des plaques à six puits à une densité de 10 ⁶ cellules par puits, et le milieu de croissance a été changé tous les 2 jours. Les cellules dendritiques ont été récoltées au jour 7.

Le jour 7, un équivalent particulaire de 0,2 g de CpG libre conjugué au FITC (CpG-FITC) ou de FeNP délivrant du CpG-FITC avec un rapport de masse de 10:1 a été ajouté aux puits préconçus. Une ou 3 h après la transfection, les milieux de croissance ont été retirés, les cellules ont été colorées avec du DAPI pendant 10 min et les cellules ont été lavées trois fois avec du sérum physiologique. Des photos de chaque puits ont été prises avec un microscope confocal à balayage laser (LSCM) et l'efficacité de la transfection a été mesurée par cytométrie en flux (NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences, USA).

Test d'inhibition tumorale in vivo

Cent mille cellules C26 ou 4T1 ont été injectées par voie sous-cutanée sur le dos de chaque souris BALB/c (âgées de 6 à 8 semaines). Les volumes des tumeurs ont ensuite été mesurés à l'aide d'un pied à coulisse numérique et calculés par la formule suivante :volume de la tumeur =0,5 × longueur (mm) × [largeur (mm)] ² . Une fois que les tumeurs ont atteint environ 50 mm ³ en taille, les traitements ont été appliqués. Les souris (n =  10) ont reçu soit des injections intratumorales de CpG/FeNP (dans un rapport de 10 : 1) particulaire équivalant à 20 μg de CpG ou de CpG seul tous les 3 jours pour quatre traitements. Les souris recevant un équivalent de sérum physiologique normal (NS) ou de particules de FeNP ont été considérées comme des groupes témoins. La taille de la tumeur et le poids corporel des animaux ont été surveillés tous les 3 jours. Au jour 31, toutes les souris ont été sacrifiées par luxation des vertèbres cervicales. Le tissu tumoral et d'autres organes importants ont été fixés avec du formol neutre à 4 % suivi d'une coupe à la paraffine pour la coloration HE afin d'évaluer la différence morphologique et pour l'immunofluorescence afin de tester les microenvironnements tumoraux. Dans le modèle 4T1, nous avons mesuré le poids de la tumeur et compté le nombre de nodules métastatiques pulmonaires.

L'expérience de re-challenge de tumeur a été traitée dans le modèle C26. En bref, les souris guéries avec le traitement FeNP/CpG ont été re-challengées avec 5 × 10 ⁵ Cellules C26 ou 4T1 s.c. en deux sites séparés sur le côté opposé du flanc sans autre traitement. Les souris ont été sacrifiées lorsque le volume de la tumeur 4T1 a atteint 200 à 300 mm ³ ou 20 jours.

Dosage des lymphocytes T cytotoxiques

Le dosage des CTL a été réalisé selon des méthodes publiées. En détail, les lymphocytes de la rate en tant que cellules effectrices ont été récoltés et appauvris en globules rouges avec du chlorure d'ammonium et passés à travers de la laine de nylon à la fin des expériences de traitement. 4T1 ou C26 en tant que cellules cibles ont été marqués avec 300 mci de Na₂ ⁵¹ CrO₄ pendant 2 h puis lavé avec du PBS et distribué dans des plaques à 96 puits. Les cellules effectrices préparées ont été co-incubées avec les cellules cibles à différents rapports E:T. Les surnageants contenant la radioactivité des cellules cibles ont été mesurés avec un compteur à scintillation. La lyse spécifique a été déterminée comme suit :% de lyse spécifique =100 [(libération en présence de CTL libération spontanée)/(libération maximale libération spontanée)]. Dans toutes les expériences, la libération spontanée était inférieure à 30 % de la libération maximale.

Test ELISpot

Les splénocytes ont été récoltés sur des souris témoins ou traitées au CpG à la fin de l'expérience, et les tests ELISpot ont été effectués à l'aide du kit souris IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot selon les instructions du fabricant. Les splénocytes récoltés ont été co-incubés avec leurs traitements respectifs pendant 96 h, la suspension a été abandonnée et les cellules ont été lavées trois fois avec du tampon de lavage avant d'ajouter l'anticorps mixte d'IFN-γ et d'IL-4. Après avoir été traité par des agents chromogènes, le nombre de cellules formant des taches (SFC) a été compté au microscope.

Test ELISA

Un ELISA a été réalisé pour déterminer les niveaux de titres d'anticorps sériques spécifiques de Ct selon les instructions du fabricant. En bref, des microplaques recouvertes de protéine Ct entière purifiée (BestBio Biotechnology Co. Shanghai, Chine) ont été rincées avec une solution de PBS contenant 0,05 % de Tween 20 (PBST) puis bloquées avec 100 μl de tampon de blocage (5% de lait écrémé dans du PBST) à 37 °C pendant 1 h. Après avoir été rincées cinq fois avec du PBST, les plaques ont été incubées avec des sérums immuns (dilués à 1:1000 dans du tampon de blocage, 100 μl/puits) ou des lavages vaginaux (dilués à 1:10 dans du tampon de blocage, 100 μl/puits) à 37 °C pendant 2 h. Après avoir été rincées cinq fois avec du PBST, les plaques ont été incubées avec un anticorps IgG de chèvre anti-souris conjugué à HRP (dilué à 1:1000 dans du tampon de blocage, 100 μl/puits) ou un anticorps IgA de chèvre anti-souris conjugué à HRP (dilué à 1:2000 dans un tampon de blocage, 100 μl/puits) à 37 °C pendant 1 h.

Analyse histologique

Le tissu tumoral et les principaux organes récoltés lors d'études d'inhibition in vivo ont été fixés et inclus dans de la paraffine. Après déparaffinage et réhydratation, les coupes de tissus inclus dans la cire étaient colorées avec le HE de Mayer. Pour analyser les lymphocytes infiltrants (TIL) dans les tissus tumoraux de chaque groupe, des coupes ont été soumises à une réparation antigénique à haute pression, colorées avec des anti-souris FITC-CD4, PE-CD8 et PE-CD49b (en tant que fabricant de NK) (BD, USA) pendant 1 h à 4 °C, puis coloré au DAPI pendant 10 min avant le lavage au PBS pour l'imagerie. Une image de chaque groupe a été prise au microscope à fluorescence positive (Olympus, Japon).

Analyse statistique

Les données ont été exprimées en valeur moyenne ±  écart type. L'analyse statistique a été réalisée avec une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) en utilisant le logiciel SPSS 17 du logiciel Prism 5.0c (logiciel GraphPad, La Jolla, CA, USA). Une comparaison intergroupe a été réalisée à l'aide du test de Tukey pour l'analyse de variance à un facteur (ANOVA). P les valeurs < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Résultats

Préparation et caractérisation des particules FeNP/CpG

Pour développer une particule magnétique pour l'administration de CpG avec une faible cytotoxicité, Fe₃ O₄ les particules ont été synthétisées en utilisant la méthode de co-précipitation comme le montre la figure 1a. Greffage des groupements aminopropylsilane (–O)3Si–CH2–CH2–CH2–NH2 d'APTES à la surface de Fe₃ O₄ pour former des particules de FeNP (Fig. 1b). Les CpG chargés négativement (CpG) se lient aux groupes fonctionnels efficaces fournis par l'APTES pour former des particules FeNP/CpG par le biais d'interactions électrostatiques, comme représenté schématiquement sur la figure 1c. Sur la base de la mesure de diffusion dynamique de la lumière, la taille du Fe₃ préparé O₄ particules était de 10,7 ± 4,1 nm (Fig. 2a). Comme observé par MET (Fig. 2b) et SEM (Fig. 2c), Fe₃ O₄ développé dans ce travail présentait une forme uniforme et presque sphérique. Le diamètre dynamique de Fe₃ modifié par APTES O₄ particules était de 34,5 ± 5,0 nm (Fig. 2d), ce qui était en bon accord avec les résultats MET (Fig. 2e).

Préparation de particules FeNP/CpG. un Equation de synthèse de Fe₃ O₄ particules magnétiques en utilisant la méthode de co-précipitation. b Réactions d'hydrolyse et de condensation avec production de polymère de silane et réaction de silanisation d'APTES à la surface de la magnétite pour former des particules de FeNP. c Schéma de principe des particules FeNP/CpG. Les CpG sont liés à la surface des FeNP par des interactions électrostatiques pour former des particules FeNP/CpG

Caractérisation des particules FeNP/CpG. un Spectre de distribution de taille de Fe₃ O₄ particules. b Image au microscope électronique à transmission (MET) de Fe₃ O₄ . c Image en microscopie électronique à balayage de Fe₃ O₄ particules. d Distribution granulométrique du Fe₃ enrobé APTES O₄ (FeNP) particules. e L'image MET des particules de FeNP. f La capacité de liaison CpG des FeNPs déterminée par essai de retard de gel. Toutes les données représentent trois expériences indépendantes

Pour illustrer la capacité de liaison des particules de FeNP à CpG, un essai de retard sur gel a été effectué (Fig. 2f). Lorsque le rapport molaire FeNP avec CpG était de 10:1, aucune bande CpG brillante n'a été observée, montrant que le CpG chargé négativement peut être complètement adsorbé par les particules de FeNP par le biais d'interactions électrostatiques après électrophorèse. Par conséquent, nous avons choisi ce ratio de prescription pour une application ultérieure dans notre étude. Ensemble, ces résultats ont démontré que le CpG peut se combiner avec succès à la surface des FeNP par le biais d'interactions électrostatiques, montrant une stabilité et une petite dimension.

Viabilité cellulaire et transfection de particules FeNP/CpG in vitro

Pour décrire plus en détail la caractérisation biophysique in vitro, nous avons détecté la cytotoxicité des FeNPs dans les cellules 293T, 4T1 et C26 au bout de 24 h ou 72 h (Fig. 3a). Il n'y avait pas de relation dose-dépendante évidente entre la viabilité cellulaire et les particules de FeNP dans les cellules 293T, C26 et 4T1. Le taux de survie cellulaire était supérieur à 80 % à 24 h et 60 % à 72 h sur trois types de cellules, même à une concentration de FeNP de 1,25 mg/ml. Ces résultats ont prouvé la biocompatibilité des particules de FeNP que ce soit pour les cellules normales (293T) ou les cellules tumorales (C26, 4T1).

Cytotoxicité et activité d'absorption des particules FeNP/CpG in vitro. un Dosage MTT. Nous avons détecté la viabilité des cellules 293T, 4T1 et C26 après traitement avec diverses concentrations de particules de FeNP pendant 24 h ou 72 h. Il n'y avait aucune différence significative dans la viabilité cellulaire à n'importe quelle dose de FeNPs. b , c La détection de l'absorption de FeNP/CpG dans les BMDC. BMDC préparés après GM -CSF traitement pendant 7 jours ont été transfectés avec du CpG-FITC ou du CpG-FITC délivré par FeNP pendant 1 ou 3 h avant d'être intensément lavés, fixés et marqués au DAPI. Les images ont été capturées par microscopie confocale à balayage laser (LSCM). Comparé à celui du CpG libre marqué au FITC, le FeNP/CpG avec une intensité de fluorescence améliorée (b ) et l'efficacité de la transfection étaient statistiquement significatives (c ). Ces données étaient représentatives de trois expériences indépendantes, l'erreur standard moyenne  ± ; *P  0,05, *P  0,01 et ****P  0,001 vs le groupe non traité

Les cellules dendritiques en tant que cellules réceptrices majeures pour CpG jouent un rôle important dans une réponse immunitaire antitumorale médiée par TLR9. Le CpG en tant qu'adjuvant polarisant de type 1 puissant induit les CD à activer une réponse immunitaire au sein de la tumeur en sécrétant des chimiokines et des cytokines. Par conséquent, la livraison efficace de CPG dans les cellules DC est cruciale pour obtenir une réponse antitumorale. Dans notre étude, des CpG conjugués au FITC ont été utilisés pour étudier la capacité de livraison des particules de FeNP aux CD in vitro. Après 1 ou 3 h post-transfection, par microscopie confocale à balayage laser (LSCM), l'intensité de fluorescence cellulaire dans les groupes traités par des particules de FeNP revêtues de CpG conjuguées au FITC (FeNP/CpG-FITC) était supérieure à celle des groupes quantité équivalente de groupes CpG libres (Fig. 3b). Les particules FeNP/CpG-FITC ont pu transfecter jusqu'à 18,3 % des DC après 1 h. Ensuite, 3 h après la transfection, le rapport des cellules positives a augmenté à 39,2 % (Fig. 3c). Pendant ce temps, en ce qui concerne les cellules traitées au CpG conjuguées au FITC libres, une fluorescence minimale a pu être observée même 3 heures après la transfection, avec moins de 10 % de transfection. Ainsi, il est suggéré que l'administration de CpG par des particules de FeNP a augmenté l'absorption cellulaire de CpG.

Les FeNP délivrent des CpG à la xénogreffe et inhibent la croissance tumorale et les métastases pulmonaires spontanées in vivo

L'activité anticancéreuse des particules CpG/FeNP a été évaluée pour la première fois dans des modèles de tumeurs de transplantation sous-cutanée de cancer du côlon C26 et de cancer du sein 4T1 in vivo. Lorsque le volume tumoral était d'environ 50 mm ³ , les souris ont été réparties au hasard en quatre groupes pour commencer le traitement (n = 10). Les souris ont été traitées avec une injection intratumorale de particules CpG/FeNP à trois reprises tout au long de l'expérience (Fig. 4a). Dans notre étude, l'injection intratumorale de particules FeNP/CpG a entraîné une inhibition significative de la croissance tumorale des xénogreffes par rapport à celle des groupes témoins, et le taux d'inhibition a atteint 69 % (P < 0,05 versus NS) (Fig. 4b). Par rapport au groupe de traitement salin normal (NS) (0,90 ± 0,08 g) et au groupe FeNP (0,81 ± 0,03 g), les groupes traités aux particules FeNP/CpG ont connu une réduction statistiquement significative du poids de la tumeur (0,38 ± 0,03 g, P < 0,001). Comparativement, le groupe CpG libre a montré une capacité anticancéreuse minimale (0,68 ± 0,03 g) (Fig. 4c). De plus, les souris du groupe témoin PBS ont développé des métastases pulmonaires étendues, en comparaison, celles traitées avec les particules FeNP/CpG ont montré une diminution de 64,1 % du nombre de nodules tumoraux dans le poumon (Fig. 4d, e), démontrant la puissance des particules FeNP/CpG dans le traitement des tumeurs métastatiques. Comme le montre la figure 4f, la coloration H&E du poumon a montré une charge pulmonaire réduite avec des métastases clairement pulmonaires après traitement FeNP/CpG par rapport aux autres groupes. Ces résultats indiquent que l'administration de FeNP CpG dans les cellules 4T1 a non seulement inhibé de manière significative la croissance tumorale 4T1 (P < 0,001 contre NS) mais a également supprimé les métastases du cancer du sein aux poumons.

Capacité antitumorale des particules FeNP/CpG in vivo. un Schéma de traitement des antitumorales par particules FeNP/CpG à la fois dans les modèles de xénogreffes de cancer du côlon C26 et de cancer du sein 4T1 par injection intratumorale in vivo. b –d Le traitement des particules FeNP/CpG a inhibé la croissance des tumeurs 4T1. b Courbes de croissance tumorale représentatives du modèle tumoral 4T1. c Poids moyen de la tumeur. d Nodule tumoral pulmonaire moyen dans chaque groupe montrant clairement des métastases pulmonaires après injection intratumorale de FeNP/CpG. e , f Imagerie en fond clair et coloration H&E des poumons :e Le nombre de métastases pulmonaires visibles, les flèches indiquent les métastases pulmonaires. f Coloration H&E des métastases pulmonaires. Barres d'échelle, 100 μm pour la coloration H&E. g , h Les particules FeNP/CpG ont inhibé de manière significative la croissance des tumeurs xénogreffes C26 :e courbes de croissance tumorale de chaque groupe au cours de l'expérience et f poids tumoral moyen. Il y avait 10 souris dans chaque groupe. g Expérience de re-challenge tumoral. je Dans le modèle C26, les souris qui ont été guéries avec un traitement FeNP/CpG ont été à nouveau contestées avec 5 × 10 ⁵ Cellules C26 (flanc droit) ou 4T1 (flanc gauche) s.c. en deux sites séparés sur le côté opposé du flanc sans autre traitement. Les images présentées sont des souris représentatives 20 jours après la nouvelle provocation tumorale. Toutes les données étaient représentatives de trois expériences indépendantes, la moyenne  ± SEM; *P  0,05, *P  0,01 et ****P  0,001

De même, un effet antitumoral amélioré significatif avec les groupes de traitement FeNP/CpG a été observé dans le modèle sous-cutané de souris incubées avec C26. Comme le montre la figure 4g, la tumeur s'est développée rapidement chez les souris témoins, le groupe véhicule et le groupe CpG, avec des volumes tumoraux moyens d'environ 2 300  ± 239,4 mm ³ , 2116,7 ± 360,9 mm ³ , et 1353,3 ± 158,9 mm ³ , respectivement, au jour 31. En revanche, dans le groupe FeNP/CpG, la croissance tumorale était extrêmement inhibée, avec un volume tumoral moyen d'environ 153,7 ± 62,7 mm ³ (P < 0,01 versus NS) et un taux inhibiteur de 94,4%. Les tumeurs semblaient se développer lentement après le traitement initial, et une partie des tumeurs commençait à disparaître progressivement après la fin des trois traitements. Plus important encore, dans les groupes de traitement aux particules FeNP/CpG, les tumeurs de près de la moitié des souris avaient complètement disparu à la fin de l'expérience. Comme le montre la figure 4h, le groupe de traitement FeNP/CpG avait un poids tumoral moyen bien inférieur à celui des autres groupes (P < 0,001) :groupe de traitement FeNP/CpG (0,14 ± 0,08 g), groupe NS (2,41 ± 0,26 g), groupe FeNP (2,50 ± 0,4 g) et groupe CpG (1,44 ± 0,32 g). Pour déterminer si les particules de FeNP/CpG étaient suffisantes pour médier la réponse antitumorale spécifique, une expérience de re-challenge tumoral a été réalisée dans le modèle C26 (Fig. 4i). Les souris dont les tumeurs étaient complètement régressives après le traitement aux particules FeNP/CpG dans le modèle de cancer du côlon C26 ont été inoculées avec des tumeurs 4T1 et C26 dans différentes positions sur les souris BALB/c par voie sous-cutanée, et aucun autre traitement n'a été administré. Toutes les tumeurs 4T1 se sont développées rapidement et leurs volumes ont dépassé 1000 mm3 au jour 20 après la provocation. En revanche, il y avait des tumeurs solides invisibles à l'œil nu dans le modèle C26, suggérant que les groupes de particules FeNP/CpG stimulaient une réponse antitumorale spécifique. Ces résultats suggèrent que l'injection intratumorale de particules FeNP/CpG inhibe efficacement la croissance d'un xénogreffe sous-cutanée.

Les particules FeNP/CpG stimulent la réponse immunitaire antitumorale systématique améliorée

Les mécanismes antitumoraux in vivo des particules FeNP/CpG dans les deux modèles ci-dessus ont été étudiés plus en détail. Pour étudier le type de réponse immunitaire, nous avons appliqué le test ELISpot pour analyser les niveaux d'IFN-γ/IL-4 de la rate de souris. Si le niveau d'IFN-γ dans les lymphocytes de la rate (montrant un érythème sur le tableau ELISpot) est significativement supérieur au niveau d'IL-4 (montrant des taches bleues sur le tableau ELISpot), le type de réponse immunitaire stimulée était Th1, à savoir, pour activer CD8 ⁺ Les lymphocytes T et principalement la réponse CTL du corps. Sinon, le type de réponse immunitaire était Th2, à savoir, pour activer principalement CD4 ⁺ Lymphocytes T, stimulant ainsi les lymphocytes B et produisant des anticorps spécifiques de l'antigène. Un test ELISpot bicolore a été réalisé pour mesurer l'expression de l'IFN-γ et de l'IL-4 dans différents traitements (Fig. 5a). Comparé à celui des trois autres groupes, le nombre de cellules formant des taches (SFC) d'IL-4 et d'IFN-γ sécrétés par les lymphocytes de la rate de souris avait une tendance ascendante dans le groupe de traitement aux particules FeNP/CpG, et le nombre de SFC la sécrétion d'IFN-γ était 1,5 fois supérieure à celle de l'IL-4 (P < 0,05), ce qui impliquait une réponse immunitaire cellulaire antitumorale améliorée après injection intratumorale de particules FeNP/CpG. De plus, le sérum des souris traitées par NS, FeNP, CpG et FeNP/CpG a été analysé à l'aide d'un test ELISA pour la présence d'IgG totales spécifiques à la tumeur après trois immunisations. Dans le modèle de tumeur C26, bien que les souris immunisées par FeNP/CpG aient développé des titres d'IgG spécifiques à la tumeur significativement plus élevés que ceux des autres groupes (Fig. 5b), il n'y avait pas de différence statistique entre les souris immunisées par FeNP/CpG et les souris immunisées par CpG .

The mechanism of antitumor immune response. un ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. b In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U essais. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T and NK (CD57 ⁺ ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. e The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay

To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P  < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P  < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe₃ O₄ to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.

The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and CD49B ⁺ NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 ⁺ T cells, and CD8 ⁺ T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P  < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.

Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. (un ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. b The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)

Discussion

Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8 ⁺ T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.

In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe₃ O₄ , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe₃ O₄ particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.

We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe₃ O₄ particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe₃ O₄ , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.

In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe₃ O₄ as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.

Conclusion

In summary, magnetic APTES-modified Fe₃ O₄ particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.

Abréviations

APTES:

3-Aminopropyltriethoxysilane

BMDC:

Bone marrow-derived dendritic cell

CpG:

Cytosine-phosphate-guanine

CpG-FITC:

FITC-conjugated CpG

FeNP:

3-Aminopropyltriethoxysilane-modified Fe₃ O₄ nanoparticle

FeNP/CpG:

FeNP-delivered CpG particles

FeNP/CpG-FITC:

FeNP-delivered CpG-FITC particles

GM -CSF :

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor