Les nanoparticules de maghémite agissent comme des nanozymes, améliorant la croissance et la tolérance au stress abiotique chez Brassica napus

Contexte

La sécurité alimentaire est d'une importance primordiale et une question urgente de notre monde en évolution. Un climat changeant et une population croissante incitent les scientifiques des plantes et les ingénieurs agronomes à innover des outils améliorés pour sécuriser la production alimentaire avec moins d'impact environnemental. Les nanotechnologies sont l'un de ces nouveaux outils qui peuvent être explorés pour résoudre ce problème de longue date [1,2,3]. Il est prévu que la nanotechnologie devienne une partie importante et intégrale de la chaîne de production alimentaire, servant, par exemple, un rôle dans la protection des cultures [4,5,6], les engrais [7, 8], les biocapteurs et l'agriculture de précision [9], et l'emballage et la sécurité alimentaire [10]. Les nanoparticules sont omniprésentes dans la nature et les plantes ont évolué en étant exposées à diverses nanoparticules [11]. Les nanoparticules d'oxyde de fer (ION) constituent une partie importante des nanoparticules d'origine naturelle [12]. Il existe des preuves que les plantes et les microbes du sol produisent des ION [11, 13, 14]. Alors que certains chercheurs se sont intéressés à la toxicité pour les plantes des ION fabriqués [15, 16], d'autres se sont concentrés sur la possibilité d'utiliser les ION comme engrais [17, 18, 19, 20, 21, 22]. Nanoparticules magnétiques de magnétite Fe₃ O₄ et maghémite γ-Fe₂ O₃ structure a été suggérée comme étant des nanozymes efficaces à la fois pour la capacité d'imitation de la peroxydase (à faible pH) et la capacité d'imitation de la catalase (à pH neutre) [23,24,25]. Il a été montré qu'à certaines concentrations, le nanooxyde de fer augmente la croissance des plantes par rapport à l'ajout de quantités équivalentes d'ions ferreux sous forme chélatée [17]. Nous émettons l'hypothèse que les capacités enzymatiques du nanooxyde de fer peuvent stimuler la croissance des plantes au-delà de celle d'une simple fertilisation en fer. En outre, nous suggérons que cela devrait aider les plantes lors de stress abiotiques courants tels que la sécheresse, où la catalase et la peroxydase deviennent importantes pour le piégeage des espèces réactives de l'oxygène (ROS) libérées. Ici, nous présentons des investigations pour tester cette hypothèse sur γ-Fe₂ O₃ et le colza oléagineux, cultivés en sol et environnement contrôlé.

Résultats

Effet des particules sur les caractères végétaux

En ajoutant des ION, nous avons augmenté la croissance du colza par rapport au simple ajout d'une quantité adéquate de fer chélaté. La longueur des feuilles a montré une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin, suggérant une augmentation de la division cellulaire ou de l'élongation cellulaire (Fig. 1a). Avant que les plantes ne soient soumises à la sécheresse, il y avait une augmentation statistiquement significative de la teneur en chlorophylle telle que mesurée par le SPAD-mètre, suggérant une meilleure fitness de ces plantes par rapport au témoin (Fig. 1b).

Différents paramètres physiologiques de plantes cultivées en pots avec un sol irrigué avec des nutriments ou des nutriments contenant des ION. un La longueur des feuilles individuelles augmente d'avant jusqu'après 5 jours de traitement ION (n = 16, p valeur = 0,053). b Teneur en chlorophylle dans les feuilles, mesurée avec la mesure SPAD (n = 16, p valeur = 0.000). Des lettres différentes signifient une différence statistiquement significative

La perte d'eau n'a pas montré de différence statistiquement significative, mais il y avait une tendance à une plus grande rétention d'eau dans les traitements avec des ION (Fig. 2a). Les poids frais, qui tiennent également compte de la croissance des plantes, ont toujours montré des valeurs plus élevées pour les traitements ION (Fig. 2b) et étaient statistiquement significatifs dans certains cas. Par exemple, une expérience de sécheresse prolongée est illustrée à la figure 3.

Paramètres de la plante après un stress hydrique. un Pourcentage du poids de la plante qui constitue l'eau. b Biomasse végétale après 5 jours de sécheresse (n = 8, p valeur = 0.127). Des lettres différentes signifient une différence statistiquement significative

Poids frais des plantes, mesuré après 5 jours de sécheresse. Différence statistiquement significative avec 15 répétitions biologiques et p valeur 0.01

Considérant que le contrôle a également une quantité adéquate de fer, de grandes différences de poids frais seraient exceptionnelles. Il a été observé que les plantes traitées aux ION ont mieux résisté que les témoins pendant la sécheresse et ont mieux récupéré après réarrosage (Fig 4).

Photos de plantes après réarrosage après 5 jours de stress hydrique. un Contrôler les plantes irriguées avec une solution nutritive. b Plantes irriguées avec une solution nutritive contenant 0,8 mg/ml d'ION. c Plantes irriguées avec une solution nutritive contenant 2 mg/ml d'ION

Effets des ION sur la concentration de peroxyde d'hydrogène dans les feuilles

La quantité de peroxyde d'hydrogène dans la feuille après la sécheresse a été considérablement réduite lorsque des ION ont été ajoutés à la solution nutritive utilisée pour l'arrosage. La variation était élevée dans les 0,8 mg ml ⁻¹ traitement; par conséquent, la différence par rapport aux autres traitements n'est pas statistiquement significative. Cependant, la différence entre le contrôle et la concentration la plus élevée de 2 mg ml ⁻¹ est statistiquement significatif avec un p valeur de 0,004 et une moyenne de 84 % supérieure dans le traitement témoin (Fig. 5).

Quantité de peroxyde d'hydrogène soluble par gramme de tissu foliaire de colza traité avec une solution nutritive contenant des ION et soumis à la sécheresse pendant 5 jours (n = 16, p valeur = 0.004)

Effets des ION sur la peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique avec les niveaux de MDA comme proxy a été réduite par l'ajout d'ION, avec une concentration moyenne inférieure de 36 % de MDA dans les feuilles des plantes avec 200 mg d'ION ajoutés. Nous avons ajouté un contrôle positif avec la même concentration molaire en ions fer (III) ; cependant, la variation était trop grande pour tirer des conclusions. La moyenne de la concentration inférieure en ION était également inférieure à celle du témoin, montrant une tendance à la réduction de la peroxydation lipidique dans les feuilles de colza (Fig. 6).

Concentration du produit de peroxydation lipidique MDA dans les feuilles de colza traitées avec une solution nutritive contenant des ION et sécheresse pendant 5 jours (n = 8, p valeur = 0,052)

Captation de particules végétales

Pour étudier l'absorption des particules dans le tissu foliaire, nous avons mesuré la teneur en fer des feuilles par spectroscopie d'émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES). En effet, une augmentation statistiquement significative du fer a été observée dans les traitements avec des nanoparticules de maghémite. Fait intéressant, la concentration de fer a été réduite dans les feuilles irriguées avec des ions de fer (III) superflus (Fig. 7).

Concentration de fer dans les feuilles de plantes de Brassica après traitement avec des nanoparticules de maghémite, par rapport au témoin avec la même solution nutritive ou la même solution nutritive avec un rapport 1:1 M d'ions fer (III). Des lettres différentes signifient une différence statistiquement significative (n = 15)

Pour corroborer davantage l'augmentation de la teneur en fer comme preuve de l'absorption des particules, nous avons mesuré l'aimantation à basse température dans les mêmes feuilles. Une aimantation plus importante a été observée en contrôle sous un champ magnétique intense, mais sans champ magnétique, l'aimantation rémanente était plus importante dans les feuilles traitées avec des nanoparticules de maghémite (Figs. 8 et 9). En raison de la petite taille de l'échantillon et de la grande variation, les différences ne sont pas statistiquement significatives, mais la tendance montre clairement une présence d'ions superparamagnétiques puisque l'aimantation est plus élevée sous contrôle sous des champs magnétiques élevés mais plus faible lorsqu'il n'y a pas de champ magnétique. Il est obscurci par la variation, mais dans certains échantillons, la présence d'ION était clairement visible (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). D'une part, à température suffisamment basse et à champ magnétique suffisamment élevé, l'aimantation des ions fer sera plus importante que celle des ION ferrimagnétiques. D'autre part, à la même température basse mais à champ magnétique nul, l'aimantation rémanente sera plus importante pour les ION en raison des moments magnétiques des nanoparticules bloqués.

Aimantation à basse température (2 K) de feuilles cendrées de plantes traitées avec des nanoparticules de maghémite par rapport à des plantes témoins. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne (n = 6)

Aimantation à basse température (2 K) de feuilles cendrées sous différents champs magnétiques. Le tracé ci-dessus à 10000 Oe a un p valeur de 0,8, et le tracé ci-dessous au champ zéro a un p valeur de 0,08 (n = 6)

Caractérisation des matériaux

Les ION produits par la méthode de Cui et al. (2013) ont formé un gel, indiquant une production réussie de nanoparticules de l'ordre de ~ 1-10 s nm. Le gel séché a été broyé en une poudre. Le MEB basse résolution ne peut pas montrer les particules individuelles mais la structure hiérarchique de la poudre est évidente; l'EDS de l'échantillon n'a détecté aucun Y, seulement du fer (Fig. 7).

Lorsqu'elles sont dispersées dans l'eau, les particules forment des agrégats, avec une taille hydrodynamique allant jusqu'à 500 nm, cependant 84 % des particules agrégées sont inférieures à 300 nm et au moins 11 % sont inférieures à 50 nm. En valeurs absolues, d'après les mesures Nanosight, il y a 4,28 × 10 ⁶ particules inférieures à 20 nm ml ⁻¹ , dans la dispersion diluée 50 fois nécessaire à la mesure (Fig. 8). En recalculant, cela signifie qu'il y a environ 2 × 10 ⁸ particules inférieures à 20 nm ml ⁻¹ dans les traitements.

Les images réalisées par l'AFM montrent un schéma similaire à celui du NTA combiné à la XRD vidéo infra, avec des tailles de particules allant de quelques nanomètres à des agrégats de plusieurs centaines de nanomètres (Fig. 9).

Le XRD des particules a été acquis 1 an après la production et montre toujours un schéma clair de structure maghémite, preuve d'une stabilisation réussie de la maghémite (Fig. 10). La taille des cristallites a été calculée à 3,8 nm en utilisant l'équation de Scherrer. Même si la structure est conservée, l'introduction de 13% de Y en poids, bien sûr, affecte les états vibrationnels des atomes (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3).

Image électronique à balayage de γ-Fe₂ O₃ synthétisé par synthèse sol-gel dirigée par l'yttrium et un spectre EDS du même matériau

Discussion

L'utilisation proposée des ION comme engrais à base de fer a déjà été étudiée dans d'autres systèmes [17,18,19]. Dans cette enquête, il a été testé pour la première fois s'il existe un effet enzymatique d'un engrais similaire, en plus de l'effet de fournir le micronutriment, le fer, à une espèce de culture importante. Le contrôle a reçu une quantité adéquate de fer chélaté. Nous avons également testé un contrôle positif, dans lequel une quantité équivalente molaire d'ions fer (III) a été complétée par le contrôle négatif avec une quantité adéquate de fer disponible pour la plante. Par conséquent, les effets positifs des ION observés dans nos expériences découlent des propriétés des ION. Nous voudrions suggérer que ce sont les effets enzymatiques connus des ION qui sont en jeu [23, 25, 26]. D'autres mécanismes ne peuvent toujours pas être exclus - les ION pourraient également interagir avec des protéines, des lipides et d'autres biomolécules [27], ou il se peut que les nanoparticules absorbent les ions de fer natifs à la surface et réduisent ainsi les réactions de Fenton nocives. Le fait que les niveaux de peroxyde d'hydrogène des feuilles aient été réduits dans les traitements ION est en soi une preuve indirecte de l'absorption des nanoparticules. Avec une concentration accrue de fer et une magnétisation modifiée dans la maghémite, le tableau devient plus complet. Le contrôle positif avec des ions fer (III) avait une concentration réduite de fer contenu dans les feuilles, indiquant que les plantes ont la capacité de réduire l'absorption d'ions fer comme mécanisme de défense. Cela suggère en outre que la concentration accrue de fer dans les feuilles lors des traitements à la maghémite est en effet constituée de nanoparticules, qui ne sont pas aussi toxiques pour la plante que des niveaux élevés d'ions fer peuvent l'être. Les mesures magnétiques montrent un comportement superparamagnétique et des moments magnétiques de nanoparticules bloqués à basse température typiques de très petits γ-Fe₂ O₃ dans les feuilles traitées à la maghémite [28], démontrant clairement l'absorption des nanoparticules. La quantité infime de Y administrée ne devrait produire aucun effet sur les plantes; les effets de Y sur les plantes sont peu connus, mais Fu et al. (2014) ont établi que 2 mg L ⁻¹ Y était la dose létale médiane (DL50) dans un système hydroponique, et Maksimovic et al. (2014) ont commencé à constater des effets toxiques à 10 ⁻⁵ mol L ⁻¹ Y [29, 30]. Dans la concentration la plus élevée utilisée dans nos expériences, une quantité approximative de 50 mg (5,6 10 ^-4 mol) de Y a été ajouté par pot par irrigation au sol, dont on ne peut s'attendre à ce qu'une fraction soit prélevée. Ce qui est absorbé ne devrait pas être facilement disponible sous forme d'ions, mais plutôt être lié dans les particules de maghémite. L'introduction de Y dans la synthèse a pour but de réduire la solubilité des nanoparticules de maghémite et également d'empêcher la transformation en hématite, une forme moins enzymatique de l'oxyde de fer. Sans aucun doute, il est bénéfique d'avoir une activité catalase accrue pendant les conditions de stress [31], car toute une gamme de conditions de stress sont connues pour provoquer des accumulations toxiques de H₂ O₂ [32][sub>. De plus, il est devenu de plus en plus évident que H₂ O₂ servent également de molécule de signalisation pour le stress [32, 33]. L'augmentation de la production de biomasse n'a pas encore été corroborée, de préférence en examinant également les rendements et la qualité des graines oléagineuses. D'autres caractéristiques, telles que l'augmentation de la vitesse de croissance des feuilles, une très bonne propriété en milieu agricole où la compétition contre les mauvaises herbes est cruciale, peuvent être facilement prises en considération. Il a été montré dans Arabidopsis que les nanoparticules de fer à valence zéro peuvent induire l'extrusion de protons dans l'apoplaste des feuilles et ainsi permettre l'expansion de la paroi cellulaire induite par la turgescence [34]. Le même effet a également été observé dans les racines, ce qui pourrait également être bénéfique lors de stress hydrique [35]. Ils ont également observé une augmentation des ouvertures stomatiques des feuilles pouvant entraîner une perte d'eau, mais lorsqu'ils ont mesuré, il n'y avait qu'une différence marginale par rapport au témoin. C'est un paradoxe connu que la relation entre l'ouverture des stomates et la transpiration de l'eau n'est pas linéaire [36]. Cette relation est également fortement affectée par l'environnement par, par exemple, l'humidité relative ou le vent [37]. Bien que les nanoparticules de valence zéro ne doivent bien sûr pas être considérées comme identiques à la maghémite, le mécanisme d'allongement des feuilles observé dans nos expériences doit être étudié. Ghafariyan et al. (2013) ont observé, comme nous, une augmentation de la concentration en chlorophylle dans les feuilles lors de l'ajout d'ION par rapport à un contrôle négatif sans fer du tout. Par rapport au fer chélaté, il n'y avait aucune différence. Cependant, l'ajout de quantités égales de fer chélaté sous forme d'ions entraînera une plus grande quantité de fer disponible pour les plantes, car dans le cas des particules, une grande partie du fer est stockée dans les structures cristallines. Par conséquent, il est possible que les plantes fertilisées uniquement avec des ION souffrent réellement d'une carence en fer. Nous avons trouvé des quantités plus élevées de chlorophylle dans les feuilles (selon les mesures SPAD, voir Fig. 1) lorsque des ION ont été ajoutés aux auxiliaires du fer chélaté. Nous avons également mesuré une quantité réduite de peroxyde d'hydrogène et de MDA dans les feuilles, après la sécheresse, lorsque nous avons ajouté des ION. Rui et al. (2016) n'ont pas mesuré le peroxyde d'hydrogène mais le MDA et les enzymes liés au stress oxydatif. Ils ont suggéré que le stress oxydatif ne se produit pas à partir de l'ajout d'ions, et en effet, ils ont également trouvé une quantité réduite de MDA dans les feuilles, par rapport au fer chélaté, sur 10 mg kg ⁻¹ concentration. Dans les racines, ils ont constaté une réduction de la MDA à mesure qu'ils augmentaient la concentration d'ION. Ils ont également mesuré une quantité réduite d'activité de la superoxyde dismutase et de la peroxydase par rapport au fer chélaté, ce qui suggère que notre hypothèse selon laquelle les ION peuvent fonctionner comme des capteurs d'oxygène réactifs, in vivo, pourrait être juste. Le piégeage réactif de l'oxygène a en outre été démontré par notre réduction mesurée du peroxyde d'hydrogène dans les feuilles de Brassica napus . Ceci explique la résistance accrue à la sécheresse observée lors de l'ajout d'ions.

Conclusions

Nos expériences ont fourni des preuves du mécanisme des ION agissant comme des nanozymes in planta , révélant un couplage entre une diminution des teneurs en peroxyde d'hydrogène dans les feuilles de Brassica napus et l'introduction des ION. L'augmentation de la résistance à la sécheresse observée lors de l'ajout d'ions peut ainsi être liée à un soulagement du stress oxydatif.

Méthodes

Conditions expérimentales et conception

Brassica napus les graines, de la variété de colza de printemps Larissa (Scandinavian Seed AB, Lidköping, Suède), ont été stérilisées et mises à germer sur des plaques de gélose pendant 3 jours avant que des semis de tailles similaires ne soient transférés dans des pots avec du S-Soil stérilisé (Hasselfors garden, Örebro, Suède) . C'est un sol pour la croissance professionnelle des semis avec une faible quantité de tous les macro et micro nutriments, de la perlite pour l'aération, des acides humiques stimulant la croissance et un pH de 6. Les plantes ont été laissées s'établir dans les pots pendant 7 jours, irriguées avec de l'eau désionisée. l'eau. Avant le début des traitements, les plantes ont été réparties entre les plateaux, de sorte que la taille des plantes soit aussi uniforme que possible. À partir du septième jour, après transfert dans des pots, les plantes ont été irriguées avec une solution nutritive, une solution nutritive avec un supplément de FeCl₃ ou une solution nutritive avec différentes concentrations de γ-Fe₂ O₃ ION. Chaque pot a été irrigué avec 40 ml chaque jour. Les plantes ont été cultivées dans une chambre de croissance avec une lumière de 16 h (180 μE m ⁻² s ⁻¹ ) et une obscurité de 8 heures. La température a été réglée à 25°C pendant l'irradiation et à 22° pendant l'obscurité et l'humidité relative à 65%. Les plantes ont été cultivées dans des pots de 8 × 8 cm dans des plateaux contenant huit pots chacun. Chaque traitement comportait deux plateaux et 16 réplicats biologiques. Les plateaux ont été déplacés dans un ordre de rotation chaque jour pour compenser toute variation dans la chambre. Le traitement a duré 5 jours en ajoutant au total 200 ml de 0,5, 0,8, 1 ou 2 mg ml ⁻¹ , au total 100, 160, 200 ou 400 mg par plante, respectivement. Après les 5 jours d'ajout d'ION, tous les traitements ont été arrosés avec une solution nutritive (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1), pendant 5 jours supplémentaires avant que 4 jours de sécheresse ne commencent. Après 4 jours de sécheresse, des mesures de peroxyde d'hydrogène et de peroxydation lipidique ont été effectuées et les plantes ont été à nouveau arrosées avec la même solution nutritive pendant 3 jours pour étudier la récupération. L'expérience a été répliquée quatre fois.

Synthèse et caractérisation de nanoparticules

Les particules de maghémite ont été produites selon la méthode de [38] avec environ 13% poids d'yttrium (Y) et caractérisées par diffraction des rayons X (XRD), microscopie électronique à balayage (MEB), analyse de suivi de nanoparticules (NTA), spectroscopie infrarouge (FTIR), analyse thermogravimétrique (TGA) et microscopie à force atomique (AFM). Les images SEM ont été acquises avec un Hitachi TM1000, avec un spectromètre à rayons X à dispersion d'électrons (EDS) Oxford μDeX. La taille hydrodynamique a été mesurée par une analyse nanométrique (NTA) sur le Nanosight 300 (Fig. 11). Un Perkin-Elmer Spectrum 100 a été utilisé pour effectuer une spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) dans des pastilles de bromure de potassium (KBr). Pour l'analyse thermogravimétrique (TGA), un Perkin-Elmer Pyris 1 a été utilisé et pour la microscopie à force atomique (AFM), un Bruker FastScan (Fig. 12). Le XRD a été réalisé sur un diffractomètre polyvalent Bruker Smart ApexII avec source de molybdène; la taille des cristallites a été calculée avec l'équation de Sherrer en utilisant le plus grand pic à un angle de 2θ° 16 197 avec un demi-maximum de pleine largeur (FWHM) de 1,01358489355378 calculé par la fonction de recherche de pics du logiciel Origin (Fig. 13). Les ION séchés ont été mis en suspension dans une solution nutritive, avec 3,4 mg L ⁻¹ fer chélaté, le même utilisé comme témoin. Pour une liste complète de tous les nutriments, voir le fichier supplémentaire 1 :tableau S1.

Distribution hydrodynamique de la taille des particules dans l'eau, mesurée par NTA, de γ-Fe₂ O₃ synthétisé par synthèse sol-gel dirigée par l'yttrium. Les valeurs sont moyennées à partir de quatre mesures répétées, et la zone entre les lignes fines représente l'erreur moyenne

Nanoparticules de maghémite synthétisées à travers un sol-gel dirigé à l'yttrium, dispersées sur une plaquette de silicium et imagées avec l'AFM. La même image est représentée en 3D et 2D

Un diffractogramme de poudre des nanoparticules de maghémite produites. Les pics s'alignent avec les positions du maghémite standard de la base de données vues comme un point avec une ligne en goutte à la base de la figure. La taille des cristallites a été calculée à partir du plus grand pic à 16,197 2θ degrés d'angle

Mesures des caractéristiques végétales

Avant le début du traitement, la longueur de la feuille la plus longue, la première vraie feuille, sur chaque plante a été mesurée. Plus tard, après les 5 jours d'irrigation séquentielle avec des ION dans une solution nutritive ou une solution nutritive seule, la même feuille a été mesurée à nouveau. Les résultats sont indiqués en pourcentage d'augmentation. La chlorophylle des feuilles a été évaluée par des mesures SPAD avec le SPAD-mètre Minolta, avant pendant et après le traitement et ensuite après la sécheresse. Trois mesures, sur deux feuilles par plante, ont été moyennées pour chacun des 16 réplicats biologiques. Enfin, la biomasse aérienne de toutes les plantes a été pesée et placée dans du papier d'aluminium pour être séchée à 110 °C pendant 72 h.

Contenu en fer et mesures magnétiques

Après cinq jours de sécheresse, l'expérience a pris fin et tous les tissus végétaux au-dessus du sol ont été réduits en cendres à 450 °C pendant 24 h. Après homogénéisation des cendres, 10 mg ont été pesés par échantillon et dissous dans 3 ml d'acide chlorhydrique à 36 % sur un agitateur pendant une nuit. Ensuite, les échantillons ont été dilués avec 44,74 ml d'éthanol à 10 % dans de l'eau Milli-Q et ensuite mesurés pour le fer avec ICP-AES à 238,204 nm. Pour les mesures magnétiques, les mêmes cendres ont été placées dans un porte-échantillon et le poids exact de chaque échantillon a été pesé avec une balance de précision. Ensuite, l'échantillon a été refroidi à 2 K et un balayage du champ magnétique de 10 000 à 0 Oersted a été effectué sur un magnétomètre à dispositif d'interférence quantique supraconducteur (SQUID). Le moment magnétique dû au porte-échantillon a été soustrait du moment magnétique mesuré avant la normalisation avec le poids de fer dans l'échantillon.

Mesures de peroxyde d'hydrogène

Le peroxyde d'hydrogène dans les feuilles a été mesuré par la méthode eFOX rapportée par [39]. Les 16 plantes ont été regroupées en quatre répétitions biologiques de quatre plantes chacune. Cinquante milligrammes ont été prélevés sur la feuille la plus jeune et encore fraîche de chaque plante. Ensuite, 200 mg de matière foliaire ont été pulvérisés dans un mortier prérefroidi dans de l'azote liquide. À la poudre, nous avons ajouté 4 ml de tampon phosphate 100 mM (pH 6,9) et mortier la glace dans un liquide homogène. À partir de ce liquide homogène, nous avons transféré 1900 μl dans un tube Eppendorf de 2 ml et ajouté 20 μl de sulfate d'ammonium ferreux 25 mM (sel de Mohrs), 20 μl de 10 mM de sorbitol, 20 μl de 10 mM d'orange de xylénol, 20 μl de 99 % d'éthanol et 20 μl d'acide sulfurique 250 mM. Un spectre d'absorbance visible complet a été pris pour chaque échantillon, mais la différence entre 550 et 800 nm a été utilisée pour la quantification du peroxyde d'hydrogène. Une courbe d'étalonnage de 2 à 40 μM de peroxyde d'hydrogène a été réalisée avec R ² valeur de 0.9946.

Peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique a été mesurée selon la méthode de [40]. Les échantillons ont été récoltés de la même manière que pour les mesures de peroxyde d'hydrogène, sauf qu'ils ont été homogénéisés dans 4 ml 0,1 % w /v acide trichloracétique (TCA). L'absorbance a été mesurée à 532 nm et corrigée de la turbidité non spécifique en soustrayant l'absorbance à 600 nm. Le coefficient d'extinction de 155 mM cm ⁻¹ a été utilisé pour calculer la concentration de malondialdéhyde (MDA).

Analyse statistique

Toutes les statistiques ont été réalisées dans le logiciel Minitab 17. Toutes les données ont été soumises à une ANOVA à un facteur avec un test de Fisher pour le regroupement. t de l'étudiant un test a été effectué pour trouver des p spécifiques valeurs entre les groupes qui présentent des différences statistiquement significatives.