Un biocapteur d'ADN électrochimique hautement sensible à partir d'un nanocomposite acrylique-or pour la détermination du sexe du poisson Arowana

Contexte

Arowana asiatique (Formoss de scléropages ), un poisson d'eau douce, [1] est largement répandu dans les campagnes de la région de l'Asie du Sud-Est comme la Malaisie, Singapour, la Thaïlande, l'Indonésie, le Cambodge, le Vietnam, le Laos, le Myanmar et les Philippines. De plus, le poisson arowana se trouve également en Australie et en Nouvelle-Guinée [1,2,3,4]. Il est populairement connu sous le nom de poisson-dragon, langue osseuse asiatique, kelisa ou baju-rantai [5, 6]. Il survit encore en tant qu'espèce de poisson primitive de l'ère jurassique [7, 8]. Les Chinois et les Asiatiques le considéraient comme un symbole de chance et de bonheur, au même titre que de nombreuses autres cultures [6]. Généralement, l'arowana pèse environ 7 kg et mesure 1 m de long à l'âge adulte [9]. Ce poisson d'ornement possède des couleurs et une morphologie attrayantes et peut être identifié par ses caractéristiques physiques distinctives, telles qu'une taille corporelle relativement longue, une grande nageoire pectorale et les nageoires dorsale et anale sont positionnées loin en arrière sur le corps. Il existe trois variétés de couleurs principales, à savoir le doré, le rouge et le vert des poissons d'eau douce étroitement apparentés au sein des espèces asiatiques d'arowana. Il existe également plusieurs autres espèces distinctes dérivées de différentes parties de l'Asie du Sud-Est et sont régionales à de nombreux systèmes fluviaux [8].

En raison de sa grande popularité et de sa grande demande à des fins ornementales, l'arowana asiatique a été férocement chassée à des fins lucratives [6], et entraîne un déclin rapide de sa population. Compte tenu de sa forte demande dans l'industrie ornementale, de la surexploitation des populations naturelles et de la rareté des habitats naturels due aux modifications du cadre de vie, l'arowana asiatique est classée comme espèce menacée d'extinction depuis 1980 par la Convention sur le commerce international. dans les espèces de faune et de flore sauvages menacées d'extinction (CITES) et a récemment été inscrite sur la liste rouge de l'UICN 2006 [1, 3, 8, 10, 11]. Cependant, le commerce commercial de cette espèce menacée est interdit par la CITES, sauf dans certains pays, par exemple l'Indonésie, Singapour et la Malaisie. [2, 3, 12]. Il existe un certain nombre de cultivateurs CITES en Asie qui pratiquent activement l'élevage et le commerce du poisson arowana [2, 12]. Ce poisson d'eau douce asiatique se compose de souches isolées géographiquement et c'est le seul membre de l'espèce avec des variétés de couleurs différentes basées sur différentes répartitions géographiques dans les rivières d'Asie du Sud-Est. La distribution de l'espèce est maintenant beaucoup plus répandue, et s'étend jusqu'au Nil en Afrique, au fleuve Amazone en Amérique du Sud, en Australie et en Nouvelle-Guinée [1, 4, 8].

Parmi les différentes couleurs de l'arowana asiatique, les poissons arowana rouges et dorés sont les animaux de compagnie ornementaux les plus chers et les plus populaires dans l'industrie des écloseries par rapport aux variétés de couleurs noires, vertes, argentées et autres [1, 5, 10, 13]. Le phénomène de vol d'œufs de l'arowana asiatique est atypique par rapport aux autres espèces de poissons. En général, les poissons arowana deviennent matures à l'âge de 3-4 ans, et ils ne pondent que quelques œufs (30-100) [14, 15] de très grande taille (environ 1 cm de diamètre) [16]. Fait intéressant, les œufs et les larves fécondés sont ensuite protégés et cultivés dans la bouche des poissons arowana mâles, et ils font preuve de soins parentaux élevés. Il est difficile d'identifier le sexe sur la base de l'observation visuelle du bébé arowana car il n'y a pas d'organe phénotypique distinctif du dimorphisme sexuel [14, 15]. Un seul des parents (présumé être le mâle) peut être identifié car la progéniture est récoltée dans sa bouche. L'autre parent ne peut être identifié parmi un certain nombre de parents potentiels [16].

Habituellement, les amateurs gardent le bébé poisson arowana à des fins ornementales dans l'aquarium ainsi que pour la culture dans la pisciculture. Cependant, tous les types de poissons arowana juvéniles sont vendus au même prix, en raison du manque de technologie d'assistance pour la différenciation des genres et des variétés de couleurs. Jusqu'à présent, il n'y a pas de méthode établie publiée pour identifier le sexe et la couleur des poissons arowana à leur stade juvénile. Au lieu de cela, des centaines d'études ont été menées à l'aide d'analyses d'ADN basées sur la structure génétique et la biographie des poissons arowana dans le but d'identifier le sexe et la couleur à leur plus jeune âge. La méthode traditionnelle basée sur les estimations de la taille du corps et de la cavité buccale ne peut être effectuée qu'à environ 3 mois d'âge du bébé arowana pour les identifications de genre et de couleur [17]. Cependant, cette méthode d'examen visuel classique prend du temps et donne souvent des résultats inexacts. D'autre part, les méthodes standard largement utilisées basées sur le séquençage de l'ADN, c'est-à-dire la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et l'électrophorèse sur gel, demandent du travail, du temps et des ressources. Un algorithme alternatif de méthode de résolution de problèmes inventifs (ARIZ) a été précédemment utilisé pour la détection de la détection du genre arowana [18]. ARIZ est un outil alternatif pour la détection du genre, contenant neuf parties différentes et un total de 40 étapes complexes. Cela demande un temps d'apprentissage et de pratique très long et nécessite un personnel hautement expérimenté pour fonctionner. Par exemple, l'application d'ARIZ dans divers systèmes d'ingénierie a été utilisée, mais la plupart des cas ne couvraient pas toutes les exigences et tous les processus d'ARIZ.

Dans cette recherche, des microsphères de polymère acrylique modifiées avec des groupes fonctionnels succinimide via des fragments N-acryloxysuccinimide (NAS) ont été utilisées comme matrice pour l'immobilisation de la sonde d'ADN. Comme indiqué précédemment par Chen et Chiu 2000 et Chaix et al. 2003 [19, 20], la fonction succinimide peut réagir avec des fonctions amine pour former une liaison covalente. L'incorporation de la fonctionnalité NAS dans des microsphères acryliques pour l'application de microbiocapteurs d'ADN offre les avantages d'une méthode de préparation simple où les sphères peuvent être synthétisées et fonctionnalisées via une procédure en une étape utilisant la photopolymérisation en une courte durée (plusieurs minutes). De plus, les microsphères ont l'avantage d'être de petite taille et offrent une grande surface pour l'immobilisation des sondes d'ADN, réduisant ainsi la barrière à la diffusion pour les réactifs et les produits. Cela permet d'améliorer les performances du biocapteur en termes de temps de réponse plus courts et de plage de réponse linéaire plus large, ce qui sera démontré dans les travaux rapportés ici.

Dans cette étude, une méthode de biocapteur d'ADN électrochimique, qui est très sensible, simple, facile à fabriquer et à faible coût, est proposée pour la détermination du sexe des poissons arowana juvéniles avec une grande précision. Le biocapteur d'ADN a été construit à partir d'une électrode sérigraphiée en carbone (SPE) modifiée avec des nanoparticules d'or colloïdal (AuNPs) et des microsphères de polyacrylate fonctionnalisées avec un groupe fonctionnel NAS. Les AuNP ont été immobilisées sur la surface de carbone SPE via une interaction électrostatistique et ont joué un rôle important dans l'amélioration de la conductivité de l'électrode et la facilitation du transfert d'électrons, tandis que les microsphères acryliques (AcMP) ont été directement déposées sur la SPE modifiée par AuNP via adsorption physique. La sonde d'ADN aminé d'arowana a ensuite été attachée de manière covalente au composite AcMP-AuNP immobilisé au niveau du groupe succinimide exposé des AcMP. L'hybridation sonde-cible a été détectée avec un marqueur redox à l'anthraquinone via une voltampérométrie différentielle (DPV). L'incorporation d'AcMP de petite taille et uniforme a permis de conserver une grande capacité de chargement d'ADN et d'améliorer la sensibilité et la limite de détection du biocapteur électrochimique d'ADN arowana.

Méthodes

Appareils et électrodes

Toutes les mesures électrochimiques ont été effectuées avec DPV à l'aide du potentiostat/galvanostat Autolab PGSTAT 12 (Metrohm) à un potentiel de pas de 0,02 V dans la fenêtre de potentiel de -1,0 V à -0,1 V. SPE de Scrint Technology Co Malaysia modifié avec AcMPs et AuNPs a été utilisé comme l'électrode de travail. Une électrode de platine (Pt) en forme de tige et une électrode Ag/AgCl remplie de 3,0 M de solution interne de KCl ont été utilisées comme électrodes auxiliaires et de référence, respectivement. Le bain sonicateur Elma S30H a été utilisé pour préparer des solutions homogènes.

Produits chimiques

La 2-2-diméthoxy-2-phénylacétophénone (DMPP) a été achetée auprès de Fluka. Le diacrylate de 1,6-hexanediol (HDDA), l'acrylate de n-butyle (nBA) et le chlorure d'Au (III) trihydraté ont été fournis par Sigma-Aldrich. Les AuNPs colloïdales ont été synthétisées selon la méthode rapportée par Grabar et al. (1995). Le dodécyl sulfate de sodium (SDS) et le NaCl ont été obtenus auprès de Systerm. Le NAS et le sel de sodium monohydraté de l'acide anthraquinone-2-sulfonique (AQMS) ont été achetés auprès d'Acros. De l'eau Milli-Q (18 mΩ) a été utilisée pour préparer toutes les solutions chimiques et biologiques. La solution mère de sonde d'ADN a été diluée avec 0,05 M de tampon phosphate K (pH 7,0) tandis que des solutions d'ADN complémentaire (ADNc) et non complémentaire (ADNc) ont été préparées avec 0,05 M de tampon phosphate Na à pH 7,0 contenant 1,0 mM de AQMS. Le tampon K-phosphate facilite l'immobilisation maximale de la sonde ADN sur le matériau acrylique fonctionnalisé au succinimide, tandis que le tampon Na-phosphate fournit une condition optimale pour la réaction d'hybridation de l'ADN [21, 22].

Synthèse de microsphères acryliques

Les AcMP ont été préparés selon les méthodes décrites précédemment avec de légères modifications [22]. En bref, un mélange de 450 L de HDDA, 0,01 g de SDS, 0,1 g de DMPP, 7 ml de monomère nBA et 6 mg de NAS a été dissous dans 15 ml d'eau Milli-Q et soniqué à température ambiante (25 °C ) pendant 10 minutes. Après cela, la solution d'émulsion a été photodurcie à la lumière UV pendant 600 s sous un flux continu de N₂ gaz. Les microsphères de poly(nBA-NAS) résultantes ont ensuite été recueillies par centrifugation à 4000 tr/min pendant 30 min suivies d'un lavage dans du tampon K-phosphate (0,05 M, pH 7,0) à trois reprises et laissées à sécher à température ambiante.

Fabrication d'un biocapteur d'ADN à l'aide de microsphères acryliques

Avant la modification de surface, la SPE de carbone a été rincée soigneusement avec de l'eau DI, enduite de gouttes de microsphères de polymère acrylique à 3 mg/mL et laissée à sécher à l'air dans des conditions ambiantes, suivie d'une coulée de gouttes avec 5 mg/mL de AuNPs colloïdaux. La caractéristique électrochimique de la SPE de carbone avant et après modification avec les AcMPs et les AuNPs a été examinée avec la méthode CV. La figure 1 dépeint la méthode, qui se compose de la fabrication en 3 étapes d'un biocapteur d'ADN électrochimique et de la détection d'ADNc d'arowana en 1 étape. Environ 10 L d'AuNPs colloïdales (1 mg/300 μL) ont d'abord été déposés sur un SPE de carbone et séchés à l'air à 25 °C. Comme les AcMP (1 mg) ont été facilement mis en suspension dans de l'éthanol (100 L) pour former une dispersion stable, 10 L de suspension d'AcMP ont été déposés goutte à goutte sur la SPE modifiée par AuNP. Le SPE de carbone modifié par AcMP-AuNP a ensuite été plongé dans 300 L de solution de sonde d'ADN arowana 5 M pendant 6 h pour que le processus d'immobilisation de l'ADN ait lieu et lavé soigneusement avec du tampon K-phosphate (0,05 M, pH 7,0) pendant trois fois à retirer la sonde de capture non liée. La sonde d'ADN immobilisée a ensuite été immergée dans 300 L de solution d'ADN cible contenant 2 M de NaCl et 1 mM d'AQMS pour permettre aux réactions d'hybridation et d'intercalation de l'ADN de se produire en une heure, suivi d'un rinçage séquentiel avec de l'eau Milli-Q et du Na-phosphate. tampon (0,05 M, pH 7,0) pour l'élimination des fragments d'ADN non hybridés et une liaison spécifique du marqueur électrochimique AQMS. Toutes les mesures DPV ont été effectuées dans 4,5 mL de 0,05 M de tampon K-phosphate à pH 7,0 et à température ambiante.

La procédure de fabrication du biocapteur électrochimique d'ADN d'arowana basé sur une électrode modifiée par AcMP-AuNP

Optimisation du biocapteur électrochimique d'ADN d'Arowana

Les électrodes d'ADN modifiées avec les composites AcMP, AuNP et AcMP-AuNP respectifs ont été utilisées dans les tests d'ADNc (5 M) et d'ADNc (5 M) avec la méthode électroanalytique DPV en présence de 1 mM d'AQMS et 2 M de NaCl à la vitesse de balayage de 0,5 V/s par rapport à l'électrode de référence Ag/AgCl. La durée d'immobilisation de la sonde ADN a été déterminée en trempant séparément neuf unités de SPE modifiées par AcMP-AuNP dans 300 L de solution de sonde ADN arowana 5 M pendant 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12 et 18 h, avant réaction avec 5 µM d'ADNc dans du tampon d'hybridation d'ADN (0,05 M de tampon Na-phosphate à pH 7,0) contenant 1 mM d'intercalant redox antraquinone et 2 M de NaCl. Le temps d'hybridation de l'ADN a été étudié en immergeant l'électrode à ADN dans 300 L de solution d'ADNc à 5 M en présence de 2 M de NaCl et 1 mM d'AQMS pendant 10 à 100 min. L'effet de la température sur la durée d'hybridation de l'ADN a été réalisé en mesurant la réponse du biocapteur d'ADN arowana à 4, 25, 40 et 50 °C pendant une période expérimentale de 5 à 90 min dans le tampon de mesure en utilisant la technique DPV. Pour l'étude de l'effet du pH, le biocapteur d'ADN arowana a été plongé dans 5 M de solution d'ADNc préparée à partir de 0,05 M de tampon Na-phosphate conditionné avec 2 M de NaCl et 1 mM d'AQMS entre pH 5,5 et pH 8,0 suivi d'une mesure DPV. L'effet de divers ions chargés positivement (c'est-à-dire Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , et Fe ³⁺ ions) sur la réponse électrochimique du biocapteur d'ADN d'arowana a été réalisée en ajoutant du CaCl₂ , NaCl, KCl et FeCl₃ dans 0,05 M de tampon Na-phosphate (pH 7,0) avant la réaction d'hybridation de l'ADN et la mesure DPV. La force ionique du tampon d'hybridation a été optimisée en faisant varier les concentrations de tampon Na-phosphate et de NaCl de 0,002-0,1000 M à 1,52-5,50 M, respectivement. La courbe d'étalonnage linéaire du biocapteur d'ADN arowana a ensuite été établie par la mesure quantitative d'une série de concentrations d'ADNc de 1,0 × 10 ⁻¹⁸ à 2,0 × 10 ⁻² M via la méthode DPV. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Extraction d'ADN et analyse d'ADN d'Arowana

Au total, 15 échantillons de tissus de poisson arowana ont été aimablement fournis par l'Institut de recherche sur les pêches (FRI), Département des pêches de Malaisie. Tous les échantillons de tissus de poissons ont été conservés dans de l'éthanol à 70 % dans un réfrigérateur à 4 °C et envoyés au laboratoire. Les échantillons de tissus de poisson ont été lavés avec de l'eau Milli-Q et coupés en petits morceaux et séchés dans des conditions ambiantes avant d'être conservés au congélateur à -20 °C. L'ADN d'Arowana de chaque échantillon de tissu (35 à 40 mg chacun) a ensuite été extrait séparément à l'aide du kit de purification QIAquick PCR (Manchester, Royaume-Uni) selon le protocole du fabricant et conservé à -20 °C lorsqu'il n'est pas utilisé. L'amplification par PCR du fragment d'ADN génomique a ensuite été réalisée en utilisant un thermocycleur PCR Bio-Rad (PTC-100, Hercules, USA). Les fragments d'ADN du produit PCR ont ensuite été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5 %. Les extraits d'ADN d'arowana ont également été analysés par le biocapteur électrochimique d'ADN pour déterminer le sexe. Les réponses DPV obtenues ont été comparées au courant de base obtenu sans la présence d'ADN d'arowana. Un t test a été appliqué pour déterminer la différence significative entre la réponse du biocapteur d'ADN et le courant de base à 4 degrés de liberté et un niveau de confiance de 95 %. La réponse du biocapteur d'ADN obtenue à un courant significativement plus élevé que le courant de base a indiqué qu'un poisson arowana mâle a été détecté et vice versa.

Résultats et discussion

Les AcMP telles que synthétisées ont été observées (Fig. 2) au microscope électronique à balayage (MEB, LEO 1450VP). La distribution granulométrique des mélanges acryliques préparés à partir de la photopolymérisation est illustrée à la figure 3.

Image SEM de microsphères de polymère acrylique

Distribution de taille de microsphères acryliques préparées à partir de photopolymérisation

L'effet des différentes vitesses de balayage du SPE de carbone contenant des AcMPs-AuNPs en présence de K₃ Fe(CN)₆ ont montré que les courants de crête d'oxydation et de réduction augmentaient avec l'augmentation de la vitesse de balayage de 0,05 à 0,30 V/s (Fig. 4). Ainsi, le processus de transfert d'électrons à la surface de l'électrode devrait être réversible [22,23,24,25].

Voltammogrammes cycliques de 1,0 mM K₃ Fe(CN)₆ dans un tampon Na-phosphate 0,05 M de pH 7,0 avec différentes vitesses de balayage (0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25 et 0,30 V/s) pour un SPE de carbone modifié contenant du matériau AcMP-AuNP à la surface de l'électrode

Basé sur l'équation Randles-Sevcik,

une bonne linéarité a été trouvée entre le courant de crête redox et la racine carrée de la vitesse de balayage avec un coefficient de corrélation (R ² ) de 0,996 dans la plage de 50 à 300 mV/s, comme le montre l'éq. 2 et Fig. 5a.

Tracé des courants de crête d'oxydation (ip/μA) en fonction de la racine carrée de la vitesse de balayage ((mV/s) ^1/2 ) (a ) et graphique du log des courants de pic d'oxydation (ip/μA) en fonction du log des taux de balayage (log (mV/s)) (b )

Cela indique que la réaction à la surface de l'électrode modifiée était une réaction contrôlée par diffusion [22,23,24,25].

De plus, sur la base de la figure 5b, lorsque la valeur logarithmique du courant d'oxydation a été tracée par rapport à la valeur logarithmique de la vitesse de balayage, une ligne linéaire a été obtenue avec une pente de 0,65, qui était proche de la valeur théorique de 0,50 pour le processus contrôlé par diffusion. . Par conséquent, l'étude a démontré que la réaction à la surface de la SPE modifiée est principalement contrôlée par la diffusion.

Pour le cas idéal d'un processus de transfert rapide, réversible et à un électron, ΔEp =0,059 V à 298 K. Cependant, les décalages de potentiel de crête qui ont augmenté avec la vitesse de balayage ont démontré des séparations de potentiel de crête plus importantes de plus de 0,059 V (Fig 4 ). Cela implique que le processus de transfert d'électrons à la surface de l'électrode est lent [22, 25, 26], probablement en raison de la résistance créée par la présence de matériau AcMP recouvrant la surface de l'électrode.

La figure 6 montre la réponse DPV du biocapteur d'ADN d'arowana basé sur des SPE de carbone modifiés AcMP, AuNP et AcMP-AuNP. La différence significative de courant DPV observée entre l'expérience (a) et (c) révèle que les sondes d'ADN d'arowana ont été greffées avec succès sur les AcMP via de fortes liaisons covalentes entre le groupe fonctionnel succinimide de l'AcMP et le groupe fonctionnel amine de la sonde d'ADN aminé, et le La sonde d'ADN d'arowana n'était sélective que pour son ADNc [19, 20]. Les AuNPs ont joué un rôle pour aider la conductivité électronique de l'AQMS intercalé à la surface de l'électrode fabriquée. Sans l'inclusion d'AuNPs dans le matériau composite (f), seules les nanoparticules d'or (e) et les nanoparticules d'or et le composite AcMP (d), seule une très faible réponse actuelle peut être observée. Les faibles courants DPV acquis dans l'expérience (b) étaient dus à l'absence de réaction d'hybridation de l'ADN avec l'ADNc, ce qui indique également l'absence d'absorption spécifique de l'indicateur redox AQMS sur la surface de l'électrode [27, 28].

Le signal DPV de l'électrode d'ADN à base d'AcMP-AuNP lors de l'hybridation avec l'ADNc (a ) et ADN non complémentaire (b ), la réponse DPV des AcMP (f ) et SPE modifié par AuNP (e ), et la SPE modifiée composite AcMP-AuNP ainsi que la réponse du biocapteur d'ADN basé sur la sonde SPE ADN modifiée composite AcMP-AuNP (c ) avant réaction avec l'ADNc en présence d'AQMS 1 mM à la vitesse de balayage de 0,5 V/s par rapport à l'électrode de référence Ag/AgCl

Pour la durée d'immobilisation de la sonde ADN, la figure 7a montre que la réponse du biocapteur ADN a lentement augmenté au cours des 1 à 3 premières heures d'immobilisation de la sonde ADN et l'augmentation brutale de la réponse du biocapteur ADN peut être observée entre 3 et 6 h de durée d'immobilisation de la sonde ADN . Cela était dû au fait qu'un temps d'immobilisation plus long était nécessaire pour favoriser la fixation d'une plus grande quantité de sondes d'ADN sur l'électrode modifiée par AcMP-AuNP. Lors d'une prolongation supplémentaire du temps d'immobilisation des sondes d'ADN, aucun changement notable dans la réponse du biocapteur d'ADN n'a été perçu car les sites de liaison des AcMP immobilisés se sont complètement liés aux sondes d'ADN. La réponse du biocapteur d'ADN d'arowana dépend également du temps d'hybridation de l'ADN. Le profil de réponse du biocapteur illustré sur la figure 7b montre une tendance croissante de la réponse du courant DPV avec une durée d'hybridation de l'ADN de 10 à 60 min, après quoi la réponse actuelle devient presque un plateau. A ce stade, les sondes d'ADN immobilisées sur l'électrode se sont entièrement hybridées avec l'ADNc [29].

Effets du temps d'immobilisation de la sonde ADN (a ) et le temps d'hybridation de l'ADN (b ) sur la réponse du biocapteur d'ADN d'arowana à l'aide d'une sonde d'ADN de 5 M et d'ADNc en présence d'AQMS 1 mM à une force ionique de 2 M

Il est également remarqué que le temps d'hybridation de l'ADN du biocapteur d'ADN arowana fabriqué dépendait de la température, et comme un grand avantage, nous avons obtenu une réponse de courant maximale à température ambiante en 30 min (Fig. 8). À basse température, c'est-à-dire 4 °C, une longue période a été nécessaire pour une réaction d'hybridation d'ADN complète car la température froide a ralenti la vitesse de réaction d'hybridation d'ADN. Un temps d'hybridation d'ADN plus rapide a pu être obtenu à une température supérieure à 25 °C, attribué à la vitesse de réaction d'hybridation d'ADN plus élevée survenue entre la sonde d'ADN immobilisée et l'ADNc pour former l'ADN duplex à des températures élevées. Cependant, une température élevée pourrait déformer de façon permanente la structure en double hélice de l'ADN, et la régénération de la molécule d'ADN n'est pas possible même après le réajustement de la température à la valeur optimale [28, 30].

Effet de la température sur le temps d'hybridation de l'ADN du biocapteur d'ADN arowana. La réponse DPV a été mesurée dans un tampon K-phosphate 0,05 M (pH 7,0) à 4, 25, 40 et 50 °C pendant une période expérimentale de 5 à 90 min

Dans le cadre de l'optimisation de la réponse du biocapteur d'ADN arowana, l'effet du pH de la solution sur la réaction d'hybridation de l'ADN a été étudié. Le biocapteur d'ADN a montré un changement de courant négligeable entre pH 5,5 et pH 6,5 en raison de la protonation du squelette phosphodiester de l'ADN, qui a réduit la solubilité des molécules d'ADN dans un environnement aqueux (Fig. 9). Augmentation supplémentaire du pH du milieu d'hybridation d'ADN, la réponse du biocapteur d'ADN d'arowana a augmenté brusquement à pH 7,0, après quoi une forte baisse du courant DPV a été perceptible lorsque l'environnement de pH est passé à un état basique en raison de la dénaturation irréversible de l'ADN dans le pH plus élevé. gamme [23, 24, 31,32,33]. Étant donné que la réponse DPV maximale a été acquise à un pH neutre, l'évaluation électrochimique suivante de la réponse du biocapteur d'ADN d'arowana a été maintenue à pH 7,0 en utilisant 0,05 M de tampon Na-phosphate.

La réponse DPV du biocapteur d'ADN d'arowana basé sur un SPE de carbone modifié composite AcMP-AuNP entre pH 5,5 et pH 8,0. La mesure DPV a été réalisée dans un tampon K-phosphate 0,05 M (pH 7,0) à 25 °C et une vitesse de balayage de 0,5 V/s par rapport à l'électrode de référence Ag/AgCl

L'effet de la valence des cations vis-à-vis de la réaction d'hybridation d'ADN a été réalisé en utilisant différents cations de sels, par ex. Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , et Fe ³⁺ ions dans le tampon d'hybridation d'ADN. Les ions chargés positivement pourraient interagir électrostatiquement avec la chaîne phosphodiester chargée négativement de la molécule d'ADN pour surmonter l'encombrement stérique et la répulsion électrostatique entre la sonde ADN immobilisée et l'ADN cible, facilitant ainsi le processus d'hybridation de l'ADN [34]. La figure 10 démontre que la réaction d'hybridation d'ADN était favorable en présence de cations de l'ordre de Na ⁺ > K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ . La présence de Ca ²⁺ et Fe ³⁺ On a remarqué que les ions provoquent une diminution remarquable de la réponse actuelle du biocapteur d'ADN d'arowana par rapport à Na ⁺ et K ⁺ ions. Ces phénomènes ont été attribués à la formation de sels de phosphate de calcium et de phosphate de fer (III) peu solubles dans le tampon d'hybridation d'ADN [22], qui ont réduit la teneur ionique de la solution et provoqué une répulsion électrostatique élevée entre les molécules d'ADN. En conséquence, le taux d'hybridation de l'ADN a diminué et a conduit à une mauvaise performance du biocapteur. La réponse la plus élevée du biocapteur d'ADN a été obtenue lorsque Na ⁺ ions ont été ajoutés au tampon phosphate d'hybridation d'ADN en raison de leur petite taille et de leur forte affinité envers la liaison ADN phosphodieter.

L'effet du Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , et Fe ³⁺ ions dans le tampon d'hybridation d'ADN (tampon Na-phosphate 0,05 M à pH 7,0) sur la réponse DPV du biocapteur d'ADN arowana

La concentration de NaCl et de tampon Na-phosphate (pH 7,0) doit également être optimisée pour fournir une force ionique optimale pour le tampon d'hybridation. La figure 11b indique qu'une force ionique inférieure et supérieure à 2 M n'a pas pu surmonter la répulsion électrostatique élevée entre les brins d'ADN. Environ 0,05 M de tampon Na-phosphate (Fig. 11a) et 2 M de NaCl se sont avérés fournir la force ionique optimale pour le dosage de l'ADN cible d'arowana avec des performances de biocapteur maximales. Des conditions optimales de tampon d'hybridation en termes de pH, de capacité tampon et de force ionique permettraient à la réaction d'hybridation de l'ADN de se produire au minimum d'encombrement stérique [30].

Les tendances de réponse du biocapteur d'ADN d'arowana en tant que a Concentration du tampon Na-phosphate et b la force ionique du tampon d'hybridation variait de 0,002 à 0,100 M et de 1,52 à 5,50 M, respectivement

Le biocapteur d'ADN optimisé a ensuite été utilisé pour la détection d'une série de concentrations d'ADNc d'arowana entre 1,0 × 10 ⁻¹² et 1,0 × 10 ⁻² M. Le biocapteur d'ADN a montré une large plage de réponse linéaire de 1,0 × 10 ⁻¹⁸ à 1,0 × 10 ⁻⁸ M (R ² =0.99). La limite de détection (LOD) obtenue à 1,0 × 10 ⁻¹⁸ M a été calculé sur la base de trois fois l'écart type de la réponse du biocapteur à la courbe de réponse approchant le LOD divisé par la pente d'étalonnage linéaire. The homogeneous AcMP particles size within micrometre range exhibited a significant influence on the DNA biosensor sensitivity and reproducibility (RSD =5.6%). The large binding surface area of the immobilised NAS-functionalised AcMPs permitted a large number of DNA molecules to bind covalently to the electrode surface, thereby increasing the DNA biosensor analytical performance with respect to dynamic linear range and detection limit of the arowana DNA biosensor (Fig. 12).

The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10 ⁻¹⁸ to 1.0 × 10 ⁻² μM cDNA at pH 7.0

Determination of Arowana Fish Gender with DNA Biosensor

The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.

Conclusions

The electrochemical DNA biosensor developed in this study demonstrated good sensitivity, wide linear response ranges, and low detection limit in the determination of arowana target DNA. In addition, the DNA biosensor showed a good response towards arowana cDNA, which implies that the electrochemical DNA biosensor could be used to successfully detect the arowana DNA segments. The developed arowana DNA biosensor can be further redesigned into a point-of-use device prototype that offers a great potential for the application in the fish culture for early identification of arowana gender and colour, which is economically advantageous in fishery and aquaculture sectors.