Nanoparticules FePO4 biocompatibles :administration de médicaments, stabilisation de l'ARN et activité fonctionnelle

Introduction

Parmi diverses nanoparticules inorganiques telles que l'or, la silice et les points quantiques, les nanoparticules à base de fer (Fe-NP) sont largement explorées pour des applications biomédicales telles que les agents de contraste, les véhicules d'administration de médicaments et les thérapies thermiques [1,2,3]. En raison de la propriété magnétique, de la bio-adaptabilité élevée et du métabolisme endogène connu du fer, les Fe-NP sont des candidats souhaitables pour les applications biomédicales. En tant que tels, les Fe-NP constituent la majorité de la nanomédecine inorganique approuvée par la FDA [1, 2]. Ceux-ci incluent INFeD, DexFerrum, Ferrlecit, Venofer, Feraheme et Injectafer qui sont disponibles dans le commerce pour leur application dans l'anémie ferriprive et la carence en fer dans la maladie rénale chronique [1]. De même, l'administration intraveineuse du chélate de gluconate de fer est une intervention bien tolérée pour l'anémie [4]. L'anémie est l'une des carences nutritionnelles les plus répandues dans le monde et les nanoparticules à base de Fe comme FePO₄ et FeSO₄ a été utilisé dans l'enrichissement des aliments pour prévenir l'anémie. L'enrichissement des aliments est le processus consistant à ajouter des micronutriments à l'aliment dans le but de surmonter la carence nutritionnelle d'une population [5]. FePO₄ Les NP présentent un intérêt particulier dans l'enrichissement des aliments en raison de leur biocompatibilité, de leur biodisponibilité élevée et de leurs performances sensorielles supérieures qui ne provoquent pas d'effets organoleptiques indésirables [6,7,8,9]. Perfecto et al. ont démontré le FePO₄ L'internalisation des NP dans les cellules intestinales humaines se produit principalement par le biais du transporteur de métaux divalents-1 (DMT-1) et peut donc être facilement absorbée [9, 10]. Feridex® et Revosit® à base de fer sont des agents de contraste d'imagerie par résonance magnétique (IRM) largement utilisés pour l'IRM à contraste amélioré [11,12,13,14,15,16]. À la lumière de ces rapports exceptionnels, FePO₄ Les NP se présentent comme un bon véhicule de livraison. Ici, nous avons exploré FePO₄ comme véhicule d'administration de médicament en chargeant un médicament anticancéreux, la doxorubicine (DOX). Ion ferrique (Fe ³⁺ ) peut former un complexe avec la molécule DOX facilitée par l'interaction électrostatique entre Fe déficient en électrons dans FePO₄ et un groupe -OH riche en électrons dans le DOX pour former du FePO₄ chargé de DOX NP :FePO₄ -NPs DOX. Nous avons évalué les propriétés physico-chimiques du FePO₄ et FePO₄ -DOX NPs et évalué leur profil de biocompatibilité et de cytotoxicité, respectivement, dans l'ostéosarcome de souris K7M2 et la lignée cellulaire de fibroblastes NIH/3T3.

Parallèlement à cela, la nanoparticule inorganique s'est révélée prometteuse dans la stabilisation et l'administration des acides nucléiques [17,18,19]. À cet égard, les nanoparticules d'or ont été largement étudiées en raison de leur capacité à immobiliser les oligonucléotides à leur surface, ce qui empêche l'agrégation et la dégradation moléculaires [17, 20]. Cependant, l'or n'est pas un élément endogène et peut ainsi limiter son application translationnelle. Ici, des nanoparticules à base de Fe comme FePO₄ Les nanoparticules peuvent être d'un intérêt primordial pour l'étude de la stabilisation de l'ARN en raison de leur nature endogène et de leur profil de biocompatibilité établi. Il existe deux mécanismes proposés d'interaction de l'acide nucléique (ARN/ADN) avec les Fe-NPs pour la stabilisation :(1) la formation de liaisons hydrogène et l'interaction électrostatique entre le groupe phosphate du squelette de l'acide nucléique et les Fe-NPs entraînant une adsorption des nucléiques. l'acide dans les Fe-NPs, et (2) l'acide nucléique peut s'adsorber à la surface des Fe-NPs via une interaction de paires de bases de nucléotides [19, 21, 22]. Une étude a montré le potentiel des nanoparticules de phosphate de calcium pour la stabilisation et l'administration de vaccins à ADN [23]. À cet égard, nous avons exploré ici la stabilisation de l'ARN et l'activité fonctionnelle d'une autre nanoparticule à base de phosphate, FePO₄ , pour étudier le potentiel multifonctionnel de FePO₄ à base de nanoparticules, dans la livraison et la stabilisation de la cargaison.

Avec l'approbation rapide du vaccin à ARNm contre COVID19, les nanoparticules de vaccin à ARNm sont d'un grand intérêt, l'ARN étant sujet à une hydrolyse rapide et à une perte d'expression fonctionnelle, il incombe à la nanoparticule d'améliorer ces caractéristiques critiques. Ici, nous montrons FePO₄ Les NP stabilisent l'ARN et soutiennent la traduction fonctionnelle de l'ARNm. Compte tenu de ces excellentes caractéristiques, FePO₄ Les NP peuvent mériter d'être prises en considération pour l'enrichissement des aliments, l'administration de médicaments et d'ARN, ouvrant ainsi la voie à des applications biomédicales passionnantes.

Résultats et discussion

FePO₄ Synthèse, caractérisation et analyse de biocompatibilité des NPs

Une simple réaction chimique en une étape entre (NH₄ )₃ Bon de commande₄ et Fe(NO₃ )₃ donne FePO₄ sous forme de précipité qui est dispersé dans un tensioactif lipide-PEG biocompatible qui aide à stabiliser FePO₄ nanoparticules et empêcher l'agrégation. FePO₄ Les NP ont montré une taille hydrodynamique de 175 ± 5 nm avec un indice de polydispersité (PDI) de 0,150 ± 0,01 suggérant une bonne homogénéité des particules et une distribution granulométrique étroite. L'analyse du potentiel zêta a montré une charge de surface négative de FePO₄ NPs avec − 19,1 ± 8 mV de potentiel zêta. La charge de surface négative aide en outre à stabiliser les particules dans les colloïdes, empêchant ainsi l'opsonisation des protéines, un mécanisme qui empêche le ciblage cellulaire et modifie la pharmacocinétique [24,25,26]. FePO₄ a en outre été caractérisé par le FTIR. La figure 1c montre la caractéristique spectrale de FePO₄ nanoparticules et leur précurseur—Fe(NO₃ )₃ et (NH₄ )₃ Bon de commande₄ . FePO₄ les spectres montrent un pic net distinct sur 1030 cm ⁻¹ qui peut être attribué à la bande d'étirement P–O, un petit pic à 520 cm ⁻¹ correspond à la flexion antisymétrique O–P–O, et une large gamme de 3000 à3500 cm ⁻¹ représente les vibrations de flexion et d'étirement de l'eau des molécules d'eau adsorbées [27, 28]. Le FePO₄ les spectres ont montré la présence de PO₄ ³⁻ groupe et sont similaires au pic FTIR rapporté par d'autres études confirmant ainsi la formation de FePO₄ nanoparticules [27,28,29]. Fe(NON₃ )₃ les spectres ont montré des pics caractéristiques pour les bandes d'étirement N–O à 1326 et 813 cm ⁻¹ [30]. Le pic à 1625 peut être attribué aux vibrations de flexion -OH et à un large pic d'environ 3000 cm ⁻¹ peut être attribuée aux vibrations de flexion et d'étirement de l'eau [30]. De même, (NH₄ )₃ Bon de commande₄ a montré des pics caractéristiques pour le groupe ammonium autour de 1500 cm ⁻¹ et groupe phosphate environ 1000 cm ⁻¹ [31]. L'absence de pics de nitrate et d'ammonium dans FePO₄ les nanoparticules suggèrent que le produit est exempt de sous-produits possibles et confirme la pureté de la synthèse.

Caractérisation et biocompatibilité de FePO₄ nanoparticules. un Distribution granulométrique hydrodynamique de FePO₄ IP, b mesure du potentiel zêta de FePO₄ NPs montrant la charge de surface, c FTIR de FePO₄ NPs et son précurseur-Fe(NO₃ )₃ et (NH₄ )₃ Bon de commande₄ , et d biocompatibilité de FePO₄ NPs sur l'ostéosarcome de souris K7M2 et la lignée cellulaire de fibroblastes de souris NIH/3T3. Les NP ont été traitées à différentes concentrations pendant 48 h (a, b les données représentent la moyenne  ± s.d.; n = 3 répétitions. d représente la moyenne  ± s.d., n = 6 répétitions).

Avec l'assurance d'une synthèse réussie, d'une pureté, d'une bonne homogénéité de taille et d'une charge de surface stable de FePO₄ NPs, nous avons ensuite analysé la biocompatibilité de FePO₄ NPs. À cette fin, nous avons utilisé des cellules cancéreuses et non cancéreuses :ostéosarcome de souris K7M2 et fibroblaste de souris NIH/3T3 et analysé la biocompatibilité des NP à une concentration variable en termes de viabilité cellulaire en utilisant le test MTT. FePO₄ Les NP ont montré une biocompatibilité dépendante de la concentration dans les deux lignées cellulaires-K7M2 et NIH/3T3, dans la plage de concentration de 20 à 600 µg/mL (Fig. 1d). FePO₄ Les NP ont montré une bonne biocompatibilité jusqu'à une concentration de 80 µg/mL avec une viabilité cellulaire supérieure à 70 %. La biocompatibilité était relativement plus élevée dans la cellule non cancéreuse NIH/3T3 par rapport à la cellule cancéreuse K7M2.

Charge de doxorubicine dans FePO₄ et Cytotoxicité de FePO₄ -DOX

La doxorubicine est chargée dans FePO₄ par la méthode de co-incubation-précipitation dans laquelle une solution de doxorubicine est mélangée avec le précurseur de FePO₄ qui entraîne la formation de FePO₄ chargé en DOX . Trois formulations différentes pour charger la DOX sont utilisées comme discuté dans les méthodes. La formulation 1 a montré la meilleure efficacité de chargement de 26,81 % ± 1 tandis que la formulation 2 a montré une efficacité de chargement de 8,83 % ± 2 et la formulation 3 n'a montré aucun chargement (Fig. 2a). Pour le chargement, nous avons ajouté une solution DOX au précurseur Fe(NO₃ )₃ dans la formulation 1 et à (NH₄ )₃ Bon de commande₄ dans la formulation 2, alors que, dans la formulation 3, nous avons ajouté une solution de DOX à FePO₄ NPs directement. Les données de chargement ont clairement montré que l'ajout de DOX au FePO₄ Les NP ne conservent pas la DOX alors qu'elles ajoutent de la DOX à l'un ou l'autre des précurseurs :Fe(NO₃ )₃ et (NH₄ )₃ Bon de commande₄ La solution aide au chargement et à la rétention de DOX. Cela peut s'expliquer par le fait que Fe ³⁺ de Fe(NO₃ )₃ peut former un complexe avec le groupe oxygène riche en électrons présent dans la doxorubicine [32, 33]. Le Fe ³⁺ -Le complexe DOX est ensuite précipité par l'ajout de (NH₄ )₃ Bon de commande₄ résultant en FePO₄ -DOX, qui se caractérise par un changement de couleur du jaune pâle au brun pâle (Fig. 2b). Malgré le changement de couleur, il n'y a eu aucun changement dans les spectres d'émission de FePO₄ -DOX qui a montré des maxima d'émission à 590 nm similaires à celui de Free DOX, lorsqu'il est excité à 480 nm (Fig. 2c). FePO₄ -Les NP DOX ont montré une taille hydrodynamique de 187 ± 7 nm et un PDI de 0,143 ± 0,02, similaire à celui de FePO₄ (Fig. 2d). Cependant, il y avait une différence significative dans la charge de surface de FePO₄ -DOX NPs (-8,89 ± 5 mV), par rapport à FePO₄ NP (-19,1 ± 8 mV) (Fig. 2e). Le changement du potentiel zêta suggère des changements fonctionnels dans la propriété de surface des nanoparticules. Ici, la réduction du potentiel zêta de − 19,1 à − 8,89 mV peut être attribuée à la complexation DOX qui ajoute une propriété cationique dans le complexe.

Chargement de la doxorubicine (DOX) dans FePO₄ NPs et caractérisation de FePO₄ -DOX. un Efficacité de chargement DOX dans trois formulations différentes de FePO₄ NP et DOX, b représentation imagée du changement de couleur du jaune au marron après chargement DOX dans FePO₄ pour formuler FePO₄ -DOX, c caractérisation des spectres d'émission de FePO₄ chargé en DOX NPs (FePO₄ -DOX) après excitation à 480 nm, d distribution granulométrique hydrodynamique de FePO₄ -DOX NPs, et e Caractérisation du potentiel zêta de FePO₄ -NPs DOX montrant la charge de surface (les données représentent la moyenne  ± s.d. ; n = 3 répétitions)

Suite à la caractérisation physico-chimique, la cytotoxicité de FePO₄ -La DOX a été analysée dans les cellules K7M2 et NIH/3T3 et comparée à la DOX libre (Fig. 3). FePO₄ -La DOX a montré une cytotoxicité plus élevée que la DOX libre à une concentration de DOX équivalente dans les deux lignées cellulaires. La valeur IC50 a montré une réduction d'environ 10 fois avec FePO₄ -Traitement DOX, de 2,61 à 0,248 µM en NIH/3T3 et de 1,01 à 0,107 µM en cellules K7M2. Cette réduction drastique de la valeur IC50 dans les deux lignées cellulaires suggère un profil de cytotoxicité amélioré de FePO₄ -NPs DOX. L'équivalent FePO₄ concentration dans la plage de concentration IC50 de FePO₄ -DOX est de 40 µg/mL (0,107 µM dans les cellules K7M2) et de 100 µg/mL (0,248 µM dans les cellules NIH/3T3), qui sont tous deux dans la plage biocompatible de FePO₄ concentration, avec plus de 70% de viabilité cellulaire. Par conséquent, l'élévation de FePO₄ -La cytotoxicité de la DOX peut être attribuée au Fe ³⁺ -Formation du complexe DOX et non à la contribution individuelle de FePO₄ et DOX. La littérature a montré l'effet cytotoxique élevé des anthracyclines comme la doxorubicine en présence de fer [34,35,36,37]. Ces rapports sont en outre soutenus par l'atténuation de la cytotoxicité Fe-DOX par l'utilisation de chélateurs du fer [35,36,37]. Un mécanisme proposé est que le complexe Fe-DOX potentialise la toxicité des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dérivées de la DOX, transformant des ROS relativement sûrs (O ^2· – et H₂ O₂ ) en ROS beaucoup plus toxiques conduisant à des dommages élevés à l'ADN et à la mort cellulaire [34, 36]. Un autre mécanisme proposé est l'interaction de la DOX avec la fonction des protéines régulatrices du fer et de la ferritine en présence d'un excès de Fe, affectant ainsi l'homéostasie du fer, entraînant des dommages dépendants et indépendants des ROS et la mort cellulaire par apoptose [36, 38].

Cytotoxicité de FePO₄ -NPs DOX. a, b Cytotoxicité de la doxorubicine libre (DOX) et de la FePO₄ -NPs DOX dans la lignée cellulaire de fibroblastes de souris NIH/3T3 et d'ostéosarcome K7M2, respectivement, à diverses concentrations équivalentes de DOX. La cytotoxicité a été analysée en pourcentage de viabilité cellulaire après traitement des particules pendant 48 h. c, d Une comparaison en pourcentage de viabilité cellulaire de FePO₄ -NPs DOX et DOX libre dans les lignées cellulaires NIH/3T3 et K7M2, respectivement, à une concentration de DOX équivalente. L'encart au milieu représente les valeurs IC-50 de Free DOX et FePO₄ -NPs DOX dans les cellules NIH/3T3 et K7M2 (les données représentent la moyenne  ± s.d. ; n = 6 répétitions)

En plus de la cytotoxicité élevée, FePO₄ -DOX a montré une sélectivité envers les cellules cancéreuses avec un comportement de cytotoxicité plus élevé similaire à celui de Free DOX. La figure 3c montre l'équivalent de 0,1 µM de DOX FePO₄ -DOX a montré 53 % de viabilité cellulaire pour la cellule cancéreuse K7M2 par rapport à 72 % de viabilité cellulaire pour le NIH/3T3 non cancéreux. De même, Free DOX a également montré un comportement de cytotoxicité plus élevé envers les cellules cancéreuses, avec une viabilité cellulaire de 54 % dans les cellules K7M2 contre 66 % dans NIH/3T3. Cependant, les différences ont augmenté dans le cas de FePO₄ -DOX, avec 19% de différences de viabilité cellulaire entre les cellules cancéreuses et non cancéreuses par rapport à 12% dans la DOX libre. L'analyse de cytotoxicité a montré que la complexation du Fe avec la DOX dans FePO₄ -DOX NPs a considérablement amélioré la cytotoxicité et amélioré la sélectivité envers les cellules cancéreuses.

Internalisation cellulaire de FePO₄ -NP DOX

Le comportement d'internalisation de FePO₄ -DOX NPs a été analysé par microscopie confocale à la suite d'une étude d'internalisation dépendante du temps (Fig. 4). La DOX libre a été utilisée comme contrôle positif. Les deux FePO₄ -Les NPs DOX et la DOX libre n'ont pas montré d'internalisation significative au cours des temps d'incubation initiaux de 0,5 et 1 h. Cependant, à 3 h d'incubation, les deux ont montré une internalisation telle que représentée par la fluorescence DOX rouge dans l'image confocale. La couleur bleue provient de la coloration du noyau par DAPI. L'analyse montre qu'en 3 h, FePO₄ -Les NP DOX s'internalisent dans les cellules en suivant un comportement d'internalisation similaire à celui de la DOX libre. Il est important de noter qu'en raison du changement de couleur de FePO₄ -DOX, qui est brunâtre par rapport à la couleur rouge de Free DOX, nous ne pouvons pas comparer quantitativement le profil d'internalisation relative de FePO₄ -DOX. Néanmoins, le test d'internalisation a confirmé que FePO₄ -DOX est l'absorption par les cellules dans les 3 h. Compte tenu du mécanisme bien compris de gestion du fer par notre corps, les NP proposées pourraient être prometteuses dans le développement de traitements anticancéreux à base de fer avec une capacité à surveiller la réponse thérapeutique en une seule séance de thérapie.

Etude d'internalisation cellulaire. Internalisation cellulaire de FePO₄ -NPs DOX et DOX libre sur cellules K7M2 après 3 h, 1 h et 0,5 h de traitement. Les cellules ont été traitées avec 200 µL de concentration de 5 µg/mL de DOX. La couleur rouge observée dans la lignée cellulaire traitée aux nanoparticules signifie une internalisation réussie des nanoparticules. La couleur rouge est due à la fluorescence caractéristique de la DOX. Aucun signal rouge n'est observé dans la cellule témoin non traitée

Stabilisation de l'ARN et expression de l'ARNm

Comme on peut le voir sur la Fig. 5a, alors que les nanoparticules de cuivre (Cu NP) et les nanotubes de carbone (CNT) accélèrent la dégradation hydrolytique de l'ARN (intensité de bande inférieure au témoin), le FePO₄ et les nanoparticules d'argent (Ag) de contrôle stabilisent l'ARN, comme le montre l'intensité de bande relativement forte dans l'électrophorèse sur gel d'agarose (RAGE). Le FePO₄ et la nanoparticule d'oxyde de zinc témoin (ZnO NP) confère également une certaine résistance à la dégradation dans le sérum, comme illustré par l'intensité de la bande qui est légèrement supérieure à celle des témoins (Fig. 5b). Surtout l'activité fonctionnelle, l'expression de l'ARNm est plus élevée que les contrôles non nanoparticulaires, tandis que le Cu NP dégradant l'ARN provoque une perte d'expression de l'ARNm mesurée par des unités de lumière relative (Fig. 5c). Ces résultats montrent que FePO₄ Les NP aident à stabiliser l'ARN et peuvent être utilisées comme agent d'administration stabilisant pour l'administration d'ARN thérapeutique. Des expériences préliminaires antérieures avaient indiqué une plage de travail normale de traduction montrée sont deux expériences indépendantes pour les échantillons témoins non traités avec des nanoparticules montrant 2393 et ​​2630 RLU/puits, ce qui est représentatif. Une double augmentation conforme aux données ci-dessus suggère que FePO44 NP prend en charge la traduction alors que, conformément à la dénaturation/dégradation de l'ARN ci-dessus, le Cu NP supprime la traduction. Une variété de systèmes de nanoparticules inorganiques ont été exploitées pour la stabilisation et l'administration d'ARN thérapeutique, notamment ; or, argent, cuivre, oxyde de fer, nanoparticule de silice mésoporeuse (MSN), polymères à base de carbone, composites et autres [39-45]. Par exemple, notre groupe avait signalé que la complexation des nanoparticules à l'ARN macromoléculaire peut l'amener à résister à la dégradation par la RNase ou les nucléases présentes dans le sérum et les tissus. Le vaccin à ARNm COVID-19 a renouvelé l'intérêt pour de telles thérapies à ARN macromoléculaire s'étendant au-delà des vaccins, où il incombe à la nanoparticule non seulement de protéger l'ARN de l'hydrolyse et de la digestion médiée par la nucléase, mais la complexation à la NP doit préserver la fonction de l'ARN, par exemple , expression de l'ARNm. Auparavant, nous avions vu l'ARN macromoléculaire de complexation de nanoparticules de cuivre provoquer la dénaturation de l'ARN [46].

Hydrolyse de l'ARN. un Un ARN modèle que nous avons utilisé dans un certain nombre de nos publications, similaire en taille et en composition de séquence à la plupart des ARNm de levure torula (TY-ARN) a été utilisé. L'ARN a été incubé dans de l'eau bidistillée au fil du temps en présence ou en l'absence de nanoparticules de cuivre (Cu NP), de phosphate de fer (FePO4), d'argent (Ag NP) ou de nanotubes de carbone (CNT) à 37 degrés Celsius et les échantillons ont été prélevés à au même instant et dosé par électrophorèse sur gel d'agarose ARN (RAGE). La perte d'intensité de coloration de bande indique une dégradation de l'ARN tandis que le maintien de l'intensité de coloration de bande d'ARN indique une stabilisation. b Comme ci-dessus, l'ARN a été incubé dans 10% de FBS/DMEM à température ambiante en présence d'oxyde de zinc (ZnO) NP ou FePO₄ NP versus contrôle qui était de l'ARN seul en l'absence de nanoparticule. Là encore, les échantillons ont été prélevés au fil du temps et analysés par RAGE, la présence de la bande d'ARN colorée au fil du temps indique à nouveau la stabilité et la résistance à la dégradation de la nucléase ou de la RNase du sérum. c L'ARNm codant pour la luciférase a été traduit in vitro à partir de réticulocytes de lapin standard et la luminescence relative standardisée à l'ARN en présence ou en l'absence de phosphate de fer (FePO₄ ) ou nanoparticule de cuivre (Cu)

Conclusion

FePO₄ les nanoparticules ont été synthétisées avec succès à la suite d'une simple technique de co-incubation-précipitation résultant en la formation de particules de taille homogène de 175 ± 5 nm. L'analyse FTIR a confirmé la présence de groupement phosphate et l'absence d'impuretés précurseurs dans la nanoparticule. L'analyse de biocompatibilité a révélé une biocompatibilité dépendante de la concentration avec plus de 70 % de viabilité cellulaire jusqu'à 80 µg/mL. De plus, DOX a été effectivement chargé dans FePO₄ résultant en FePO₄ -NPs DOX qui ont montré des propriétés physico-chimiques similaires à celle de FePO₄ . L'analyse de cytotoxicité a révélé que la complexation du Fe avec la DOX dans FePO₄ -Les NP DOX ont amélioré la cytotoxicité, avec une amélioration d'environ 10 fois de la CI50, et ont amélioré la sélectivité envers les cellules cancéreuses. De plus, le test d'internalisation a montré FePO₄ -DOX NPs ont été efficacement internalisés dans les cellules à un point de temps d'incubation de 3 h. Une étude de stabilisation de l'ARN a montré que FePO₄ les nanoparticules stabilisent efficacement l'ARN, empêchent une dégradation rapide et maintiennent l'activité fonctionnelle, ce qui est prometteur pour l'administration d'ARN thérapeutique. Compte tenu de la bonne homogénéité de la taille, de la plage de biocompatibilité, de l'efficacité de chargement du médicament, du profil de cytotoxicité amélioré, de la propriété de stabilisation de l'ARN et de l'absorption cellulaire efficace, FePO₄ Les NP ont montré des caractéristiques souhaitables pour les véhicules d'administration de médicaments et d'ARN. De plus, les résultats ont montré des perspectives prometteuses d'utilisation de FePO₄ -NPs de médicaments dans l'enrichissement des aliments pour le développement d'une plateforme de médicaments à base d'aliments.

Méthodes

Synthèse et caractérisation de FePO₄ Nanoparticules

FePO₄ les nanoparticules ont été synthétisées par le protocole d'optimisation de la technique de précipitation chimique par Sokolova et al. [47]. Brièvement, le phosphate d'ammonium ((NH₄ )₃ PO_4, 16 mg/mL) et du nitrate de fer (Fe(NO₃ )_3, 8 mg/mL) a été préparée. Au 1 mL de Fe(NO₃ )₃ , 1 mL de (NH₄ )₃ Bon de commande₄ a été ajouté goutte à goutte sous agitation constante entraînant la précipitation des phosphates de fer (FePO₄ ). Excédent de (NH₄ )₃ Bon de commande₄ a été utilisé pour que tout Fe de Fe(NO₃ )₃ précipiter sous forme de FePO_4. La solution de phosphates de fer ainsi formée a été lavée à l'eau 3 fois pour éliminer les sous-produits par centrifugation à 300 g pendant 2 min. Enfin, FePO₄ le précipité a été dispersé avec une solution de DSPE-PEG-COOH (10 % p/p) dans de l'eau pour formuler FePO₄ nanoparticules. FePO₄ Les NP ont été caractérisées pour leur taille et leurs propriétés de surface à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et des caractéristiques spectrales à l'aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR).

Chargement de la doxorubicine (DOX) sur FePO₄ Nanoparticules

La doxorubicine a été chargée dans FePO₄ nanoparticules par la méthode de co-incubation-précipitation. Trois différents DOX-FePO₄ Des formulations de NPs ont été explorées pour optimiser la meilleure efficacité de chargement. Dans la première formulation, DOX-FePO₄ Les NP ont été formulées en ajoutant 100 µg de DOX dans 1 mL de Fe(NO₃ )₃ (8 mg/mL) suivi de l'ajout de 1 mL de (NH₄ )₃ Bon de commande₄ (16 mg/mL) goutte à goutte sous agitation constante. Dans les deuxièmes formulations, 100 µg de DOX ont d'abord été ajoutés à 1 mL de (NH₄ )₃ Bon de commande₄ (16 mg/mL) suivi de l'ajout de 1 mL de Fe(NO₃ )₃ (8 mg/mL) goutte à goutte sous agitation constante. Dans les troisièmes formulations, 100 µg de DOX ont été ajoutés au FePO₄ NP solution. Ainsi formulé FePO₄ -Les DOX NP ont été lavées trois fois avec de l'eau et la quantité de doxorubicine dans FePO₄ -La DOX a été quantifiée par spectrofluorimétrie en mesurant l'excitation et l'émission de la DOX à 490 nm et 595 nm.

L'efficacité de chargement DOX a été calculée par l'équation suivante :

Biocompatibilité de FePO₄ NPs et cytotoxicité de FePO₄ -NP DOX

Biocompatibilité de FePO₄ NPs et cytotoxicité de FePO₄ -Les NPs DOX ont été dosées dans l'ostéosarcome de souris K7M2 et les fibroblastes de souris NIH/3T3 en utilisant le test MTT selon le protocole établi [48, 49]. Brièvement, 10 000 cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et incubées pendant 24 h dans une cuve à 37 °C 5% CO₂ incubateur. Ensuite, les milieux ont été retirés et des milieux frais avec différentes concentrations de nanoparticules ont été traités en cellules et laissés en incubation pendant 48 h. Les cellules témoins ont été maintenues avec des milieux uniquement. FePO₄ La concentration de NP varie de 20 à 600 µg/mL et la concentration de DOX de 0,05 à 5 µM. Après incubation NP, le milieu a été retiré et les cellules ont été incubées avec une solution de MTT (0,5 mg/ml) dans un milieu sans sérum pendant 2 h pour permettre la formation de cristaux de formazan. La solution de MTT a été retirée et le cristal de formazan a été dissous dans du DMSO et laissé pendant 15 minutes à température ambiante pour un mélange approprié. Ensuite, l'absorbance de la solution de DMSO a été mesurée à 550 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek, Synergy H1 Hybrid Reader) et le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé.

Internalisation cellulaire via microscopie confocale

Internalisation cellulaire de FePO₄ -DOX NPs a été analysé dans des cellules d'ostéosarcome de souris K7M2 en utilisant la microscopie confocale [49,50,51]. Brièvement, 12 000 cellules ont été ensemencées dans des plaques à 8 puits et incubées pendant 24 h à 37 °C 5% CO₂ incubateur. Ensuite, 200 µL d'une concentration de 5 µg/mL de DOX dans le milieu ont été traités pendant 3 h et les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pour l'imagerie. Le noyau a été coloré par DAPI et les cellules ont été observées au microscope confocal à balayage laser (Carl Zeiss, LSM-700). Ici, le maximum d'émission de DOX à 560 nm peut être exploité pour suivre son internalisation qui donne la couleur rouge en microscopie confocale. En utilisant le même protocole, un test d'internalisation dépendant du temps a été réalisé en incubant FePO₄ -NPs DOX et DOX libre pendant 0,5, 1 et 3 h respectivement.

Stabilité et expression de l'ARN

L'ARN de levure Torula (Sigma-Aldrich) a été dissous à 1 mg/ml dans de l'eau déminéralisée stérile et des aliquotes de 2 µg ont été exposés à des nanoparticules de 20 ug/mL (CNT, Cu, Ag, ZnO NP ou FePO₄ ) incubé à 37 deg C et dosé dans le temps par électrophorèse sur gel d'agarose à ARN comme nous l'avons précédemment rapporté [42, 52]. L'heure indiquée sur la figure 5 correspond à la nuit. De même, l'ARN avec/sans nanoparticules a été exposé à 10 % de FBS/DMEM et à nouveau dosé par RAGE comme ci-dessus. L'ARNm fLuc a été obtenu auprès de Trilink Biotechnologies, 2 µl ont été incubés dans du réticuloysat de lapin additionné de méthinine, cystéine et leucine (ProMega Corp) à 30 degrés pendant 1,5 h avec ou sans nanoparticule à 20 μg/ml, réactif standard de luciférine ajouté et mesure de la luminescence prise sur un lecteur de plaques Biotek Synergy H1 dans des conditions standard.

Analyse statistique

Toutes les données représentent au moins trois répétitions indépendantes et exprimées en moyenne  ± s.d. dès que possible. Cell viability data includes six replicates.

Disponibilité des données et des matériaux

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.