Restauration de miR-133a-3p ou réduction de PSAT1 limitent l'anévrisme intracrânien induit par l'endothélium via l'inhibition de la voie GSK3β/β-caténine

Résumé

Le rôle fonctionnel du microARN-133a-3p (miR-133a-3p) dans l'anévrisme intracrânien (AI) reste méconnu. Cette étude vise à élucider son rôle régulateur sur l'AI induit par la lésion endothéliale vasculaire via la voie de signalisation phosphosérine aminotransférase 1 (PSAT1)/glycogène synthase kinase 3β (GSK3β)/β-caténine. Des tissus artérioles intracrâniens normaux et des tissus d'AI ont été prélevés sur des patients traumatisés crâniens et porteurs d'AI. L'expression de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β et β-caténine a été quantifiée par RT-qPCR et western blot. Les cellules endothéliales (CE) humaines d'AI ont été cultivées et traitées avec mimétique miR-133a-3p et si-PSAT1 pour évaluer leurs effets sur migration, apoptose et prolifération. L'expression de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-caténine, Ki-67, CyclinD1, Bax et Bcl-2 a été mesurée par RT-qPCR ou western blot. Un modèle rat d'AI a été établi pour observer les changements pathologiques et l'expression de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-caténine, VEGF et MMP-9 in vivo. L'expression de miR-133a-3p corrélait avec le nombre et la taille des anévrismes. Elle était diminuée dans l'AI, tandis que PSAT1, GSK3β et β-caténine étaient augmentés. La restauration de miR-133a-3p et l'appauvrissement de PSAT1 atténuaient les lésions pathologiques, réduisaient l'expression de PSAT1, GSK3β et β-caténine, supprimaient l'apoptose, favorisaient la prolifération et la migration des CE d'AI, et diminuaient VEGF et MMP-9 in vivo. La surexpression de miR-133a-3p ou la régulation négative de PSAT1 freinent la lésion endothéliale et stimulent la prolifération endothéliale via l'inhibition de la voie GSK3β/β-caténine dans l'AI. miR-133a-3p pourrait être un marqueur et une cible thérapeutique potentiels pour l'AI.

Présentation de l'hypothèse

Nous émettons l'hypothèse que l'axe miR-133a-3p/PSAT1 pourrait affecter l'AI induit par la lésion endothéliale par modulation de la voie GSK3β/β-caténine.

Test de l'hypothèse

Pour vérifier cette hypothèse, nous avons collecté des échantillons cliniques, des cellules endothéliales (CE) humaines d'AI, et établi des modèles rats d'AI afin d'élucider les fonctions de miR-133a-3p et PSAT1 dans le processus d'AI.

Implications de l'hypothèse

Notre étude confirme l'hypothèse : la surexpression de miR-133a-3p ou la régulation négative de PSAT1 freinent la lésion endothéliale et stimulent la prolifération endothéliale via l'inhibition de la voie GSK3β/β-caténine dans l'AI. Ces résultats ouvrent une nouvelle perspective pour une thérapie ciblée de l'AI.

Introduction

L'anévrisme intracrânien (AI) est une pathologie cérébrovasculaire caractérisée par une dilatation anormale de l'artère cérébrale et une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) lors de la rupture, avec une mortalité et une morbidité élevées [1]. Sa pathogenèse reste mal élucidée [2]. L'AI est rarement familial ; il résulte généralement d'une lésion vasculaire acquise due à l'hypertension, au tabagisme et autres facteurs de risque classiques [3]. Le traitement par embolisation endovasculaire ou clippage microchirurgical prévient la rupture des anévrismes non rompus à haut risque [4]. Malgré les progrès chirurgicaux, la récupération post-opératoire reste souvent médiocre [5]. Cette situation impose d'explorer davantage les mécanismes et de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Les microARN (miARN) sont des ARN non codants qui régulent l'expression des gènes cibles en inhibant la traduction au niveau post-transcriptionnel ou en médiant la dégradation de l'ARNm [6]. miR-133a-3p agit comme suppresseur tumoral dans plusieurs cancers ; sa surexpression inhibe la croissance des cellules de cancer colorectal [7]. Une étude montre qu'en bloquant la glutaminolyse médiate par l'autophagie, miR-133a-3p supprime la métastase et la croissance du cancer gastrique [8]. Il participe aussi au développement cardiaque et à l'hypertrophie [9]. Une étude démontre que la surexpression de miR-195-5p réduit l'angiogenèse et la résistance au cisplatine dans le cancer de l'ovaire via la voie PSAT1-dépendante GSK3β/β-caténine [10]. miR-365 réprime l'invasion et la croissance du carcinome épidermoïde de l'œsophage (CEO) en modulant PSAT1 [11]. PSAT1, enzyme de la biosynthèse de la sérine, purifiée à l'origine du cerveau de mouton, est fortement exprimée dans de nombreux tissus [12]. Elle médie la progression du cycle cellulaire dans le cancer du sein via la voie GSK3β/β-caténine [13]. Liu et al. soulignent que PSAT1 favorise le développement du CEO et prédit une survie défavorable, en faisant une cible prometteuse [14]. Ces analyses justifient l'exploration de l'axe miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-caténine dans l'AI.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique du Premier Hôpital d'Enseignement de l'Université de Médecine Traditionnelle Chinoise de Tianjin. Tous les participants ont signé un consentement éclairé. Les expériences animales respectent le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Sujets d'étude

De janvier 2016 à mars 2018, les cas d'HSA par AI traités au service de neurochirurgie du Premier Hôpital d'Enseignement de l'Université de Médecine Traditionnelle Chinoise de Tianjin ont été sélectionnés. 75 échantillons pathologiques d'AI obtenus par microchirurgie forment le groupe AI (29 hommes, 46 femmes, 31-55 ans, âge moyen 44,98 ± 6,79 ans). Le groupe témoin comprend 75 tissus artérioles intracrâniens normaux de patients traumatisés (43 hommes, 32 femmes, 34-56 ans, âge moyen 48,14 ± 8,68 ans). Les patients avec antécédents d'hypertension, diabète ou tumeurs étaient exclus. Aucune différence significative en sexe et âge entre les groupes (P > 0,05).

Traitement et conservation des échantillons

Après résection chirurgicale, certains échantillons des deux groupes ont été fixés au formaldéhyde, déshydratés par alcools gradués et inclus en paraffine pour coloration hématoxyline-éosine (HE) et immunohistochimie. D'autres ont été plongés dans l'azote liquide puis stockés à -80 °C pour western blot et RT-qPCR. Certains ont été fixés au glutaraldéhyde pour microscopie électronique, d'autres utilisés pour l'isolement des CE.

Microscopie électronique

Fixation au glutaraldéhyde 3 %, post-fixation à l'osmium tétroxyde 1 %, déshydratation à l'acétone, inclusion en Epon812, coupes semi-fines (3 μm), double coloration acétate d'uranyle/citrate de plomb, observation au microscope électronique à transmission H-600IV (Hitachi, Tokyo).

Coloration HE

Coupes paraffine cuites 30 min à 60 °C, déparaffinées au xylène, déshydratées aux alcools absolus, rinçées au PBS. Coloration hématoxyline, traitement ammoniacal, éosine 2 min, déshydratation, clarification, montage en gomme neutre. Observation au microscope (Nikon, Tokyo).

Immunohistochimie

Kit Zymed Laboratories (San Francisco). Déparaffinage, réhydratation, inactivation de la peroxydase endogène (H₂O₂ 3 %, 15 min), blocage (sérum de chèvre normal, 15 min), anticorps primaires anti-MMP-9 (5 μg/mL) et anti-VEGF (1:250, Abcam) (PBS pour contrôle négatif), incubation 1-2 h. Anticorps secondaire biotinylé 30-60 min, streptavidine-peroxydase, révélation DAB, contre-coloration, montage. Acquisition d'images par système Nikon SPOT FlexTM. Quantification par logiciel d'analyse immunohistochimique : 5 champs de fort grossissement par échantillon, absorbance moyenne pour analyse statistique.

Isolement et culture des CE

CE isolées de tissus artérioles normaux et d'AI. Fragments de 3 mm² incubés 25 min dans collagenase B 0,1 % / dispase 0,1 % (Roche). Détachement, trituration 2 min, filtration sur tamis 100 μm (BD Biosciences). Centrifugation, resuspension en milieu MV2 avec facteurs de croissance et 20 % FBS (PromoCell). Ensemencement sur fibronectine (Sigma, 1 μg/cm²) à 10⁴ cellules/cm², 1 jour, 5 % CO₂. Rinçage PBS, milieu frais. À 80-100 % de confluence, immunoséparation par billes magnétiques revêtues d'UEA-I (Ulex europaeus Agglutinin I, Vector Laboratories) pour obtenir des CE pures. Les CE liées aux billes sont récupérées par concentrateur magnétique, cellules non liées lavées. CE UEA-positives resuspendues en milieu de culture sur fibronectine. Confluence en 4-6 jours.

Identification des CE

Immunocytochimie avec anticorps anti-CD31 et antigène facteur VIII. Cellules lavées PBS, fixées paraformaldéhyde 4 %, H₂O₂ 3 % 10-15 min, Triton X-100 0,1 % 10 min. Anticorps primaires : Facteur VII (1:200), CD31 (1:400, Roche), incubation 4 °C nuit. Anticorps secondaire IgG peroxydase (1:50), incubation 37 °C 45 min, révélation DAB à l'abri de la lumière 4 min, arrêt à l'eau distillée, observation microscope. Comptage cellules positives/totales sur 10 champs aléatoires au microscope à fluorescence à contraste de phase. Taux de coloration positive = (cellules positives / total) × 100 %. Groupe témoin avec PBS au lieu d'anticorps primaire.

Groupement et transfection cellulaire

Pour étudier les effets de miR-133a-3p et PSAT1 sur les CE d'AI, 7 groupes : contrôle (CE vasculaires normales sans transfection), AI (CE d'AI sans transfection), mimique NC (mimique NC miR-133a-3p), mimique miR-133a-3p, si-NC (si-PSAT1 NC), si-PSAT1, mimique miR-133a-3p + oe-PSAT1. Mimique NC, mimique miR-133a-3p, si-PSAT1, si-NC, oe-PSAT1 conçus par GenePharma (Shanghai). Transfection selon protocole Lipofectamine™ 2000 (Thermo Fisher).

Cytométrie de flux

Milieu éliminé, lavage PBS x2, détachement trypsine 0,25 %, centrifugation 800 tr/min 5 min, resuspension dans 1× tampon de liaison à 1×10⁷ cellules/mL. 100 μL suspension + 5 μL PI (20 μg/mL) + annexine V-FITC 20 min, + 400 μL 1× tampon. Cytomètre BD FACSArial I, analyse < 1 h. Quadrant bas-gauche (Q4) : cellules vivantes (FITC⁻/PI⁻) ; bas-droit (Q3) : apoptose précoce (FITC⁺/PI⁻) ; haut-droit (Q2) : apoptose tardive (FITC⁺/PI⁺). Taux d'apoptose = %Q3 + %Q2.

Test MTT

Cellules détachées à la trypsine, comptage microscope inversé, concentration 5×10⁴ cellules/mL, ensemencement plaque 96 puits. 48 h plus tard, 20 μL MTT 4 h. Dissolution MTT par 150 μL DMSO. DO mesuré à 570 nm. Taux de prolifération calculé d'après le DO.

Test de griffure

Cellules ensemencées plaque 24 puits (2×10⁵ cellules/puits), 3 puits parallèles/groupe. À 90 % confluence, griffure avec pointe micropipette 1 mL stérile (longueur/profondeur constantes). Cellules flottantes éliminées, milieu frais, observation microscope après 24 h. Surface de cicatrisation mesurée par logiciel National Instrument Vision Assistant 8.6. Migration = surface cicatrisation / surface griffure initiale × 100 %.

Animaux et modèle rat d'AI

84 rats Sprague-Dawley (SD), 7 semaines, 180-200 g (Centre animaux, Académie des Sciences Médicales Militaires, Pékin). Logement contrôlé (22-25 °C, 50-60 % HR, lumière naturelle), 4 rats/cage, eau et nourriture standard, litière changée tous les 3 jours, cages stérilisées. Modèle AI selon référence [15]. Anévrisme rompu identifié par : 1) baisse alimentation/boisson avec perte ~10 % poids en 24 h ; 2) flexion tronc/membres antérieurs à la levée ; 3) marche unilatérale ; 4) penchement au repos, activité spontanée absente. Rats symptomatiques euthanasiés à 3 mois. Tissus AI prélevés, perfusion PBS, puis colorant bleu avec acide glutamique dans artère cérébrale.

Traitement et intervention des rats AI

84 rats randomisés en 7 groupes (12/groupes) : normal (pas de modèle), AI (injection stéréotaxique 100 μL PBS + Lipofectamine 2000), mimique NC (mimique NC miR-133a-3p + Lipofectamine), mimique miR-133a-3p, si-NC (si-PSAT1 NC + Lipofectamine), si-PSAT1, mimique miR-133a-3p + oe-PSAT1. Injections quotidiennes, élevage SPF 12 semaines. Après 12 semaines, anesthésie, ouverture thoracique, perfusion saline héparinée 30 mL (37 °C) puis formol 10 %/phosphate tampon 0,1 M (pH 7,4) via ventricule gauche/aorte. Cerveau prélevé, anneau artériel base du crâne disséqué au microscope, observation changements anévrismes, examen pathologique. Mimique NC, mimique miR-133a-3p, si-NC, si-PSAT1, oe-PSAT1 fournis par Shanghai Sangon Biotechnology.

Détection hémodynamique

Vitesse flux sanguin artère carotide commune gauche mesurée 3 jours avant opération et 12 semaines post-intervention. Rats anesthésiés (inhalation), fixation sur table, rasage cou, Doppler couleur avec gel de couplage, mesure vitesse, enregistrement données, réveil en cage.

RT-qPCR

ARN total extrait (kit TIANGEN). Qualité vérifiée par UV et électrophorèse dénaturation formaldéhyde. Transcription inverse (PrimeScript RT reagent Kit). PCR temps réel (SYBR Permix Ex Taq II, Takara). Amorces conçues par Beijing ComWin Biotech (Tableau 1). U6 référence pour miR-133a-3p ; GAPDH pour PSAT1, GSK3β, β-caténine, Bax, Bcl-2, Ki-67, CyclinD1. Analyse 2⁻ΔΔCt.

Western blot

Protéines totales extraites, dosage BCA (Beyotime). Échantillons + 1/4 vol tampon 5× ébullition 5 min. Gel séparation 10 %, concentration 5 %. Électrophorèse, transfert membrane, blocage lait écrémé 5 % 60 min. Anticorps primaires : PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-caténine (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CyclinD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 μg/mL), VEGF (1:1000) (tous Abcam). Anticorps secondaire (1:2000) 60 min. Réaction chimiluminescence (Beyotime) 1 min, film alimentaire, exposition rayons X, révélation. GAPDH (1:10000, Abcam) contrôle de charge. Analyse ImageJ2x.

Test luciférase double rapporteur

Site cible miR-133a-3p/PSAT1 et site liaison 3'UTR prédits par bioinformatique (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Séquence 3'UTR PSAT1 contenant site liaison amplifiée, clonée dans plasmide pGL3-basic luciférase (Takara) → plasmide WT (PSAT1-WT). Plasmide MUT (PSAT1-MUT) par mutation ponctuelle du site liaison (kit Takara). CE en phase logarithmique ensemencées plaque 96 puits. À 70 % confluence, co-transfection PSAT1-WT/PSAT1-MUT + mimique NC/mimique miR-133a-3p (Lipofectamine 2000). Lyse 48 h post-transfection, activité luciférase (kit Promega).

Analyse statistique

SPSS 21.0 (IBM). Données d'énumération : taux/pourcentage, test χ² ou Fisher. Données de mesure distribution normale : moyenne ± écart-type. Comparaison 2 groupes : test t ; groupes multiples : ANOVA à un facteur + test post-hoc Tukey. P < 0,05 significatif.

Résultats

Données générales des patients AI

Le Tableau 2 compare les données générales des groupes AI et témoin.

Expression de miR-133a-3p liée au nombre et à la taille d'AI

Analyse de la relation entre expression miR-133a-3p et caractéristiques clinicopathologiques de l'AI (Tableau 3). Selon l'expression relative moyenne, 75 cas divisés en groupe forte expression (n=47) et faible expression (n=28). Test χ² ou Fisher : expression miR-133a-3p non liée à l'âge, sexe, forme, position de l'anévrisme (P > 0,05), mais associée au nombre et à la taille (P < 0,05).

miR-133a-3p diminué, PSAT1, GSK3β, β-caténine augmentés dans les tissus d'AI

RT-qPCR : miR-133a-3p réduit dans tissus AI vs artérioles normales (P < 0,05) (Fig. 1a). RT-qPCR et western blot : PSAT1, GSK3β, β-caténine augmentés dans AI (tous P < 0,05) (Fig. 1a-c).

Changements pathologiques de l'anévrisme et expression de MMP-9 et VEGF

Observation directe : groupe témoin - vaisseaux rouge vif, pas de plaques athéromateuses ni thrombus latéral. Groupe AI - tumeur brun/rouge foncé, aspect scrotiforme/fusiforme, consistance dure. À l'ouverture : plaques athéromateuses blanchâtres/rouge foncé (plates, rondes, ovales) sur paroi de certains échantillons ; thrombus mural mou dans cavité tumorale. Paroi s'amincissant du col au sommet, parfois fine membrane fibreuse au sommet, voire rupture. Fissure de rupture au sommet ou à proximité.

Coloration HE : groupe témoin - paroi épaisseur uniforme, structure tricouche (intime, moyenne, adventice) nette et intacte, morphologie cellulaire normale, sarcolemmes adjacents serrés, rares cellules inflammatoires. Groupe AI - protrusions locales au sommet de la bifurcation artérielle, angle émoussé/réduit, perte locale de CE. Quelques échantillons : migration cellules musculaires lisses vers intima, prolifération myointimale. CE diminuées ou absentes. Couche endothéliale : cellules myointimales hyperplasiques et CE alignées linéairement, ou CE apoptotiques et cellules sanguines adhérentes à la lumière. Vacuolisation, discontinuité. Certaines décollées avec membrane basale, fibres collagéniques intimales augmentées. Athérosclérose modifiée, paroi artériole nettement amincie, tissu conjonctif abondant. Infiltration inflammatoire diffuse dans toutes couches, surtout moyenne et adventice. Dépôts lipidiques et cristaux de cholestérol dans certaines cellules. Parois tumorales localement ou complètement amincies et expansées vers l'extérieur (Fig. 2a,b).

Microscopie électronique : groupe témoin - fibres matricielles paroi vasculaire nettes, pas de lésion endothéliale, pycnose ou dégénérescence cellulaire. Groupe AI - lésion endothéliale évidente, pycnose, vacuolisation, diminution cellules musculaires lisses moyennes, pycnose nucléaire fréquente, agrégation chromatine, corps apoptotiques. Gonflement mitochondrial, perte structure interne. Matrice extracellulaire floue, flocons amorphes. Fragments cellulaires aux zones de perte (Fig. 2c,d).

Immunohistochimie MMP-9 et VEGF : groupe témoin - pas d'expression dans 75 cas. Groupe AI - 60/75 cas positifs MMP-9 (expression hétérogène intima/adventice, cytoplasme brun-jaune). 66/75 cas positifs VEGF (forte expression moyenne/adventice, faible intima, cytoplasme brun-jaune) (Fig. 2e,f). Expression dans les deux groupes : Tableau 4.

Identification des CE vasculaires

Analyse immunohistochimique facteur VIII et CD31 : CE réagissent positivement aux deux anticorps, taux positif 95 %. Nombreux granules bruns cytoplasmiques, passage 5 nettement plus coloré que passage primaire (Fig. 3a,b).

Surexpression miR-133a-3p et inhibition PSAT1 suppriment l'apoptose, favorisent prolifération et migration des CE d'AI

Cytométrie de flux, RT-qPCR, western blot pour apoptose et expression Bax/Bcl-2 après traitement mimique miR-133a-3p ou si-PSAT1. Vs contrôle : taux apoptose et Bax augmentés, Bcl-2 diminué dans groupe AI (tous P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC : pas de différence significative (P > 0,05). Vs si-NC et mimique NC : groupes si-PSAT1 et mimique miR-133a-3p : apoptose supprimée, Bax diminué, Bcl-2 augmenté (P < 0,05). Vs mimique miR-133a-3p : groupe mimique + oe-PSAT1 : apoptose et Bax augmentés, Bcl-2 réduit (P < 0,05) (Fig. 4a-e).

Test MTT, RT-qPCR, western blot pour prolifération et expression Ki-67/CyclinD1. Vs contrôle : activité prolifération et Ki-67/CyclinD1 réduits dans groupe AI (P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC : pas de différence (P > 0,05). Vs si-NC et mimique NC : groupes si-PSAT1 et mimique miR-133a-3p : prolifération et Ki-67/CyclinD1 augmentés (P < 0,05). Vs mimique miR-133a-3p : groupe mimique + oe-PSAT1 : prolifération et Ki-67/CyclinD1 réduits (P < 0,05) (Fig. 4f-i).

Test de griffure 24 h post-traitement. Migration inhibée dans groupe AI vs contrôle (P < 0,05). Groupes AI, si-NC, mimique NC : pas de changement (P > 0,05). Vs si-NC et mimique NC : migration augmentée dans groupes si-PSAT1 et mimique miR-133a-3p (P < 0,05). Vs mimique miR-133a-3p : migration diminuée dans groupe mimique + oe-PSAT1 (P < 0,05) (Fig. 4j,k).

Restauration miR-133a-3p et déplétion PSAT1 réduisent PSAT1, GSK3β, β-caténine dans les CE d'AI

RT-qPCR miR-133a-3p dans CE d'AI : vs contrôle, expression réduite dans groupe AI (P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC : pas de changement (P > 0,05). Groupe mimique miR-133a-3p : expression augmentée vs mimique NC (P < 0,05). Groupe si-PSAT1 : pas de changement vs si-NC (P > 0,05). Groupe mimique + oe-PSAT1 : pas de différence vs mimique miR-133a-3p (P > 0,05) (Fig. 5a).

Western blot et RT-qPCR pour PSAT1, GSK3β, β-caténine : vs contrôle, expression augmentée dans groupe AI (tous P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC : pas de changement (P > 0,05). Groupes mimique miR-133a-3p et si-PSAT1 : expression diminuée vs mimique NC et si-NC (tous P < 0,05). Groupe mimique + oe-PSAT1 : expression augmentée vs mimique miR-133a-3p (tous P < 0,05) (Fig. 5a-c).

Surexpression miR-133a-3p et inhibition PSAT1 atténuent les lésions pathologiques des tissus d'AI

Changements hémodynamiques : vitesse flux sanguin mesurée 3 jours pré-op et 12 semaines post-intervention. Pas de différence pré-op (P > 0,05). À 12 semaines : vitesse diminuée groupe AI vs normal (P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC, mimique + oe-PSAT1 : même degré de diminution (P > 0,05). Vs si-NC et mimique NC : vitesse augmentée groupes mimique miR-133a-3p et si-PSAT1 (P < 0,05). Vs mimique miR-133a-3p : vitesse diminuée groupe mimique + oe-PSAT1 (P < 0,05) (Fig. 6a).

Coloration HE : groupe normal - fibres élastiques moyenne régulières, structure ondulée normale élastine, pas de rupture/dégradation. Groupe AI vs normal : lumière élargie, structure ondulée disparue, fibres élastiques locales rompues, certaines complètement dégradées. Groupes si-NC, mimique NC, AI, mimique + oe-PSAT1 : pas de changement morphologique. Vs si-NC et mimique NC : groupes mimique miR-133a-3p et si-PSAT1 - structure ondulée présente, désordre local léger, pas de rupture/dissolution (Fig. 6b).

Forte expression miR-133a-3p et faible expression PSAT1 réduisent PSAT1, GSK3β, β-caténine, VEGF, MMP-9 in vivo

RT-qPCR miR-133a-3p in vivo : vs normal, diminuée dans groupe AI (P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC : pas de changement (P > 0,05). Groupe mimique miR-133a-3p : augmentée vs mimique NC (P < 0,05). Groupe si-PSAT1 : pas de changement vs si-NC (P > 0,05). Groupe mimique + oe-PSAT1 : pas de différence vs mimique miR-133a-3p (P > 0,05) (Fig. 7a).

Western blot et RT-qPCR PSAT1, GSK3β, β-caténine in vivo : vs normal, augmentés dans groupe AI (tous P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC : pas de changement (P > 0,05). Groupes mimique miR-133a-3p et si-PSAT1 : diminués vs mimique NC et si-NC (tous P < 0,05). Groupe mimique + oe-PSAT1 : augmentés vs mimique miR-133a-3p (tous P < 0,05) (Fig. 7a-c).

Western blot VEGF et MMP-9 in vivo : vs normal, augmentés dans groupe AI (P < 0,05). Groupes AI, mimique NC, si-NC : pas de changement (P > 0,05). Vs mimique NC et si-NC : diminués groupes mimique miR-133a-3p et si-PSAT1 (P < 0,05). Vs mimique miR-133a-3p : augmentés groupe mimique + oe-PSAT1 (P < 0,05) (Fig. 7d,e).

PSAT1 est un gène cible de miR-133a-3p

Prédiction en ligne (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) : site cible PSAT1/miR-133a-3p et séquence 3'UTR. Pour prouver l'effet sur l'activité luciférase, séquences mutée et sauvage du 3'UTR PSAT1 sans site liaison miR-133a-3p conçues. Co-transfection mimique miR-133a-3p + WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) ou MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) dans CE vasculaires. Résultat : mimique miR-133a-3p sans effet sur activité luciférase groupe Mut (P > 0,05), mais diminution marquée groupe Wt (P < 0,05) (Fig. 7f,g).

Discussion

L'AI est une dilatation anormale de l'artère intracrânienne qui affaiblit la paroi en la poussant vers l'extérieur, augmentant le risque de rupture [17]. Liu et al. ont montré que certains miARN modulent la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires, liée à l'AI [18]. Une étude récente prouve que les miARN circulants peuvent être biomarqueurs pour évaluer le risque d'AI chez les sujets à haut risque [19]. PSAT1 serait impliqué dans les troubles du spectre schizophrénique et altérerait le métabolisme de la sérine [20]. Cette étude explore le rôle régulateur de miR-133a-3p sur la lésion endothéliale vasculaire déclenchant l'AI via la voie PSAT1/GSK3β/β-caténine.

L'analyse de la relation entre expression miR-133a-3p et caractéristiques clinicopathologiques montre qu'elle n'est pas liée à l'âge, sexe, forme, position, mais au nombre et à la taille de l'anévrisme. Certains auteurs suggèrent que le stress de cisaillement du flux sanguin régional induit l'expression de MCP-1 et MIP-1α par fibroblastes et CE vasculaires. Ces chémokines attirent les macrophages dans la paroi vasculaire, médient la réponse inflammatoire, activent le facteur de transcription nucléaire c-Jun, puis AP-1, puis le promoteur MMP-9, augmentant l'ARNm MMP-9, et enfin dissolvent la matrice extracellulaire, causant l'AI [21-23]. Saito et al. [24] ont trouvé que les cellules MMP-9 positives provenaient principalement des macrophages de la moyenne et adventice, confirmant que MMP-9 macrophage médie la dégénérescence de la paroi artérielle menant à l'anévrisme. Ces études lient MMP-9 à la formation de l'AI. Nos résultats montrent une surexpression de MMP-9 dans l'AI ; nous spéculons que miR-133a-3p pourrait intervenir dans l'AI en régulant la voie PSAT1/GSK3β/β-caténine puis MMP-9. Nous avons trouvé que la restauration de miR-133a-3p réduisait PSAT1, GSK3β, β-caténine et MMP-9 dans les tissus d'AI. Des recherches futures vérifieront ces résultats.

Notre étude apporte des preuves substantielles : miR-133a-3p diminué, PSAT1, GSK3β, β-caténine augmentés dans l'AI. Des données émergentes suggèrent un rôle suppresseur de miR-133a-3p dans divers cancers. Expression dramatiquement réduite dans cancer du sein vs tissus non cancéreux [25]. Expression déclinée dans cancer prostatique avancé vs tissus adjacents normaux ou lésions bénignes, surtout métastases osseuses [26]. L'effet promoteur de PSAT1 dans d'autres maladies est documenté. PSAT1 fortement exprimée dans cancer pulmonaire non à petites cellules (CPNPC), prédisant un pronostic défavorable [27]. PSAT1 gène le plus surexprimé dans tumeurs CRC et surexprimé dans maladies chimiorésistantes [28]. Activité GSK3β élevée dans tissus cancéreux [29]. Phosphorylation GSK3β et expression β-caténine nucléaire aussi augmentées, suggérant implication voie GSK3β/β-caténine dans régulation ostéopontine [30].

Nos données montrent que la surexpression de miR-133a-3p et l'inhibition de PSAT1 suppriment l'apoptose, favorisent prolifération et migration des CE d'AI, réduisent VEGF et MMP-9. Il a été suggéré que la surexpression de miR-133a-3p freine invasion, croissance, mitose du carcinome épidermoïde buccal via COL1A1 [31]. Forte expression miR-133a-3p réprime propagation cellules CEO, favorise apoptose, diminue migration/invasion via COL1A1 [32]. Surexpression transitoire miR-133a-3p supprime migration, invasion, croissance du carcinome vésiculaire via ciblage RBPJκ [33]. De même, miR-133a-3p agit dans l'AI via PSAT1. PSAT1 surexprimée stimule croissance et invasion Matrigel cellules CEO in vitro, et injection de cellules CEO PSAT1-high induit tumeurs in vivo [14]. PSAT1 surexprimée, pronostic défavorable, tumorigenèse et prolifération in vivo/in vitro [13]. PSAT1 favorise progression cycle cellulaire, prolifération, tumorigenèse (expériences perte/gain de fonction) [27]. MMPs : enzymes clivant substrats protéiques via mécanisme conservé activant eau liée au site actif par Zn²⁺ [34]. MMP-9 : protéase distincte influençant nombreux processus biologiques [35]. MMP-9 élevée dans groupes anévrisme vs contrôle [36]. VEGF-A : régulateur clé différenciation endovasculaire trophoblaste [37]. Silençage PSAT1 supprime VEGF, β-caténine, phosphorylation GSK3β [10].

Conclusion

En conclusion, notre étude confirme que la surexpression de miR-133a-3p ou la régulation négative de PSAT1 freinent la lésion endothéliale et stimulent la prolifération endothéliale via l'inhibition de la voie GSK3β/β-caténine dans l'AI. Ces résultats offrent une nouvelle perspective pour une thérapie ciblée de l'AI. Ils soulignent le rôle de miR-133a-3p dans l'AI via la voie PSAT1/GSK3β/β-caténine. Cependant, une conclusion définitive sur les effets de miR-133a-3p et PSAT1 ne peut être tirée faute de recherches suffisantes. Un suivi rigoureux et un rapport approprié dans de futurs essais cliniques sont nécessaires.