Nano-feuilles TiS₂ ciblant les mitochondries libèrent le resvératrol pour chimiothérapie tumorale déclenchée par photothermie

Résumé

Une administration ciblée au niveau des organites subcellulaires de médicaments anticancéreux est une stratégie prometteuse pour maximiser les effets anticancéreux et minimiser les effets indésirables. Ici, nous avons préparé une nanoplatforme d'administration de médicaments ciblant les mitochondries basée sur l'iodure IR780 (IR780) et des nano-feuilles de disulfure de titane (TiS₂). Grâce à la grande surface spécifique des nano-feuilles TiS₂, la nanoplatforme peut charger hautement le médicament anticancéreux resvératrol (RV). Le nanocomposite ainsi préparé (IR780-TiS₂/RV) a été utilisé pour une chimiothérapie tumorale efficace déclenchée par photothermie. L'IR780-TiS₂/RV a montré une stabilité et une biocompatibilité satisfaisantes, et les ratios de chargement de RV et IR780 étaient d'environ 112 % et 56 % respectivement. Sous irradiation proche infrarouge (NIR), la chaleur générée par IR780-TiS₂/RV pouvait déclencher la libération de RV. Grâce à la conjugaison avec l'IR780 spécifique aux mitochondries, l'IR780-TiS₂/RV pouvait cibler et s'accumuler dans les mitochondries et libérer le RV lors du déclenchement NIR pour diminuer le potentiel de membrane mitochondriale, induire rapidement la régulation à la hausse de facteurs apoptotiques intrinsèques clés tels que le cytochrome c, et initier la cascade des caspases, réalisant ainsi l'effet chimiothérapeutique. Le nanocomposite IR780-TiS₂/RV a démontré une haute efficacité antitumorale in vitro et in vivo ainsi qu'aucune toxicité tissulaire remarquable. Nous pensons que notre étude démontre que la nanoplatforme IR780-TiS₂/RV déclenchée par NIR pourrait être un agent chimiothérapeutique prometteur en pratique clinique.

Introduction

Le cancer reste une maladie mortelle et représente des taux de mortalité élevés dans le monde. La chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'hormonothérapie sont encore les principales méthodes thérapeutiques utilisées en pratique clinique. Parmi ces méthodes, la chimiothérapie est une option de traitement largement acceptée par les cliniciens et les patients en raison de son efficacité relativement élevée. La chimiothérapie est associée à de graves problèmes, par exemple, la résistance aux médicaments, la récidive tumorale et la non-spécificité. Par conséquent, le développement de nouveaux agents chimiothérapeutiques et stratégies pour surmonter ces obstacles est d'une grande urgence. Ces dernières années, le chargement d'un médicament anticancéreux sur un vecteur fonctionnalisé pouvant simultanément réaliser une administration ciblée et une libération contrôlée du médicament est devenu une approche populaire pour maximiser l'effet thérapeutique et diminuer les effets secondaires. Une grande surface spécifique pouvant fournir un meilleur ratio de chargement de médicament est essentielle pour un excellent vecteur de médicament.

De plus, afin d'améliorer la spécificité du médicament, le vecteur est généralement modifié avec une molécule de ciblage cellulaire, telle que l'acide folique ciblant les récepteurs de surface cellulaire et le glutathion. Puisque de nombreux médicaments chimiothérapeutiques agissent sur des organites subcellulaires spécifiques, la conception d'un système d'administration spécifique aux organites pourrait augmenter remarquablement l'effet thérapeutique et réduire les effets indésirables. Par conséquent, la sélection de l'emplacement ciblé à l'intérieur des cellules tumorales est vitale pour le système d'administration de médicaments. Les mitochondries ne sont pas seulement une « usine d'énergie » des cellules mais aussi une cible clé des médicaments chimiothérapeutiques qui ciblent les mitochondries pour initier la voie apoptotique intrinsèque. Ainsi, le développement d'un système d'administration de médicaments anticancéreux ciblant les mitochondries pourrait être vital pour une chimiothérapie plus efficace. Jusqu'à présent, divers types de systèmes d'administration de médicaments ont été conçus, tels que la silice mésoporeuse, les matériaux à base de carbone et les protéines. Bien que ces vecteurs aient été rapportés comme efficaces pour l'administration de médicaments et la thérapie tumorale, de nouveaux systèmes d'administration à haute efficacité sont encore hautement désirés.

Dans cette étude, nous avons construit une nanoplatforme d'administration de médicaments ciblant les mitochondries et déclenchée par NIR basée sur des nano-feuilles de disulfure de titane (TiS₂) bidimensionnelles pour une chimiothérapie tumorale ciblée et contrôlée. Le TiS₂ est un membre des dichalcogénures de métaux de transition, qui ont une grande surface spécifique. Après exfoliation par ultrasons assistée par protéine, la surface des nano-feuilles TiS₂ est modifiable par d'autres molécules fonctionnelles via interactions covalentes ou non-covalentes. En outre, la molécule IR780 (iodure IR-780) spécifique aux mitochondries tumorales a été choisie pour modifier les nano-feuilles TiS₂. L'IR780 confère aux nano-feuilles la capacité de ciblage mitochondrial, qui passe par le transport actif médié par le polypeptide transporteur d'anions organiques et la caractéristique de cation lipophile. Il a été rapporté que l'IR780 comme cation lipophile montrait plus d'accumulation dans les mitochondries des cellules tumorales en raison de l'amplitude élevée du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules tumorales que dans les cellules normales. En outre, l'IR780 est aussi un agent photothermique réactif au proche infrarouge. La nanoplatforme ainsi préparée, nommée IR780-TiS₂, a été confirmée comme biocompatible et pouvait charger efficacement le médicament anticancéreux resvératrol (RV) (IR780-TiS₂/RV). L'IR780-TiS₂/RV possédait une capacité de ciblage mitochondrial et un effet photothermique. Le NIR a été appliqué comme stimulus externe pour déclencher la libération locale du médicament sous irradiation NIR. Des expériences in vitro et in vivo ont montré que l'IR780-TiS₂/RV a un effet chimiothérapeutique hautement efficace. Une étude plus approfondie du mécanisme a révélé que la mort cellulaire induite par IR780-TiS₂/RV se faisait via la voie d'apoptose intrinsèque médiée par les mitochondries. Ce système d'administration de médicaments ciblant les mitochondries (Schéma 1) pourrait être un agent chimiothérapeutique potentiel dans l'application clinique future.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Sigma-Aldrich a fourni l'iodure IR-780 (IR780), la poudre TiS₂, l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (St. Louis, MO, USA). L'albumine sérique bovine (BSA ≥ 98,0 %) a été achetée chez BioSharp Co., Ltd. (Corée). Le kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a été obtenu de Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japon). Les réactifs de culture cellulaire incluant le milieu DMEM et le sérum fœtal bovin (FBS) ont été fournis par Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Les produits chimiques ont été obtenus de Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine).

Synthèse de l'IR780-TiS₂/RV

La première étape était la préparation de nano-feuilles TiS₂ solubles dans l'eau selon un rapport antérieur. En détail, 5 mg de TiS₂ brut ont été mélangés avec 5 mL d'eau et agités pendant 20 min. La suspension aqueuse de TiS₂ a ensuite été ajoutée à 5 mg de BSA et traitée par ultrasons dissociés en bain de glace utilisant une sonication à pointe de 500 W et 20 kHz (Sonics, VCX130, USA) pendant 6 h. Ensuite, le mélange préparé a été centrifugé à 12 000 tr/min pendant 10 min, résultant en nano-feuilles TiS₂ dans le surnageant.

Deuxièmement, les nano-feuilles TiS₂ ont été conjuguées avec l'IR780. La triéthylamine (TEA) a été appliquée comme agent liant l'acide. Cinq milligrammes d'IR780 ont été dissous dans 2 mL de DMSO et agités à 60 °C pendant 8 h avec l'addition de TEA. La suspension du mélange a été dialysée dans l'eau distillée pendant 2 jours puis centrifugée à 9000 tr/min pendant 8 min pour éliminer le produit agrégé. Le surnageant a été collecté, résultant en IR780-TiS₂.

Enfin, le RV a été chargé sur l'IR780-TiS₂. L'IR780-TiS₂ (1 mg/ml) a été mélangé avec le RV (2 mg/ml, dissous dans DMSO), qui a été légèrement agité toute la nuit à température ambiante. Ensuite, le DMSO et le RV libre ont été éliminés via dialyse dans l'eau distillée toute la nuit pour donner l'IR780-TiS₂/RV. Selon la littérature, le ratio de chargement du RV détecté par un spectrophotomètre UV-vis (UV-2550, Shimadzu, Japon) et calculé selon l'équation suivante :

$$ \mathrm{RV}\ \mathrm{loading}\ \mathrm{ratio}\ \left(\%\right)=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

où A_a (mg), A_b (mg) et A_c (mg) représentent le RV initial, le RV non lié et l'IR780-TiS₂ respectivement.

Un spectromètre à transformée de Fourier infrarouge Bruker TENSOR 27 (Bruker Optics Ltd., Coventry, UK) a été utilisé pour détecter la structure chimique de TiS₂, IR780-TiS₂ et IR780-TiS₂/RV. L'analyse Brunauer-Emmett-Teller (BET) a été réalisée pour déterminer la surface spécifique des échantillons, calculée à partir du résultat d'adsorption de N₂ via un analyseur de surface (Quantachrome ChemBET-3000) basé sur l'équation BET.

Ligne cellulaire et culture cellulaire

Les cellules de cancer du côlon de souris CT26 ont été obtenues de la Banque de cultures de types cellulaires de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Les cellules ont été cultivées dans un milieu DMEM complet (10 % FBS + 90 % DMEM) dans un incubateur humidifié avec 5 % CO₂ à 37 °C.

Localisation in vitro de l'IR780-TiS₂/RV

Le FITC a été utilisé pour marquer l'IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV. En bref, le FITC a été dissous dans une solution d'éthanol (2,0 mg/mL) et mélangé avec une solution aqueuse d'IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV (1,0 mg/mL) sous agitation de 4 h dans l'obscurité à température ambiante. Le mélange a été dialysé dans l'eau distillée toute la nuit pour éliminer le FITC et l'éthanol redondants, résultant en solution d'IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV marqué au FITC. Pour confirmer la co-localisation mitochondriale des nanoparticules in vitro, les cellules traitées avec l'IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV marqué au FITC pendant 5 h et marquées par le colorant mitochondrial spécifique MitoTracker. Ensuite, l'internalisation cellulaire de l'IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV a été observée en utilisant un CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). En bref, les cellules CT26 ont été incubées avec le TiS₂/RV et l'IR780-TiS₂/RV marqué au FITC (avec la même concentration de FITC) pendant 5 h. Ensuite, les cellules ont été traitées avec des solutions MitoTracker Red FM (100 nM) à 37 °C pendant 30 min. Après lavage au PBS trois fois, les cellules ont été observées par CLSM. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour analyser l'intensité de fluorescence des cellules.

Chimiothérapie tumorale déclenchée par NIR in vitro et étude d'apoptose

4 × 10³ cellules/puits CT26 dans des plaques de culture à 96 puits ont été traitées avec RV libre, IR780-TiS₂, IR780-TiS₂/RV et TiS₂/RV avec différentes concentrations de RV pendant 5 h puis irradiées avec ou sans NIR pendant 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²). Après 24 h d'incubation supplémentaire, la viabilité des cellules traitées a été analysée par essai CCK-8. Les cellules traitées ont aussi été marquées par Rhodamine123 (Sigma) et analysées par CMF (FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA). La détection d'apoptose cellulaire a aussi été réalisée par analyse CMF en utilisant un kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC/PI (Bender MedSystems, Vienne, Autriche) comme décrit précédemment.

Western Blot

Les cellules CT26 ont été traitées avec PBS (contrôle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, et IR780-TiS₂/RV + NIR (RV équivalent, 30 µg/mL ; IR780 équivalent, 0,5 µg/mL) pour une incubation de 5 h. Après 24 h d'incubation supplémentaire, les cellules ont été collectées respectivement pour Western blot, basé sur le protocole rapporté précédemment. En bref, les cellules ont été lysées et inhibées par une protéase et Triton X-100. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium a été utilisée pour récupérer et séparer les protéines qui ont ensuite été transférées sur une membrane PVDF et bloquées en utilisant 5 % de lait écrémé. Ensuite, les anticorps primaires dilués ont été incubés à 4 °C pendant 12 h, incluant le cytochrome c (1/1000, Boster, Wuhan, Chine), caspase-3 clivée (1/1000, CST), caspase-9 clivée (1/1000, CST), et actine (1/1000, Souris, Boster, Wuhan, Chine) puis incubées avec un anticorps secondaire. Finalement, le réactif ECL a été utilisé pour détecter les protéines.

Modèle animal

Pour établir le modèle de tumeur sous-cutanée CT26, 1 × 10⁷ cellules CT26 (100 µL, dans PBS) ont été injectées sous-cutanément dans le dos de souris nues Balb/c. Volume tumoral = longueur × largeur²/2. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de la santé et approuvées par le Comité d'éthique animale de l'hôpital central de Zhumadian (Henan, Chine).

Biodistribution in vivo

La biodistribution de l'IR780-TiS₂/RV chez les souris nues porteuses de tumeur a été détectée à 24 h post-injection intraveineuse caudale avec IR780-TiS₂/RV (150 µL, 6 mg/kg). Les organes majeurs incluant cœur, foie, rate, poumon, rein et tumeur ont été pesés et digérés par solution eau régale. La teneur en élément Ti dans ces tissus a été quantifiée par ICP-OES.

Chimiothérapie tumorale déclenchée par NIR in vivo

Les souris porteuses de tumeur CT26 ont été aléatoirement séparées en six groupes (n = 6), incluant salin, salin +NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV, et IR780-TiS₂/RV + NIR (RV équivalent, 1 mg/kg ; IR780 équivalent, 0,5 mg/kg). La condition d'irradiation NIR est 808 nm, 0,3 W/cm², et 3 min. Pendant 30 jours de traitement, les volumes tumoraux et les poids des souris ont été enregistrés tous les 3 jours. Après le traitement, les organes incluant cœur, foie, rate, poumon et rein dans les divers groupes ont été fixés et colorés par H&E.

Analyse statistique

Les résultats ont été présentés comme moyenne ± écart-type. Le test t de Student a été utilisé pour examiner les différences significatives entre deux groupes. P < 0,05 a été considéré comme significatif et P < 0,01 comme très significatif.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation de l'IR780-TiS₂/RV

Pour préparer l'IR780-TiS₂/RV, premièrement, des nano-feuilles TiS₂ biocompatibles ont été préparées par une méthode d'exfoliation assistée par albumine sérique bovine (BSA) et ultrasons comme rapporté précédemment. Ensuite, l'IR780-TiS₂ a été synthétisé dans une réaction de substitution entre un atome de chlore de l'IR780 et les groupes amines de la BSA absorbée sur les nano-feuilles TiS₂ en utilisant un agent liant l'acide TEA. Finalement, la nanoplatforme IR780-TiS₂ a chargé le médicament anticancéreux RV par absorption physique. Le schéma diagramme de l'IR780-TiS₂/RV est montré dans le Schéma 1. Le Fichier additionnel 1: Figure S1 montre l'image MET de l'exfoliation assistée par protéine du TiS₂, qui affichait une structure de nano-feuille. Le motif DRX des nano-feuilles TiS₂ a aussi été détecté, indiquant une bonne cristallinité des nano-feuilles TiS₂ préparées, cohérent avec les observations MET (Fichier additionnel 1: Figure S2). Après fonctionnalisation, le nanocomposite IR780-TiS₂/RV avait une morphologie en feuillet avec un espacement de réseau de 0,25 nm comme montré par microscopie électronique à transmission (Figs. 1a, b) et un diamètre moyen d'environ 123,6 nm et potentiel zêta de -37,2 mV comme détecté par Nanosizer (Malvern Instruments) (Fig. 1c, d). Après un stockage de 2 semaines dans l'eau, FBS ou salin, la taille moyenne de l'IR780-TiS₂/RV est restée constante à environ 123 nm (Fig. 1e) indiquant la stabilité de l'IR780-TiS₂/RV, possiblement due à l'adhésion de la BSA sur la surface des nano-feuilles TiS₂. La figure 1f montre les spectres d'absorption de l'IR780 libre, RV libre, nano-feuilles TiS₂ et IR780-TiS₂/RV. Le spectre d'absorption de l'IR780-TiS₂/RV montrait les pics de l'IR780 libre et du RV libre, indiquant que l'IR780 et le RV étaient tous deux conjugués avec succès aux nano-feuilles TiS₂. Le ratio de chargement du RV de l'IR780-TiS₂ était d'environ 112 % (W/W), atteint par interactions non-covalentes (ex. empilement π-π et interactions hydrophobes). De plus, selon le résultat BET, les surfaces spécifiques étaient calculées à 15,2 m²/g et 122,1 m²/g pour le TiS₂ brut et les nano-feuilles TiS₂ respectivement. Les nano-feuilles TiS₂ exfoliées montrent une surface BET bien plus élevée que celle du TiS₂ brut, fournissant une grande surface active pour le chargement de médicament. Le chargement était élevé probablement dû à la grande surface spécifique et à l'adhésion de la BSA aux nano-feuilles IR780-TiS₂. Pour confirmer davantage que le RV et l'IR780 étaient chargés dans les nano-feuilles TiS₂, les spectres FTIR des nano-feuilles TiS₂, IR780-TiS₂ et IR780-TiS₂/RV ont été mesurés. Dans le Fichier additionnel 1: Figure S6, tous les pics caractéristiques des nano-feuilles TiS₂ apparaissaient dans les spectres FTIR de l'IR780-TiS₂/RV. De plus, trois nouveaux pics apparaissaient (~3191 cm⁻¹, ~1510 cm⁻¹, 1230 cm⁻¹) dans le spectre de l'IR780-TiS₂/RV, indiquant l'existence du RV et de l'IR780.

Après une irradiation NIR de faible puissance de 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²), la température de la solution IR780-TiS₂/RV augmentait proportionnellement à la concentration d'IR780-TiS₂/RV (0, 5, 10 µg/ml), et la solution 10 µg/ml IR780-TiS₂/RV atteignait la température la plus élevée de 47,6 °C (Fig. 2a). De plus, l'IR780-TiS₂/RV avait conservé son effet photothermique initial même après cinq cycles d'irradiation NIR, tandis que l'IR780 libre montrait un effet photothermique diminué (Fig. 2b). Ces résultats indiquent que le nanocomposite IR780-TiS₂/RV a une grande photostabilité.

Ensuite, le ratio de libération du RV a été mesuré sous diverses conditions de pH et d'irradiation NIR (Fig. 2c, d). Après 24 h, le ratio de libération du RV était de 8,56 % sous conditions physiologiques (pH 7,4), mais il était significativement augmenté à 16,2 % à pH 6,5, indiquant qu'il peut être amélioré par des conditions faiblement acides. De plus, le ratio de libération du RV était à nouveau significativement augmenté à 44,8 % à pH 6,5 et une irradiation NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²). Ces résultats démontrent que l'irradiation NIR peut être un stimulus externe contrôlable pour déclencher la libération du RV de l'IR780-TiS₂/RV. Cet effet est probablement dû à la chaleur générée par l'IR780-TiS₂ sous irradiation NIR affaiblissant les interactions d'adsorption non-covalentes entre le RV et la surface de l'IR780-TiS₂. En outre, en environnement acide, les H⁺ pourraient changer la charge de surface du TiS₂ qui alterne l'équilibre hydrophile/hydrophobe des nanoparticules.

Localisation in vitro de l'IR780-TiS₂/RV

Pour étudier l'internalisation cellulaire et la distribution intracellulaire de l'IR780-TiS₂/RV, les nanoparticules IR780-TiS₂/RV ont été marquées avec du FITC, et un CLSM a été utilisé pour visualiser la fluorescence intracellulaire. Après une incubation de 5 h, le TiS₂/RV et l'IR780-TiS₂/RV montraient une intensité de fluorescence similaire dans le cytoplasme (Fig. 3a, b), indiquant que les deux nanocomposites pouvaient entrer dans les cellules, probablement par endocytose. Cependant, le nanocomposite IR780-TiS₂/RV exhibait une plus grande intensité de fluorescence jaune et verte quand le signal FITC était fusionné avec le marquage MitoTracker (Fig. 3a, c). Ces résultats indiquent que l'IR780-TiS₂/RV peut cibler les mitochondries avec une haute efficacité. De plus, la distribution de l'IR780-TiS₂/RV dans le cytoplasme a été confirmée davantage par MET, qui montrait des nanoparticules retenues dans certaines mitochondries (Fig. 3d). Ensemble, ces résultats confirment fermement que l'IR780-TiS₂/RV atteint un bon ciblage mitochondrial, ce qui favorise l'accumulation mitochondriale du médicament, causant une cytotoxicité cellulaire immédiate. Le ciblage mitochondrial était probablement médié par le transport actif médié par le polypeptide transporteur d'anions organiques et la caractéristique de cation lipophile, qui faisait que les nanoparticules s'accumulaient hautement dans les mitochondries des cellules tumorales.

Chimiothérapie tumorale déclenchée par NIR in vitro

Premièrement, l'effet photothermique a été évalué in vitro. Après une incubation de 5 h, l'IR780-TiS₂/RV montrait une augmentation de température d'environ 17 °C, tandis que le TiS₂/RV affichait une augmentation d'environ 10 °C (Fig. 4a). L'effet photothermique était attribué à l'IR780 et aux nano-feuilles TiS₂. Démontrant la biocompatibilité comme nanoplatforme pour le chargement de médicament, l'IR780-TiS₂ n'affichait pas de cytotoxicité prononcée en dessous de la concentration de 300 µg/ml (Fig. 4b). De plus, le RV avec ou sans irradiation NIR avait un effet de destruction cellulaire dépendant de la concentration similaire (Fig. 4c). À la même concentration de RV, le RV atteignait le meilleur effet de destruction cellulaire quand il était chargé par l'IR780-TiS₂ et irradié par NIR comparé à toutes les autres conditions, c'est-à-dire RV libre, IR780-TiS₂ libre, et RV chargé par TiS₂ (Fig. 4d). Fait intéressant, la plateforme IR780-TiS₂ non chargée n'affichait pas d'effet anticancéreux remarquable quand elle était exposée à l'irradiation NIR comparée à celle sans irradiation NIR (Fig. 4d), indiquant que la chaleur générée par l'IR780-TiS₂ sous le stimulus d'irradiation NIR était principalement utilisée pour déclencher la libération du médicament qui tuait alors les cellules. Ces résultats suggèrent que l'IR780-TiS₂/RV peut libérer le RV dans les mitochondries quand déclenché par irradiation NIR et ainsi augmenter remarquablement la concentration locale de RV dans les mitochondries et atteindre un plus grand effet d'inhibition tumorale.

Mécanisme de mort cellulaire

Pour illustrer le mécanisme sous-jacent de la chimiothérapie déclenchée par NIR de l'IR780-TiS₂/RV, nous avons analysé le type de mort cellulaire, le potentiel de membrane mitochondriale (Ψm), et les niveaux d'expression des protéines clés liées à l'apoptose. Premièrement, la CMF a été utilisée pour détecter le type de mort cellulaire en utilisant la coloration Annexin V-FITC/PI (Fig. 5a). À la même concentration de RV, le RV libre, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, et IR780-TiS₂/RV + NIR pouvaient tous induire l'apoptose, principalement due à la présence du RV. En effet, il a été rapporté que le RV a la capacité d'induire l'apoptose. Parmi ces traitements, l'IR780-TiS₂/RV + NIR montrait le taux d'apoptose le plus élevé de 90,8 %. Les voies de signalisation d'apoptose ont été investiguées ensuite. Une diminution de Ψm a été rapportée comme l'événement clé dans la voie apoptotique mitochondriale (intrinsèque). À la même concentration de RV, l'IR780-TiS₂/RV + NIR diminuait Ψm d'environ 85 %, ce qui était plus significatif qu'une diminution de Ψm induite par IR780-TiS₂, TiS₂/RV avec ou sans NIR, et RV libre (Fig. 5b). Cette expérience indique que l'IR780-TiS₂/RV + NIR induisait une mort cellulaire médiée via la voie apoptotique mitochondriale (intrinsèque). Ensuite, l'expression des protéines critiques pour l'apoptose, spécifiquement le cytochrome c (cyto c), caspase 9, et caspase 3, a été détectée via un essai Western blot. Les cellules traitées avec IR780-TiS₂/RV + NIR exprimaient plus de cyto c cytosolique que celles traitées avec RV, IR780-TiS₂/RV, ou IR780-TiS₂/RV (Fig. 5c). La translocation de cyto c est l'initiateur le plus important de la cascade des caspases. Par conséquent, l'expression de caspase-9 clivée et caspase-3 clivée était considérablement augmentée dans les cellules traitées par IR780-TiS₂/RV + NIR. Ensemble, ces données suggèrent clairement que l'apoptose était médiée par la voie mitochondriale (intrinsèque).

Chimiothérapie tumorale déclenchée par NIR in vivo

Pour évaluer l'efficacité de la chimiothérapie déclenchée par NIR in vivo, des souris porteuses de tumeur CT26 ont été traitées avec salin, salin + NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR, et IR780-TiS₂/RV + NIR. La taille de la tumeur dans le groupe IR780-TiS₂/RV + NIR a significativement diminué, et la tumeur a presque disparu après 30 jours de traitement, tandis que dans les groupes restants, le volume tumoral montrait une tendance à la hausse (Fig. 6a). Pendant le traitement, il n'y avait pas de différence significative de poids corporel entre les groupes (Fig. 6b). Finalement, l'imagerie H&E a révélé aucune toxicité tissulaire ou anormalité notable dans tous les groupes testés (Fig. 6c). Ces résultats démontrent que le nanocomposite IR780-TiS₂/RV a une efficacité antitumorale déclenchée par NIR exceptionnelle et une faible toxicité systémique. De plus, la biodistribution de l'IR780-TiS₂/RV a été évaluée in vivo. Comme montré dans le Fichier additionnel 1: Figure S4, les nanoparticules entraient principalement dans le système hépatique et étaient peut-être métabolisées par le système.

Conclusion

En résumé, nous avons développé une nanoplatforme ciblant les mitochondries et chargée de RV basée sur des nano-feuilles TiS₂ pour une libération de médicament déclenchée par NIR et une chimiothérapie tumorale améliorée. L'IR780-TiS₂/RV ainsi préparé avec morphologie en feuillet a montré une bonne stabilité et biocompatibilité. Grâce à la capacité de ciblage mitochondrial de l'IR780, l'IR780-TiS₂/RV pouvait s'accumuler sélectivement dans les mitochondries des cellules tumorales et y libérer le RV quand déclenché par l'irradiation NIR. Le RV libéré facilitait la diminution du potentiel de membrane mitochondriale, la libération de cyto c, et, subséquemment, initiait une cascade de réactions caspases pour promouvoir l'apoptose des cellules tumorales via la voie de signalisation mitochondriale. Les résultats in vitro et in vivo ont démontré que l'IR780-TiS₂/RV exhibait une chimiothérapie tumorale déclenchée par NIR efficace sans toxicité tissulaire significative. Ces résultats suggèrent que l'IR780-TiS₂/RV pourrait être un agent chimiothérapeutique prometteur en pratique clinique.