SPIO améliore la présentation croisée et la migration des DC et le SPIO anionique influence les effets nanoadjuvants liés à l'interleukine-1β

Contexte

Les adjuvants ont été largement appliqués à des fins cliniques et expérimentales, et ils ont longtemps été considérés comme des agents immunostimulants, des dépôts passifs ou des véhicules capables de promouvoir les réponses immunitaires requises [1, 2]. Au cours des dernières décennies, de nombreuses classes diverses de composés ont été utilisées comme adjuvants, notamment des nanoparticules, des produits microbiens, des émulsions, des cytokines, des polymères et des liposomes [3,4,5]. L'évolution des nanoparticules en tant qu'adjuvants immunitaires (nanoadjuvants) représente un domaine remarquable de délivrance d'antigènes basé sur l'amplification des réponses immunitaires. Parmi tous les types de nanoparticules, les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO) ont une grande biocompatibilité, une architecture de surface appropriée et une conjugaison de ligand flexible [6]. Ces propriétés les rendent applicables dans de nombreux domaines biomédicaux différents, tels que l'imagerie par résonance magnétique (IRM), l'administration ciblée de médicaments et la thérapie par hyperthermie [7, 8].

Les cellules dendritiques (CD), les principales cellules présentatrices d'antigène (CPA) professionnelles, jouent un rôle essentiel dans l'immunité adaptative à médiation cellulaire dans laquelle la mémoire immunologique est générée après une réponse primaire à un antigène spécifique, et cette mémoire conduit à une réponse améliorée aux rencontres ultérieures avec cet antigène [9, 10]. De plus, les CD peuvent favoriser la présentation d'antigènes exogènes par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-I), un processus appelé présentation croisée, puis activer les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) [11]. Les antigènes solubles destinés à la présentation croisée sont internalisés par endocytose médiée par les récepteurs, puis transférés dans le cytoplasme pour la dégradation protéasomale et le chargement peptidique. Les vaccins DC conventionnels conduisent à une réponse immunitaire modérée en raison du transport relativement insatisfaisant des antigènes solubles. Par conséquent, les nanoadjuvants ont été explorés en tant que porteurs d'antigènes solubles pour améliorer la présentation croisée dans les CD dans de nombreuses études de recherche [12,13,14].

Les matériaux de revêtement jouent un rôle essentiel dans la stabilisation et la fonctionnalisation ultérieure des suspensions aqueuses de SPIO [15]. Dans des études précédentes, il a été démontré que les SPIO chargées positivement facilitent la capacité de présentation croisée des CD à améliorer la réponse immunitaire, et elles surpassent l'effet de leurs homologues chargés de manière opposée [16, 17]. Le mécanisme par lequel SPIO chargé différemment peut affecter la présentation croisée des antigènes des DC n'a pas été clarifié. L'interleukine-1β (IL-1β), une cytokine prototypique pro-inflammatoire qui participe à l'immunité innée, peut être sécrétée par les cellules immunitaires, telles que les CD, lors de la détection des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et des modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) [ 18]. La production d'IL-1β est strictement médiée par les inflammasomes, en particulier NLRP3 (protéine 3 contenant les domaines NACHT, LRR et PYD). L'activation de NLRP3 induit la production de caspase-1, qui clive ensuite la pro-IL-1β inactive en la forme active IL-1β [19]. Certaines nanoparticules inorganiques, telles que la silice, les nanotubes de carbone à double paroi et le dioxyde de titane, peuvent induire la formation d'inflammasome [20,21,22]. Des études antérieures ont rapporté une corrélation entre la charge de surface des nanoparticules de magnétite et leur efficacité cellulaire [23]. Ici, nous supposons que différentes charges de surface sur les DC chargés de SPIO peuvent également influencer la sécrétion d'IL-1β, et notre objectif est d'étudier la relation entre ces charges de surface et la fonction de présentation croisée des DC.

Méthodes et matériaux

Préparation du SPIO

Pour préparer SPIO, une méthode de coprécipitation simple a été utilisée comme indiqué précédemment [24]. En bref, une solution mixte de FeCl₃ et FeSO₄ (rapport molaire Fe ³⁺ :Fe ²⁺ =2:1) a été préparé sous atmosphère d'azote et agité énergiquement à 37 °C pendant 30 min. Un précipité de couleur noire de Fe₃ O₄ des nanoparticules se sont formées et immédiatement lavées cinq fois avec de l'eau distillée en utilisant une séparation magnétique. Le Fe₃ O₄ a ensuite été dispersé dans de l'eau distillée à une concentration de 3 mg/mL à un pH de 3. Finalement, la suspension a été aérée (avec de l'air) à 95 °C et le SPIO brun a été séparé.

SPIO recouvert de DMSA (SPIO/D ⁻ ) et SPIO revêtu d'APTS (SPIO/A ⁺ ) ont été préparés en enduisant SPIO d'acide méso-2,3-dimercaptosuccinique (DMSA) et de 3-aminopropyltriméthoxysilane (APTS), respectivement. Pour SPIO/D ⁻ , une solution aqueuse de DMSA à un rapport molaire de 1:40 a été ajoutée à 100 mL de solution SPIO. Après une réaction de 4 h sous agitation continue, le SPIO/D ⁻ a été séparé à une vitesse de 500 tr/min à 50 °C. Pour SPIO/A ⁺ , APTS a été ajouté à la solution SPIO à un rapport molaire de 0,2:1 sous agitation vigoureuse pendant 5 h. Ensuite, le précipité a été dissous avec un aimant permanent et lavé avec de l'eau désionisée, et la solution a été traitée à l'aide d'ondes ultrasonores. La solution résultante a été lavée à plusieurs reprises avec de l'eau et le SPIO/A ⁺ ont finalement été séchés en poudre à 37 °C sous vide.

Souris

Des souris C57BL/6 et des souris transgéniques C57BL/6 transgéniques à protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) ont été achetées au Centre de recherche animale modèle de l'Université de Nanjing et hébergées dans des conditions spécifiques sans agent pathogène (SPF) au Laboratoire central de l'Université de Nanjing. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de la faculté de médecine de l'Université de Nanjing, en Chine.

Culture cellulaire

Les DC murines ont été générées à partir de moelle osseuse de souris comme décrit précédemment [25]. En bref, les monocytes de moelle osseuse de souris C57BL/6 âgées de 8 semaines ont été séparés de leurs fémurs et tibias. Par la suite, les cellules ont été cultivées dans du RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 10 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages murins (GM-CSF; Gibco, États-Unis) et 1 ng/mL d'interleukine-4 murine (IL-4, PeproTech, Rocky Hill, NJ, États-Unis). Le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais tous les 2 jours. Les DC immatures étaient généralement collectées au jour 6. Les DC EGFP étaient dérivées de souris C57BL/6 transgéniques EGFP selon la méthode mentionnée ci-dessus.

Des cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC) congelées décongelées ont été laissées au repos pendant une nuit dans un milieu complet, c'est-à-dire X-VIVOTM 15 (Lonza Group Ltd., Bâle, Suisse) =1:1. Après centrifugation en gradient de densité, les PBMC ont été mises en suspension dans le milieu pendant 4 h. Les CD humaines des cellules adhérentes ont été cultivées à 37 °C dans un milieu contenant du GM-CSF humain (100 ng/mL ; R&D Systems, Minneapolis, MN, États-Unis) et de l'IL-4 humaine (10 ng/mL ; PeproTech, Rocky Hill, New Jersey, États-Unis). La moitié du milieu a été changée aux jours 2 et 4. Les CD humaines immatures ont été récoltées au jour 5. Les cellules T spécifiques du cytomégalovirus Epstein-Barr virus et du virus de la grippe (CEF) ont été dérivées de cellules en suspension, qui ont été cultivées dans des milieux CMX contenant du CMH. -J'ai restreint le peptide CEF (20 ng/mL, Panatecs, Heilbronn, Allemagne, PA-CEF-002) pendant environ 48 h. Des cellules T spécifiques de CEF ont été développées par 1000  U/mL d'IL-2 humaine (Peprotech, Rocky Hill, NJ, États-Unis, 200-02) dans un milieu CMX pendant 12 jours. Pour l'IL-2, le milieu a été remplacé par un milieu frais tous les 3 jours.

Caractérisation

La morphologie et la taille du SPIO ont été déterminées à l'aide d'un microscope électronique à transmission (TEM, Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA). Un diagramme de diffraction des rayons X (XRD) a été utilisé pour identifier les spectres du catalyseur. Le dosage du potentiel zêta a également été mesuré pour déterminer les charges de surface des nanoparticules recouvertes de différents polymères. Le SPIO/A ⁺ et SPIO/D ⁻ des nanoparticules ont été préparées avec des valeurs de pH allant de 3 à 8. Des mesures de potentiel zêta ont été effectuées avec un analyseur de potentiel zetasizer Nano ZS90 (Malvern, Royaume-Uni). Les propriétés magnétiques des nanoparticules ont été analysées à 37 °C à l'aide d'un magnétomètre à échantillon vibrant (Lakeshore 7407).

Test CPRG

Le B₃ Lignée de cellules T Z (un CD8 ⁺ hybridome de cellules T) peut exprimer le gène LacZ lorsque son récepteur de cellules T engage un épitope d'ovalbumine (OVA) 258-265 en présence de la molécule H-2Kb MHC-I. DC (2 × 10 ⁴ ) et OVA (100 μg/mL, Sigma-Aldrich) ont été cultivés avec SPIO, SPIO/A ⁺ , ou SPIO/D ⁻ à 37 °C. Six heures plus tard, les CD ont été co-cultivés avec B₃ Z (2 × 10 ⁵ ) pendant la nuit. Un dosage de chlorophénol rouge-β-galactosidase (CPRG, Sigma-Aldrich, USA) a été réalisé pour déterminer la production de β-galactosidase du B₃ cellules Z. Dans ce test, la densité optique (DO) à 595 nm indique la capacité de présentation croisée des antigènes des CD.

Test d'apoptose des cellules

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FCS) a été utilisé pour explorer les effets de différentes concentrations de SPIO sur la viabilité des CD. En bref, les DC immatures ont été incubées avec du SPIO marqué à l'Annexine V et au PI (Biouniquer, CHN), et l'expression de l'Annexine V et du PI dans les DC a été examinée via FCS.

Imagerie d'intensité de fluorescence in vivo

Pour explorer la migration des CD in vivo, du TNF-α (60 ng/souris) a été pré-injecté dans les coussinets des deux pattes postérieures (n = 8). Après 24 h, EGFP-DC marqués SPIO (2 × 10 ⁶ ) dans 40 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été injectés dans les coussinets gauches de souris C57BL/6, et le même nombre d'EGFP-DC non marqués a été injecté dans le côté droit. Pour examiner le niveau d'EGFP-DC migrant vers les ganglions lymphatiques, un système d'imagerie Maestro (CRi, Woburn, MA, USA) a été utilisé. Les ganglions lymphatiques disséqués ont été observés à l'aide de filtres d'excitation de 484 nm et de filtres d'émission de 507 nm. Les images fluorescentes affichant une fluorescence verte ont ensuite été analysées avec le logiciel Living Image (v 2.50; Caliper Corporation, Newton, MA, USA). Des analyses de microscopie confocale ont été utilisées pour déterminer l'immunohistochimie. Les ganglions lymphatiques congelés ont été coupés en sections de 5 m d'épaisseur puis fixés, et les sections ont été incubées avec un anticorps de protéine fluorescente verte (GFP) (Invitrogen), avec un anticorps de chèvre Alexa Fluor 488 nm (Invitrogen) utilisé comme anticorps secondaire. Un microscope confocal à balayage laser (Fluoview, Fv10i; Olympus) a été utilisé pour observer les échantillons.

Test de présentation croisée d'antigène DC humain in vitro

Les DC humaines cultivées (2 × 10 ⁴ ) ont été ensemencés dans une plaque à fond rond de 96 puits sur laquelle SPIO/A ⁺ et SPIO/D ⁻ des nanoparticules (100 μg/mL) combinées à la protéine pp65 du cytomégalovirus (CMV) (1 μg/mL, MACS) ont été ajoutées, et la protéine CMV pp65 et le peptide CEF (1 μg/mL, peptides Think) ont été utilisés séparément comme témoins. Après 6 h, cellules T spécifiques du CEF (2 × 10 ⁵ ) ont été ajoutés aux CD humains pendant 12 h. La brefeldine A (10 μg/ml, Sigma-Aldrich, USA) a été maintenue dans le milieu pendant 6 h supplémentaires. Après stimulation et activation, des cellules T spécifiques de CEF ont été recueillies et colorées avec des anticorps humains contre CD3, CD4, CD8 et IFN-γ (Invitrogen, USA). Après coloration, les échantillons ont été analysés par un cytomètre en flux LSR II sur mesure (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Les données collectées ont été analysées par le logiciel FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA).

Dosage immuno-enzymatique

Un kit Ready SET-Go d'essai immunoenzymatique (ELISA) de souris IL-1β (eBioscience, USA) et un kit ELISA IL-1β humain (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ont été utilisés pour déterminer la sécrétion d'IL -1β par les DC. Une plaque ELISA (Costar, USA) recouverte de 100 μL/puits d'IFN-γ a été utilisée pour capturer les anticorps pendant la nuit à 4 °C et bloquée avec du tampon ELISA. Des échantillons et des standards ont ensuite été ajoutés aux puits et incubés pendant 2 h à 37 °C. L'IFN-γ biotinylé a été détecté. Les échantillons ont été mesurés à l'aide d'un lecteur de microplaques avec un réglage de DO de 450 nm (BioTek, États-Unis).

Analyse statistique

Les données ont été analysées à l'aide du Statistical Package for Social Science (SPSS 13.0, Chicago, IL, USA). Les résultats ont été présentés sous forme de moyennes  ± SD, et les différences entre les groupes de contrôle et de test ont été évaluées par une analyse de variance unidirectionnelle, le t bilatéral de Student. tests et analyse de variance à double facteur. Différences à *P < 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs.

Résultats

Caractérisation de SPIO

La morphologie et la taille du SPIO synthétisé ont été observées par MET. L'image MET a montré que SPIO avait une taille moyenne de 8,7 nm et une forme sphérique (Fig. 1a). L'analyse XRD a montré six pics qui correspondaient distinctement à la norme γ-Fe₂ O₃ reflets (Fig. 1b). Les résultats du magnétomètre vibrant ont démontré que le SPIO obtenu possédait un comportement superparamagnétique, avec une magnétisation à saturation de 60,4 emu/g meilleure que Fe₃ O₄ (Fig. 1c). Le tracé DLS a montré que la distribution de taille du SPIO est de 22 nm en solution (Fig. 1d). Pour confirmer que les DC contenaient du SPIO, une coloration au bleu de Prusse a été effectuée pour vérifier que les DC contenaient du fer (Fig. 1e).

Caractérisation de SPIO. un Image MET du SPIO obtenu. b Modèle XRD du catalyseur à nanoparticules indiquant que le matériau est γ-Fe₂ O₃ . c Courbes de magnétisation des SPIO et Fe₃ obtenus O₄ nanoparticules. d Diamètre hydrodynamique du SPIO. e Morphologie des CD marquées au 50 μg/mL SPIO après 12 h d'incubation :CD non marquées et CD marquées au bleu de Prusse

Présentation croisée des DC activée par SPIO

Pour approfondir l'étude de l'effet des DC marquées SPIO sur l'activation des lymphocytes T dans un système murin, le niveau de B₃ L'activation des lymphocytes T Z a été déterminée en examinant la production de -galactosidase par dosage CPRG. Une concentration fixe de 100 μg/mL d'OVA et cinq ratios de dose de SPIO (1, 5, 10, 25 et 50 μg/mL après 6 h) ont été adoptés dans cette étude. Au fur et à mesure que la concentration de SPIO augmentait, le degré d'activation de B₃ Les cellules Z ont augmenté progressivement et ont atteint une stabilité à 25 μg/mL (Fig. 2a). Pour déterminer si la viabilité des DC marquées avec les différentes concentrations de SPIO a été influencée, les DC et les DC marquées par SPIO ont été analysées via FCS après coloration à l'Annexine V et PI. Les résultats ont indiqué que le pourcentage total de CD d'annexine V/PI à des concentrations de SPIO de 10, 25 et 50 μg/mL ne différait pas significativement, tandis que le pourcentage de cellules apoptotiques augmentait après le chargement avec 100 μg/mL de SPIO (Fig. 2b ). Les molécules de costimulation de surface des DC marquées avec diverses concentrations de SPIO ont été observées par FCS. L'expression de CD80 et CD86 avait une augmentation détectable à 25 μg/mL par rapport à celles sans marquage SPIO (Fig. 2c). Les DC marquées avec 25 μg/mL de SPIO n'ont pas présenté de changements dans l'apoptose cellulaire à différents moments (Fig. 2d). Nous avons utilisé 25 μg/mL dans les expériences suivantes.

Influences de la présentation croisée des DC et de la biocompatibilité après marquage avec SPIO. un Présentation croisée des DC améliorées à différentes concentrations de SPIO. b DC apoptotiques et DC marquées SPIO examinées par FCS à différentes concentrations (10, 25, 50 et 100 μg/mL). c Phénotypes des DC, dont CD11c ⁺ CD80 ⁺ et CD11c ⁺ CD86 ⁺ après marquage au SPIO (10, 25, 50 μg/mL). Les DC stimulées avec du LPS (1 μg/mL) ont été utilisées comme témoins positifs. d DC apoptotiques chargées de 25 μg/mL de SPIO examinées par FCS à différents moments (6, 12, 18 et 24 h)

Étiquetage des EGFP-DC avec des signaux EGFP améliorés SPIO dans les ganglions lymphatiques secondaires

Les EGFP-DC ont été dérivées avec succès de souris transgéniques EGFP in vitro, et les images de microscopie confocale à fluorescence ont montré que presque toutes les EGFP-DC présentaient une fluorescence verte (Fig. 3a). Pour déterminer si la fluorescence verte des EGFP-DC pouvait être affectée par SPIO, une FCS a été réalisée. Les résultats ont montré que l'expression de la fluorescence EGFP n'était pas affaiblie après le marquage SPIO (Fig. 3b, c). Ensuite, les 25 μg/mL d'EGFP-DC marqués SPIO ont été injectés dans les coussinets postérieurs du côté droit de souris C57BL/6 et les EGFP-DC non marqués ont été injectés dans le côté opposé. Les signaux EGFP ont été mesurés dans le ganglion lymphatique poplité (PLN) et le ganglion lymphatique inguinal (ILN), qui sont respectivement les ganglions lymphatiques sentinelles et les ganglions lymphatiques secondaires. Les résultats ont montré que la migration des EGFP-DC marquées SPIO et des EGFP-DC non marquées dans les ganglions lymphatiques sentinelles a atteint un pic au jour 7. Des différences significatives dans le signal EGFP n'ont pas été observées entre les deux groupes, alors qu'une réduction significative a été détectée. dans le groupe PLN au jour 14. Les signaux EGFP détectés dans le groupe ILN étaient cohérents avec ceux du groupe EGFP-DC marqués SPIO les 4ème et 7ème jours, ce qui indiquait que les CD marquées SPIO avaient migré vers la lymphe secondaire nœuds (Fig. 3d–f).

Migration et localisation des EGFP-DC après marquage avec SPIO. un Microscopie confocale à balayage laser des EGFP-DC marquées avec 25 μg/mL de nanoparticules SPIO après 12 h d'incubation. b , c Intensité de fluorescence des EGFP-DC marquées par SPIO après 12 h. Imagerie optique in vitro des ganglions lymphatiques de drainage après la rétrotransfusion d'EGFP-DC marquées SPIO à différents jours. Le TNF-α a d'abord été injecté dans le coussinet plantaire de la souris pour favoriser la migration des EGFP-DC. d –e Imagerie optique in vitro et analyse de l'intensité du signal des ganglions lymphatiques à différents jours après l'injection d'EGFP-DC avec ou sans SPIO. f Des cellules positives pour l'EGFP des ganglions lymphatiques drainants ont été détectées par microscopie confocale laser

Présentation croisée des contrôleurs de domaine murins affectés par SPIO modifié chargé différemment

Les SPIO ont été recouverts d'APTS ou de DMSA. Pour vérifier la charge de surface du SPIO, nous avons mesuré la caractéristique du potentiel zêta. Les potentiels zêta du SPIO/A ⁺ et SPIO étaient positifs, alors que le potentiel zêta du SPIO/D ⁻ a montré une charge négative en solution lorsque la valeur du pH était de 7 (Fig. 4a). L'ultrastructure des DC marquées SPIO recouvertes de polymères chargés différemment a été observée via MET. Les DC traitées avec SPIO semblaient denses en électrons par rapport aux cellules non traitées, et de nombreuses SPIO étaient regroupées dans le cytoplasme. Le SPIO/A ⁺ ont été engloutis par les endosomes dans le cytoplasme, alors qu'une quantité plus élevée de SPIO/D ⁻ ont été trouvées dans le cytoplasme des CD, et presque toutes ces nanoparticules étaient entourées de structures membranaires à plusieurs couches qui ressemblaient à des lysosomes (Fig. 4b). Nous avons examiné si le SPIO de charge opposée pouvait déclencher différents niveaux d'IL-1β. D'après nos résultats, les DC chargés avec SPIO/A ⁺ et SPIO/D ⁻ induit une sécrétion dose-dépendante d'IL-1β. Quelle que soit la concentration, nous avons trouvé que SPIO/D ⁻ induit des niveaux significativement plus élevés d'IL-1β que SPIO/A ⁺ (Fig. 4c). En raison de la corrélation évidente entre l'IL-1β et la voie TLR3, pour étudier plus avant l'effet de l'IL-1β sur l'activation des cellules T, les CD ont été dérivées de souris knock-out TLR3 et co-cultivées avec SPIO/A ⁺ , SPIO/D ⁻ , et OVA. Les DC chargés avec SPIO/A ⁺ + OVA pourrait activer efficacement B₃ Cellules T Z, ce qui signifie que la molécule TLR3 dans les CD était absolument nécessaire pour la présentation croisée (Fig. 4d).

SPIO enduit de charges différentes a affecté la présentation croisée des DC et la sécrétion d'IL-1β. un Le potentiel zêta dépendant du pH de SPIO recouvert de molécules différemment chargées. b Emplacements des nanoparticules avec des charges différentes dans les DC sous MET. c IL-1β induite par SPIO recouverte de molécules différemment chargées. d Présentation croisée de SPIO/A ⁺ +OVA et SPIO/D ⁻ + OVA par les DC via la voie TLR3

SPIO modifié avec des revêtements chargés de manière opposée a favorisé la présentation croisée d'antigènes par les CD humains et a été affecté par l'IL-1β

Pour explorer la relation entre l'IL-1β et la présentation croisée, nous avons sélectionné l'inhibiteur de la caspase-1 YVAD et avons constaté qu'il pouvait inhiber de manière significative la sécrétion d'IL-1β des CD humaines après un prétraitement avec 50 μM de lipopolysaccharide (LPS) pendant 3 h (Fig. . 5a). De plus, nous avons découvert que YVAD pouvait inhiber la sécrétion d'IL-1β par les DC humaines causée par SPIO/A ⁺ et SPIO/D ⁻ (Fig. 5b). Nous avons ensuite étudié si les CD humaines pouvaient être utilisées comme APC efficaces et présenter le CMV pp65 de manière croisée aux cellules T spécifiques du CEF. Pour mesurer la présentation croisée de l'antigène, une coloration intracellulaire (ICS) a été introduite pour déterminer le pourcentage de CD3 ⁺ spécifique de l'antigène CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ et CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Cellules T par FCS. DC chargés avec SPIO/A ⁺ combiné avec la protéine CMV pp65 induit plus de CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ et CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ lymphocytes T que les DC chargés de SPIO/D ⁻ . Nos données ont montré que l'inhibiteur de caspase-1 YVAD augmentait significativement les réponses des lymphocytes T induites par le SPIO/D ⁻ + protéine CMV pp65, alors qu'elle inhibe en partie les réponses des lymphocytes T induites par le SPIO/A ⁺ + protéine CMV pp65 (Fig. 5c, d). Ces résultats ont indiqué qu'un niveau modéré d'activation de l'IL-1β est nécessaire pour une présentation croisée efficace et qu'un niveau élevé d'activation de l'IL-1β supprime la présentation croisée dans les DC.

SPIO revêtu de charges opposées affecte la fonction des DC humaines via la voie IL-1β. un Après un prétraitement par LPS pendant 3 h, les CD humaines ont été incubées avec des concentrations croissantes d'YVAD (1, 10, 25 et 50 μM), puis les surnageants ont été collectés pour un ELISA d'IL-1β. b YVAD peut inhiber la sécrétion d'IL-1β par les DC humaines via SPIO/D ⁻ . SPIO/A ⁺ , et SPIO/D ⁻ affecter la présentation croisée DC influencée par IL-1β. c CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ et d CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Les lymphocytes T ont été analysés par coloration intracellulaire à l'aide de FCS

Discussion

L'immunothérapie est un axe de recherche dans les études cliniques et expérimentales depuis le développement de la biotechnologie. Cependant, les essais cliniques précédents de vaccins DC traditionnels conçus pour susciter l'immunité n'ont pas induit de réponses immunitaires suffisantes [26]. Les nanoparticules représentent un type d'adjuvant et peuvent favoriser la fonction des DC pour activer les cellules T [27]. Les caractéristiques les plus caractéristiques de notre SPIO incluent leur biocompatibilité et leur application du marquage des DC en tant qu'adjuvant immunitaire. Les images MET montrent que nos SPIO ont une taille moyenne de 8,7 nm à l'état sec et une forme sphérique (Fig. 1a). La coloration au bleu de Prusse a démontré que les SPIO sont susceptibles d'être phagocytées par les CD (Fig. 1e), indiquant ainsi l'efficacité de l'ingestion.

Il a été rapporté que SPIO avait de larges applications biomédicales, telles que le marquage cellulaire, l'administration de médicaments, l'IRM et l'hyperthermie magnétique [28], qui sont toutes des applications nécessitant une biocompatibilité. Par conséquent, si les DC marquées avec SPIO ont une influence sur l'apoptose des DC doit être étudiée. Nos données suggèrent qu'il n'y avait pas de différence significative dans l'apoptose des DC lorsque les DC étaient marquées avec moins de 50 μg/mL de SPIO (Fig. 2b). Dans l'étude suivante, nous avons choisi la protéine OVA comme protéine modèle et B₃ Les cellules T Z en tant que cellules T efficaces pour observer si SPIO peut affecter la présentation croisée des DC. Nos résultats indiquent que les DC marquées SPIO peuvent grandement faciliter la présentation croisée de l'OVA et l'activation de B₃ Cellules T Z. Les molécules de surface CD80 et CD86, qui sont des marqueurs de DC matures, sont deux facteurs de costimulation essentiels nécessaires à l'activation des lymphocytes T. A 25 μg/mL, le B₃ activé Les cellules T Z ont augmenté avec la dose de nanoparticules et se sont finalement stabilisées (Fig. 2a). De plus, l'expression de CD80 et CD86 à la surface des CD a atteint un maximum (Fig. 2c). Par conséquent, nous avons adopté la concentration de 25 μg/mL et avons constaté que l'apoptose des CD est indépendante du temps (Fig. 2d), ce qui a prouvé les excellentes fonctions nanoadjuvantes et la biocompatibilité de SPIO.

Pour examiner l'influence de SPIO sur la migration des DC, nous avons utilisé des EGFP-DC, qui présentaient une fluorescence verte sous la microscopie confocale à fluorescence, pour co-cultiver avec 25 μg/mL de SPIO pendant 12 h. Nous avons observé que l'expression de la fluorescence EGFP ne faiblit pas après le marquage SPIO. En fin de compte, la migration des CD vers les organes lymphoïdes secondaires est le paramètre clé pour évaluer l'efficacité des vaccins à base de CD. Dans notre étude précédente, au cours des 24 premières heures, les DC marquées SPIO n'étaient pas détectées en quantité significative dans les ganglions lymphatiques secondaires [29]. Pour déterminer davantage si ce phénomène a changé avec le temps, des EGFP-DC marqués et non marqués ont été collectés et injectés dans les coussinets plantaires de souris pour évaluer le potentiel de SPIO dans la migration des CD. Nos résultats ont montré que la fluorescence verte est apparue dans l'ILN aux jours 4 et 7 (Fig. 3d-f) démontrant ainsi que SPIO peut faciliter la migration des EGFP-DC vers les ganglions lymphatiques secondaires. Cette propriété peut être appliquée pour restreindre la métastase des tumeurs et activer une plus grande quantité de cellules CTL dans plus de ganglions lymphatiques.

Dans notre étude, nous avons exploré les propriétés adjuvantes de SPIO de charge opposée et le mécanisme possible sous-jacent aux changements dans la fonction des DC. Il a été démontré que la charge de surface des nanoparticules d'oxyde de fer a une influence sur l'efficacité d'absorption cellulaire [30, 31]. Dans nos recherches précédentes, nous avons signalé que la SPIO cationique pouvait améliorer la présentation croisée de l'antigène et, par conséquent, l'activation des cellules T, tandis que la SPIO anionique était associée à l'autophagie. [16] Plusieurs nanoparticules métalliques peuvent induire des réponses inflammatoires [32, 33]. Il a été rapporté que les nanoparticules d'oxyde de fer activent NLRP3, rompent les membranes des lysosomes, libèrent la cathepsine B et induisent la sécrétion d'IL-1β [34]. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que les nanoparticules de SPIO de charge opposée pourraient remplir différentes fonctions pour stimuler la production d'IL-1β dans les DC murines et humaines. Sur la figure 4a, notre analyse du potentiel zêta a montré que le SPIO revêtu d'APTS portait des charges positives, tandis que le SPIO revêtu de DMSA portait des charges négatives. Sous le MET, nous avons constaté que des SPIO chargées différemment étaient regroupées dans différentes positions dans le cytoplasme (Fig. 4b). Pour étudier la différence entre la présentation croisée de SPIO/A ⁺ et SPIO/D ⁻ , nous avons exploré la sécrétion d'IL-1β dans les DC murines induites par des nanoparticules chargées différemment. Nous avons évalué les réponses des DC murines après traitement avec SPIO/A ⁺ et SPIO/D ⁻ . Exposition à SPIO/D ⁻ induit l'activation manifeste de la sécrétion d'IL-1β par rapport à l'exposition à SPIO/A ⁺ (Fig. 4c). Ce phénomène a en partie révélé que la présentation croisée de l'antigène induite par SPIO/D ⁻ n'est pas aussi efficace que celle induite par SPIO/A ⁺ . En plus de l'analyse CPRG de l'augmentation de B₃ Z T cell activation after the coculture of murine DCs with SPIO/A ⁺ +OVA demonstrated that positively charged nanoparticles can perform better when used as immune adjuvants. Toll-like receptors (TLRs) are of importance for triggering immune responses, such as TLR3, and they can ultimately result in the production of inflammasomes, the activation of caspase-1 protein, and secretion of cytokine IL-1β [35]. To demonstrate whether TLR3 is related to the antigen cross-presentation influenced by our nanoadjuvant, TLR3 knockout DCs were employed in our study. TLR3 ^−/− DCs loaded with SPIO/A ⁺ +OVA and SPIO + OVA effectively stimulated the B₃ Z T cell activation (Fig. 4d), which indicates that the TLR3 molecule in DCs was necessary for cross-presentation. Collectively, these results elucidated that differently charged polymers on the surface of nanoparticles should be considered when investigating their synergistic effects on activated immune responses.

Our data show that the oppositely charged nanoparticles could induce the production of IL-1β, whereas SPIO/D ⁻ could hyperactivate the secretion of IL-1β. However, compared with SPIO/A ⁺ , SPIO/D ⁻ induced a lower level of B₃ Z T cell activation. Therefore, we speculate that aberrant IL-1β production may contribute to cellular dysfunction in DCs. Most studies on nanomaterial adjuvants exploit DCs from mice, whereas few have used DCs from humans [36, 37]. To further verify our hypothesis, we used YVAD, which has been proven to be an effective caspase-1 inhibitor (Fig. 5a, b), to suppress IL-1β secretion from human DCs. CMV pp65 protein was selected as the model antigen, and CEF-specific T cells expanded in vitro were used as responder cells. The CMV pp65 protein is an immunological dominant protein that readily activates CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells to produce cytokines, particularly IFN-γ [38]. CEF peptide was used as a positive control to verify that the addition of YVAD would not affect the activation of T cells because it can be presented to the T cells directly. Intriguingly, with the use of YVAD, the T cell responses in the SPIO/A ⁺ group were slightly restrained, while the responses in the SPIO/D ⁻ group increased (Fig. 5c, d). The influence of IL-1β on DC cross-presentation provided conclusive evidence that a low level of IL-1β induced by SPIO/A ⁺ is needed for antigen cross-presentation, and a high level of IL-1β in the cytosol will inhibit the function of DCs.

Conclusions

As shown in the graphical abstract in Fig. 6, SPIO can promote the maturation, migration, and cross-presentation of DCs. Moderate IL-1β activity is partly related to the antigen cross-presentation of DCs. In addition, negatively charged nanoparticles can activate excessive IL-1β and subsequently inhibit the functions of DCs. In summary, our results indicate that SPIO exhibit many biological properties and have promising adjuvant potential. These findings will help identify the optimal choice of nanoadjuvants for the development of DC vaccines in the future.

Graphical abstract of SPIO as a nano-adjuvant for DCs. SPIO enhances the function of DCs by promoting the loading of DCs; thus, SPIO-labeled DCs can migrate to the ILNs active in an immune organ and may offer a new approach in cancer immunotherapy. Anionic-charged SPIOs activate protective IL-1β responses by triggering caspase-1 in DCs, thereby impairing antigen presentation to active T cells

Abréviations

APCs:

Antigen-presenting cells

APTS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

ATP:

Adenosine triphosphate

CPRG:

Chlorophenol red-β-d-galactopyranoside

CTL:

Cytotoxic T cell

DAMPs:

Damage-associated molecular patterns

DC :

Dendritic cell

DMSA:

Meso-2, 3-dimercaptosuccinic acid

EGFP:

Enhanced green fluorescent protein

IL-1β:

Interleukin-1β

MHC-I:

Major histocompatibility complex class I

NLRP3:

NACHT, LRR, and PYD domains-containing protein 3

OVA:

Ovalbumin

PAMPs:

Pathogen-associated molecular patterns

SPIO:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

SPIO/A ⁺ :

SPIO coated with APTS

SPIO/D ⁻ :

SPIO coated with DMSA

TLRs:

Toll-like receptors