Potentiel antioxydant des extraits d'Artemisia capillaris, Portulaca oleracea et Prunella vulgaris pour la biofabrication de nanoparticules d'or et l'évaluation de la cytotoxicité

Introduction

L'intérêt pour les nanoparticules métalliques a considérablement augmenté en raison de leur large éventail d'applications [1]. En particulier, les nanoparticules d'or (AuNPs) ont une multitude d'applications précieuses en tant que véhicules d'administration de médicaments/gènes, catalyseurs, agents d'imagerie et capteurs chimiques/biologiques [2]. Une variété de méthodes chimiques et physiques, telles que la pulvérisation cathodique ionique, la micelle inverse et la réduction chimique, sont disponibles pour la fabrication des AuNP. Cependant, ces méthodes sont limitées par les préoccupations concernant leur coût et leur toxicité potentielle. L'utilisation d'extraits végétaux dans la biofabrication (ou synthèse verte) d'AuNPs présente des avantages par rapport aux autres méthodes, ce qui en fait une alternative extrêmement prometteuse [2]. Le processus de biofabrication est rentable et facile à étendre. Il utilise des matériaux respectueux de l'environnement et présente des activités synergiques en combinant les activités de deux matériaux (AuNPs et extraits de plantes). La biofabrication n'introduit pas d'agents réducteurs chimiques nocifs lors de la synthèse, ce qui rend le processus entièrement vert. De plus, cette caractéristique augmente la biocompatibilité des AuNPs résultantes et augmente leur stabilité. Divers composés phytochimiques dérivés d'extraits de plantes sont utilisés non seulement comme agents réducteurs, mais également comme agents de coiffage et de stabilisation [3].

Artemisia capillaris appartient au genre Artemisia , qui est l'un des plus grands genres de la famille des Astéracées [4]. Depuis l'Antiquité, A. capillaires a été largement utilisé comme médicament à base de plantes en raison de ses divers effets pharmacologiques, qui incluent des activités antibactériennes, anti-inflammatoires, antioxydantes et hépatoprotectrices. Des études antérieures ont attribué ces effets aux constituants actifs de A. capillaires , y compris la capilline, le capillene, la scoparone et le -sitostérol [4,5,6]. Portulaca oleracea , une succulente annuelle de la famille des Portulacaceae, présente divers effets pharmacologiques, tels que des activités antibactériennes, antifongiques, anti-inflammatoires, antioxydantes et antiulcérogènes. Il a été démontré que ces effets résultent de divers composants actifs, notamment des alcaloïdes, des acides gras, des flavonoïdes, des polysaccharides et des terpénoïdes [7, 8]. Prunella vulgaris est une plante herbacée vivace de la famille des Lamiacées. Un certain nombre d'études ont démontré les activités antivirale [9], anticancéreuse [10], immunomodulatrice [11], antioxydante [11, 12] et hypoglycémiante [13] de P. vulgaris . Les principaux composants actifs qui contribuent à ces effets sont les acides organiques, les acides phénoliques et les triterpénoïdes, y compris l'acide linolénique, l'acide palmitique, cis- et trans- acides caféique, acide rosmarinique, acide oléanolique et acide ursolique [14].

Un écart important existe souvent entre les résultats in vitro et in vivo dans la recherche sur les nanoparticules en raison de la « couronne protéique ». En entrant dans un environnement biologique, la surface des nanoparticules se recouvre d'un revêtement de diverses protéines, appelé couronne protéique [15]. Les nanoparticules de protéines recouvertes de couronne pénètrent dans la cellule et influencent l'absorption cellulaire, la cytotoxicité, la biodistribution, l'excrétion, la réponse cellulaire, la libération de médicaments et l'efficacité thérapeutique [16]. Fait intéressant, les propriétés physico-chimiques des nanoparticules métalliques, telles que leur forme, leur taille, leur charge de surface et leur rugosité de surface, affectent profondément l'adsorption des protéines sériques lors de la formation de la couronne protéique [17]. Shannahan et ses collègues ont rapporté que la formation d'une couronne protéique sur des nanoparticules d'argent (AgNPs) médie la toxicité cellulaire contre les cellules épithéliales pulmonaires de rat et les cellules endothéliales aortiques de rat via récepteurs charognards [18]. L'albumine sérique affecte les AgNPs colloïdaux inclus dans l'hydrogel en réduisant leurs effets antibactériens et cytotoxiques [19].

Dans le présent rapport, nous avons évalué les activités antioxydantes, y compris l'activité de piégeage des radicaux libres, la teneur totale en phénols et le pouvoir réducteur, des extraits aqueux de A. capillaires , P. oléracée , et P. vulgaris . Par la suite, la biofabrication d'AuNPs à l'aide de ces trois extraits a été menée pour étudier comment les activités antioxydantes des extraits affectent la couleur de la solution colloïdale et la forme de la bande de résonance plasmonique de surface (SPR) des AuNPs. Ci-après, les AuNPs biofabriquées sont nommées d'après le nom scientifique de chaque plante :les AuNPs obtenues à partir de l'extrait de A. capillaires sont appelés AC-AuNPs, les AuNPs obtenus en utilisant l'extrait de P. oléracée sont appelés PO-AuNPs, et les AuNPs obtenus en utilisant l'extrait de P. vulgaris sont appelés PV-AuNPs. L'activité antioxydante du P. vulgaris l'extrait était le plus élevé; ainsi, nous avons caractérisé les PV-AuNPs par diverses méthodes spectroscopiques et microscopiques, y compris la spectrophotométrie UV-visible, la microscopie électronique à transmission à haute résolution (HR-TEM), la diffraction des rayons X à haute résolution (HR-XRD) et le plasma à couplage inductif spectroscopie d'émission optique (ICP-OES). La taille hydrodynamique des PV-AuNPs a été mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) avec le potentiel zêta. En outre, nous avons examiné l'activité antioxydante des PV-AuNPs en surveillant l'activité de piégeage des radicaux 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH). La cytotoxicité contre trois cellules cancéreuses a été étudiée par un test au tétrazolium soluble dans l'eau (WST) en présence ou en l'absence de sérum bovin fœtal (FBS) en culture cellulaire. Les cellules cancéreuses suivantes ont été utilisées :adénocarcinome colorectal humain (HT-29), cellule d'adénocarcinome du sein humain (MDA-MB-231) et cellule d'adénocarcinome canalaire du pancréas humain (PANC-1).

Méthodes

Matériaux

Chlorure d'or de potassium (III) (KAuCl₄ ), hydroxytoluène butylé (BHT), phosphate de sodium monobasique, phosphate de sodium dibasique, acide trichloracétique, réactif phénol de Folin-Ciocalteu, carbonate de sodium, acide gallique, tartrate de potassium et de sodium, bicarbonate de sodium, acide sulfurique, 2,2′-azino-bis- L'acide 3-éthylbenzthiazoline-6-sulfonique (ABTS), le persulfate de potassium et le d-(+)-glucose ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le DPPH a été acheté chez Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). L'hexacyanoferrate (III) de potassium a été obtenu auprès de Wako (Osaka, Japon). Du sulfate de sodium, de l'heptamolybdate d'hexa-ammonium tétrahydraté et de l'arséniate d'hydrogène disodique heptahydraté ont été achetés auprès de Junsei (Tokyo, Japon). Le chlorure de fer (III) a été obtenu auprès de Duksan (Gyeonggi, République de Corée) et le sulfate de cuivre pentahydraté a été obtenu auprès de Deajeng (Gyeonggi, République de Corée). Les autres réactifs étaient de qualité analytique et utilisés tels que reçus. Le milieu Eagle modifié par Dulbecco à haute teneur en glucose (DMEM), la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL), la trypsine-EDTA (0,5 %, sans rouge de phénol) et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été achetés auprès de Gibco (Thermo Fisher Scientific, MA, États-Unis). FBS a été obtenu auprès de GE Healthcare HyClone™ (Victoria, Australie).

Instruments

Un spectrophotomètre Shimadzu UV-2600 a été utilisé pour acquérir des spectres UV-visible et observer la SPR (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japon). Les informations concernant la taille et la forme des particules ont été obtenues à partir d'images HR-TEM. Pour acquérir des images HR-TEM, un instrument JEM-2100F fonctionnant à 200 kV a été utilisé (JEOL, Tokyo, Japon). Une solution colloïdale de PV-AuNPs a été chargée sur une grille de cuivre recouverte de carbone (carbone de type B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA). La grille chargée d'échantillons a été séchée à l'air à température ambiante. Un diffractomètre Rigaku Miniflex (40 kV, 30 mA) a été utilisé pour acquérir le diagramme HR-XRD avec une source de rayonnement CuKα (λ = 1.54056 Å) dans la plage de 10º à 80° (2θ échelle) (Rigaku, Japon). Un lyophilisateur FD5505 a été utilisé pour préparer des échantillons en poudre pour l'analyse HR-XRD (Il Shin Bio, Séoul, République de Corée). Pour estimer le rendement de la réaction, l'ICP-OES a été réalisée sur un instrument Perkin Elmer Optima 8300 (Waltham, MA, USA). Une centrifugation a été effectuée (18 500g force, 7 h, 18 °C), et le surnageant a été récupéré. Deux échantillons, c'est-à-dire la solution colloïdale PV-AuNP et le surnageant, ont été soumis à une analyse ICP-OES. Une centrifugeuse Eppendorf 5424R a été utilisée pour la centrifugation (Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne). La taille hydrodynamique et les potentiels zêta ont été mesurés par l'analyseur NanoBrook 90 Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA).

Préparation des Extraits Aqueux de A. capillaires , P. oléracée , et P. vulgaris

Les parties aériennes séchées de P. vulgaris et A. capillaires , y compris les fleurs et les feuilles, ont été achetés auprès d'Omniherb (Daegu, République de Corée), et P. oléracée a été obtenu auprès de Handsherb (Youngchun, République de Corée). Des extraits aqueux des parties aériennes de chaque plante ont été préparés par sonication (WUC-A22H, Daihan Scientific Co. Ltd., République de Corée). Pour chaque plante, 100 g de la plante hachée ont été extraits trois fois avec de l'eau déminéralisée (1000 mL). La procédure d'extraction comprenait la sonication des plantes à 25 °C pendant 3 h. L'extrait aqueux a été filtré et le filtrat a été lyophilisé dans un lyophilisateur sous vide (FD8518, IlShinBioBase Co. Ltd., République de Corée). Enfin, la poudre d'extrait de chaque plante a été obtenue et conservée à − 20 °C avant utilisation.

Activité de nettoyage des radicaux DPPH

Dans chaque puits d'une microplaque à 96 puits, 20 μL de chaque extrait ont été mélangés avec une solution de radicaux DPPH dans l'éthanol (0,1 mM, 180 μL) pour donner plusieurs concentrations finales de l'extrait (31,25 μg/mL, 62,5 μg/mL, 125 μg/mL et 250 μg/mL). La plaque a été incubée à l'obscurité pendant 30 min à température ambiante, puis l'absorbance de chaque puits a été mesurée à 517 nm à l'aide d'un lecteur multi-détection (Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Le BHT a été utilisé comme standard. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. L'absorbance des AuNPs a été soustraite de l'absorbance de chaque échantillon pour éliminer l'absorbance intrinsèque des AuNPs à 517 nm.

Activité de nettoyage radical ABTS

Le cation radical ABTS a été préparé par la réaction d'un 1:1 (v/v ) mélange d'une solution d'ABTS 7,4 mM et d'une solution de persulfate de potassium 2,6 mM pendant 24 h dans l'obscurité à température ambiante. La solution de radicaux ABTS a été diluée avec de l'éthanol à une absorbance de 0,74 à 730 nm pour les mesures. Dans chaque puits d'une microplaque à 96 puits, la solution radicalaire ABTS dans l'éthanol (180 μL) a été ajoutée à 20 μL de chaque extrait (concentrations finales de l'extrait, 15,63 μg/mL, 31,25 μg/mL, 62,5 μg/mL, et 125 μg/mL). Après 10 min d'incubation dans l'obscurité à température ambiante, l'absorbance de chaque puits a été mesurée à 730 nm à l'aide d'un lecteur multi-détection. Une solution de vitamine C a été préparée comme standard. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Réduction de puissance

Des volumes égaux (500 μL) de diverses concentrations d'extraits ont été mélangés avec du tampon phosphate 0,2 M (pH 6,6, 500 μL) et de l'hexacyanoferrate(III) de potassium à 1 % (500 μL). Les concentrations finales des extraits étaient de 52,1 μg/mL, 104,2 μg/mL, 208,3 μg/mL et 416,7 μg/mL. Chaque mélange a été incubé à 50°C. Après 20 min, de l'acide trichloroacétique (10 %, 500 μL) a été ajouté au mélange, suivi d'une centrifugation à 3 400g forcer pendant 10 min. Ensuite, une solution de chlorure de fer (0,1 %, 100 μL) a été ajoutée à 500 μL de surnageant. Après 10 min, l'absorbance du mélange réactionnel a été mesurée à 700 nm à l'aide d'un lecteur multi-détection. Le BHT a été utilisé comme standard. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Contenu phénolique total

La relation entre l'activité antioxydante et la teneur en composés phénoliques a été étudiée. Vingt microlitres de l'extrait ont été mélangés avec 100 μL de réactif de Folin-Ciocalteu (dilué 10 fois avec de l'eau déminéralisée) et 80 μL de carbonate de sodium (7,5%, p/v ). La réaction a été effectuée dans l'obscurité à température ambiante. Après 30 min, l'absorbance à 765 nm a été mesurée et la teneur totale en composés phénoliques a été déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage construite avec de l'acide gallique. Toutes les déterminations ont été effectuées en triple.

Biofabrication des PO-AuNPs, AC-AuNPs et PV-AuNPs

Deux solutions mères ont été préparées avant les réactions de biofabrication :le chlorure de potassium-or(III) (10 mM) et l'extrait (2 %, p/v ). La solution mère de chaque extrait (2%) a été centrifugée (18 500g force, 30 min, 18 °C). Le surnageant a été récupéré et utilisé pour la réaction de biofabrication. Les concentrations finales ont été ajustées à 0,5 mM de chlorure de potassium-or(III) et à 0,05 % (p/v ) extrait dans un flacon en verre de 2 mL pour la biofabrication d'AuNPs. Après avoir mélangé les sels d'Au avec l'extrait, l'incubation a été réalisée à 37 °C dans une étuve sèche pendant 5 h. Ensuite, des spectres UV-visible ont été acquis dans la plage de 300 à 800 nm.

Culture cellulaire

Trois cellules cancéreuses (HT-29, PANC-1 et MDA-MB-231) ont été achetées auprès de la Korean Cell Line Bank (Séoul, République de Corée). Les cellules ont été cultivées dans du DMEM à haute teneur en glucose additionné de 10 % de FBS, de pénicilline (100 unités/mL) et de streptomycine (100 μg/mL). Les cellules ont été cultivées à 37 °C (fourni 5% CO₂ ) dans un incubateur et a maintenu environ 80 % de confluence avant la trypsinisation.

Cytotoxicité

Le kit EZ-CYTOX de DoGenBio (Gyonggi, République de Corée) a été utilisé pour le test WST afin d'évaluer la cytotoxicité contre les cellules cancéreuses. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 5,0 × 10 ³ cellules/puits. L'incubation a été réalisée pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C sous un CO₂ (5 %) atmosphère. Après incubation, le milieu a été jeté. Ensuite, différentes concentrations de PV-AuNPs (0, 29,9, 59,8, 119,6, 239,2 et 478,3 μg/mL sur la base de la concentration en Au mesurée par analyse ICP-OES) ont été ajoutées aux cellules avec le milieu de culture en présence ou absence de FBS. Après encore 24 h d'incubation à 37 °C dans l'incubateur, le réactif EZ-CYTOX (10 μL) a été ajouté, et les cellules ont été incubées dans un CO₂ incubateur pendant 1 h supplémentaire. L'absorbance a été mesurée à 450 nm en utilisant un lecteur multimode hybride Cytation (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). L'absorbance intrinsèque des PV-AuNP a interféré avec la mesure de la cytotoxicité à 450 nm. Par conséquent, l'absorbance de fond des PV-AuNPs a été soustraite de l'absorbance de chaque point de données mesurée à 450 nm. L'absorbance de fond des PV-AuNPs a été mesurée dans des conditions sans WST. De plus, le même volume d'eau déionisée a été utilisé comme contrôle à la place des PV-AuNP.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en triple et les résultats sont présentés comme la moyenne   ± erreur standard (SE). La signification des différences a été étudiée à l'aide d'ANOVA (analyse de variance à un facteur) suivie du test de comparaison multiple de Tukey ou du test de comparaison multiple de Newman-Keuls. Les analyses statistiques ont été calculées à l'aide du logiciel GraphPad (logiciel GraphPad version 5.02, San Diego, CA, USA). Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs pour les valeurs de p < 0,05.

Résultats et discussion

Activités antioxydantes des extraits

Des extraits aqueux des parties aériennes de chaque plante ont été obtenus par sonication. Les rendements d'extraction de A. capillaires , P. oléracée , et P. vulgaris étaient respectivement de 14,1 %, 39,12 % et 28,6 %. Le rendement d'extraction le plus élevé a été montré dans P. oléracée , suivi de P. vulgaris et enfin par A. capillaires . Pour évaluer les activités antioxydantes des extraits, nous avons mesuré l'activité de piégeage des radicaux libres, le pouvoir réducteur et la teneur totale en phénols. Les activités de piégeage des radicaux libres des extraits ont été déterminées par des dosages DPPH et ABTS. Le DPPH est largement utilisé pour évaluer l'activité antioxydante des composés phénoliques car le radical DPPH est un radical libre stable qui perd son intensité d'absorbance lorsqu'il est réduit par les antioxydants. Le test ABTS mesure la capacité d'un antioxydant à piéger les radicaux générés par la réaction d'un agent oxydant puissant avec l'ABTS. La réduction de l'absorbance du radical ABTS par des antioxydants aux propriétés donneurs d'hydrogène est évaluée. Les extraits aqueux présentaient des activités de piégeage d'une manière dose-dépendante. Aux concentrations testées (15,63 μg/mL, 31,25 μg/mL, 62,5 μg/mL, 125 μg/mL et 250 μg/mL), l'extrait de P. vulgaris (IC₅₀ 50,35 ± 1,22 μg/mL contre le radical DPPH ; IC₅₀ 38,6 ± 0,44 μg/mL contre le radical ABTS) ont présenté les activités les plus puissantes contre les radicaux DPPH et ABTS suivis de l'extrait de A. capillaires (IC₅₀ 156,72 ± 0.97 μg/mL contre le radical DPPH ; IC₅₀ 147.28 ± 2.95 μg/mL contre le radical ABTS) puis l'extrait de P. oléracée (IC₅₀ 247,33 ± 1,57 μg/mL contre le radical DPPH ; IC₅₀ 305,54 ± 4,86 μg/mL contre le radical ABTS). Notamment, P. vulgaris a montré une activité de piégeage des radicaux libres DPPH plus puissante que le BHT (IC₅₀ 71,37 ± 0,84 μg/mL), qui a été utilisé comme standard (Tableau 1 et Fig. 1a, b). L'extrait de P. vulgaris ont démontré les activités de piégeage des radicaux DPPH et ABTS les plus élevées parmi les trois extraits. Ce résultat impliquait qu'il existerait peut-être plus de composés antioxydants dans P. vulgaris que dans A. capillaires et P. oléracée.

Activités de piégeage radicalaire DPPH et ABTS et pouvoir réducteur des extraits aqueux de A. capillaires , P. oléracée , et P. vulgaris . un Activités de piégeage des radicaux DPPH. b Activités de nettoyage radicales de l'ABTS. c Pouvoir réducteur des extraits. Les données sont présentées comme la moyenne  ± SEM. Les astérisques indiquent l'importance de la différence par rapport à la norme (BHT ou vitamine C) :*p < 0,05, ***i>p < 0,01, ****p < 0,001. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes

Nous avons également examiné les activités antioxydantes des extraits via un dosage de puissance réductrice. En présence d'antioxydants, le ferricyanure de potassium (Fe ³⁺ ) est converti en ferrocyanure de potassium (Fe ²⁺ ), qui réagit avec le chlorure ferrique pour former un complexe ferro-ferreux. Le complexe ferrique-ferreux a une absorbance maximale à 700 nm, qui peut être utilisée pour évaluer le pouvoir réducteur d'un antioxydant. Dans le présent rapport, le pouvoir réducteur est exprimé comme la concentration (μg/mL) de chaque extrait qui a donné une absorbance de 0,7 à 700 nm. Comme le montre la figure 1c, P. vulgaris (162,98 μg/mL) a exercé un pouvoir réducteur remarquablement plus élevé que A. capillaires (235,38 μg/mL) et P. oléracée (396,16 μg/mL). Comme mentionné précédemment, les résultats du pouvoir réducteur ont également indiqué qu'il existerait peut-être plus de composés antioxydants dans P. vulgaris que dans A. capillaires et P. oléracée.

La teneur totale en phénols de chaque extrait a également été étudiée. Il est bien connu que les composés phénoliques sont des antioxydants potentiels et possèdent la capacité de piéger les radicaux en raison de leurs groupes hydroxyle. Ainsi, l'activité antioxydante d'un extrait végétal peut être bien corrélée à sa teneur en phénols. Une courbe d'étalonnage standard a été construite à l'aide d'acide gallique, et cette courbe a montré une relation linéaire (y = 6.0617x + 0.1293, r ² = 0.9983). A l'aide de la courbe étalon, la teneur totale en phénols a été calculée et est exprimée en milligrammes d'équivalent acide gallique (EAG) par gramme d'extrait. Le contenu phénolique total des extraits était de 90,53 ± 6,81 mg GAE/g pour P. vulgaris , 39,88 ± 4,55 mg EAG/g pour A. capillaires , et 18,32 ± 2,76 mg EAG/g pour P. oléracée . La quantité de contenus phénoliques totaux était la plus élevée dans P. vulgaris parmi les trois extraits.

Il y avait une corrélation positive entre les teneurs en phénols totaux et la capacité des extraits à piéger les radicaux ou leur pouvoir réducteur. Pris ensemble, les extraits aqueux de A. capillaires , P. oléracée , et P. vulgaris ont montré des activités antioxydantes significatives. En particulier, l'extrait de P. vulgaris a montré la plus grande activité de piégeage des radicaux contre les radicaux DPPH et ABTS, le pouvoir réducteur le plus fort et la teneur totale en composés phénoliques la plus élevée, ce qui implique que l'extrait de P. vulgaris exercerait la plus forte activité en tant qu'agent réducteur pour la biofabrication des AuNPs. Ces résultats intéressants de biofabrication d'AuNPs en utilisant les trois extraits seront discutés dans la section suivante.

Biofabrication d'AC-AuNPs, PO-AuNPs et PV-AuNPs

Nous avons proposé que l'activité antioxydante de l'extrait affecte fortement le processus de biofabrication des AuNPs. Étant donné que l'activité antioxydante est une force motrice majeure dans la réduction des sels d'Au en AuNP, P. vulgaris , qui a l'activité antioxydante la plus élevée, est capable d'être l'agent réducteur le plus efficace. Le processus de biofabrication a été suivi par spectrophotométrie UV-visible, car les AuNP possèdent un SPR distinctif dans la gamme de longueurs d'onde visible-proche infrarouge. La biofabrication des AuNPs a été réalisée en mélangeant des sels d'Au avec chaque solution d'extrait. Chaque extrait contenait divers composés phytochimiques très efficaces pour la réduction des sels d'Au en AuNP.

La bande SPR distincte des AuNPs a entraîné des changements dans la couleur de la solution initialement jaune pâle au bleu foncé pour les PO-AuNPs, au brun fluorescent pour les AC-AuNPs et au rouge vin pour les PV-AuNPs (Fig. 2) . Les spectres UV-visible ont été enregistrés après incubation à 37 °C dans un four sec pendant 5 h pour observer la bande SPR distincte de chaque ensemble d'AuNPs (Fig. 3). L'absorbance maximale a été observée à 530 nm pour les PV-AuNPs et à 555 nm pour les AC-AuNPs. Dans le cas des PO-AuNPs, une large bande SPR a été observée de 500 à 700 nm. Les trois extraits ont généré des AuNPs avec une bande SPR caractéristique dans les spectres UV-visible. Chaque changement de couleur avec la bande SPR distincte a clairement soutenu la biofabrication réussie des AuNP avec chaque extrait. Nous avons proposé que les trois facteurs liés aux activités antioxydantes (activité de piégeage des radicaux libres, contenu phénolique total et pouvoir réducteur) affectent la biofabrication d'AuNP. L'extrait de P. vulgaris a obtenu le score le plus élevé pour les trois facteurs, suivi de A. capillaires et enfin par P. oléracée . Il est intéressant de noter que les PO-AuNPs se sont agrégés après stockage à température ambiante (25 °C) pendant 30 min. Ce résultat suggère que les PO-AuNPs étaient les plus instables, comme l'activité antioxydante, la quantité de composés phénoliques totaux et le pouvoir réducteur de P. oléracée étaient les plus faibles parmi ces trois extraits. En revanche, les PV-AuNPs ont montré l'absorbance la plus élevée et une solution rouge vin transparente. L'absorbance des AC-AuNPs était comprise entre celle des PO-AuNPs et des PV-AuNPs. Par conséquent, sur la base de ces observations, il a été déterminé qu'une activité de piégeage des radicaux libres, une teneur totale en phénols et un pouvoir réducteur plus élevés du P. vulgaris extrait a entraîné la synthèse d'AuNPs plus stables par rapport aux AuNPs produits par les extraits de A. capillaires et P. oléracée . Collectivement, les bandes SPR maximales ont montré des changements bathochromes et hypochromes avec une diminution de l'activité antioxydante de l'extrait. De plus, la forme de la bande SPR avait tendance à s'élargir avec la diminution de l'activité antioxydante. En conséquence, les PV-AuNPs ont été davantage caractérisés par HR-TEM, HR-XRD, mesures hydrodynamiques de taille et de potentiel zêta. Pour déterminer le rendement de la réaction, une analyse ICP-OES a été réalisée. L'activité antioxydante et la cytotoxicité en présence/absence de FBS ont été évaluées plus avant contre les cellules cancéreuses.

Photographies numériques de PO-AuNPs, AC-AuNPs et PV-AuNPs

Spectres UV-visible des PO-AuNP (ligne noire), AC-AuNP (ligne rouge) et PV-AuNP (ligne bleue)

Images HR-TEM des PV-AuNPs

Les techniques microscopiques sont les outils les plus efficaces pour visualiser les nanoparticules. Avec HR-TEM, la microscopie électronique à balayage et la microscopie à force atomique sont couramment utilisées pour déterminer la taille, la morphologie, la topographie et les structures bidimensionnelles/tridimensionnelles. La taille et la morphologie des PV-AuNPs ont été étudiées avec HR-TEM. Comme le montre la figure 4, diverses formes, notamment des sphères, des triangles, des tiges, des losanges et des hexagones, ont été observées (figure 4a~e). L'observation de structures en réseau dans une tige (Fig. 4f, g) et un triangle (Fig. 4h) a clairement démontré que les PV-AuNPs étaient de nature cristalline. Ce résultat a été fortement soutenu par les résultats d'analyse HR-XRD ultérieurs. La taille de chaque forme de particule a été mesurée à partir des images HR-TEM, et les histogrammes de taille résultants sont illustrés sur la figure 5. Tous les histogrammes ont montré une distribution gaussienne. Des nanoparticules discrètes dans les images ont été sélectionnées au hasard pour obtenir une taille moyenne de chaque forme. Le diamètre des sphères a été déterminé à 23,8 ± 1,3 nm à partir de 250 nanoparticules (Fig. 5a). Fait intéressant, des triangles équilatéraux ont été produits; ainsi, nous avons mesuré les hauteurs de 64 nanoparticules (25,7 ± 2,2 nm, Fig. 5b). Vingt-sept nanoparticules en forme de bâtonnet ont été choisies au hasard pour déterminer la longueur moyenne (28,4 ± 0,4 nm, Fig. 5c). Le rapport d'aspect moyen, défini comme la longueur divisée par la largeur, des tiges a été déterminé à 2,4. Pour la forme du losange, 38 losanges ont été sélectionnés au hasard dans les images. Comme le montre la figure 5d, e, les longueurs moyennes des lignes diagonales longues et courtes ont été mesurées à 22,0 ± 0,6 nm et 15,4 ± 0,3 nm, respectivement. Les PV-AuNP de formes diverses possédaient une taille inférieure à 30 nm, et les tailles ont été comparées à la taille hydrodynamique dans la section suivante.

Images HR-TEM de PV-AuNPs. La barre d'échelle représente a 50 nm, b 50 nm, c 50 nm, d 50 nm, e 10 nm, f 2 nm, g 2 nm et h 2 nm

Histogrammes de taille des PV-AuNPs. un Le diamètre des sphères. b La hauteur des triangles équilatéraux. c La longueur des tiges. d La longueur (longue diagonale) du losange. e La longueur (courte diagonale) du losange

Taille hydrodynamique et potentiel zêta des PV-AuNPs

La taille hydrodynamique et le potentiel zêta sont des caractéristiques importantes dans la recherche sur les nanoparticules pour d'autres applications. Généralement, la taille mesurée à partir des images HR-TEM est inférieure à celle de la taille hydrodynamique, car la taille hydrodynamique reflète les biomolécules liées à la surface des nanoparticules. Comme le montre la Fig. 6a, la taille hydrodynamique a été déterminée à 45 ± 2 nm avec un indice de polydispersité de 0,258, ce qui était plus grand que la taille des sphères mesurées à partir des images HR-TEM (23,8 ± 1,3 nm à partir de 250 nanoparticules) . Ce résultat suggère clairement que les composés phytochimiques de l'extrait se lient à la surface des PV-AuNPs et les stabilisent. De plus, les PV-AuNP possédaient un potentiel zêta négatif de − 13,99 mV (Fig. 6b). Ces résultats ont montré que les composés phytochimiques avec des charges négatives ont très probablement contribué au potentiel zêta négatif. Ce potentiel zêta négatif donne des forces répulsives dans une solution colloïdale de PV-AuNPs conférant sa stabilité. Par conséquent, l'un de nos futurs travaux inclura le criblage phytochimique sur l'extrait de P. vulgaris élucider les composés exacts qui contribuent au potentiel zêta négatif.

Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. un Hydrodynamic size. b Zeta potential

HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs

X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D  = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.

HR-XRD analysis of PV-AuNPs

Reaction Yield of the PV-AuNPs

ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.

Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.

Antioxidant Activity of the PV-AuNPs

The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. The IC₅₀ of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC₅₀ of vitamin C (49.4 μM).

DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration

Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.

Cytotoxicity of the PV-AuNPs

The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.

In vitro cytotoxicity on cancer cells. un HT-29. b MDA-MB-231. c PANC-1

It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.

Conclusions

The aqueous extracts of A. capillaris , P. oleracea , et P. vulgaris exhibited antioxidant activity which was evaluated by free radical scavenging activity, total phenolic content, and reducing power. P. vulgaris exerted the highest antioxidant activity, followed by A. capillaris and P. oleracea . The extract of P. vulgaris possessing the highest antioxidant activity was a very efficient green reducing agent for the biofabrication of AuNPs. The findings of our study demonstrate that the factors of the antioxidant activity, such as the free radical scavenging activity, reducing power, and total phenolic content, are closely correlated with the color of the colloidal solution and the shape of the SPR band of the resulting AuNPs. When the antioxidant activity was high, the resulting AuNPs showed a narrow SPR band with a strong absorbance. In contrast, a broad SPR band was observed for the PO-AuNPs, in which P. oleracea exhibited the lowest antioxidant activity among the three extracts. Furthermore, the PO-AuNPs aggregated easily after storage at ambient temperature. Consequently, the extract of P. vulgaris produced a wine-red colloidal solution of PV-AuNPs with various shapes with a maximum SPR of 530 nm. A face-centered cubic crystalline pattern of PV-AuNPs was confirmed by high-resolution X-ray diffraction analysis. The reaction yield was estimated by ICP-OES to be 99.3%. The hydrodynamic size (45 ± 2 nm) was larger than that measured from HR-TEM images suggesting that phytochemicals bound on the surface of the PV-AuNPs. Furthermore, phytochemicals with negative charges possibly attributed to a negative zeta potential of − 13.99 mV. The antioxidant activity of the PV-AuNPs was dependent on the Au concentration that was assessed based on the DPPH radical scavenging activity. Green-synthesized AuNPs using ginseng-berry and A. pubescens root extracts also showed DPPH radical scavenging activity [20, 21]. The PV-AuNPs showed cytotoxicity against HT-29, PANC-1, and MDA-MB-231 cells. Interestingly, the presence or absence of FBS dramatically affected the cytotoxicity against these cells. This phenomenon was possibly due to the protein corona that surrounded the surface of the nanoparticles.

Currently, AuNPs have diverse applications in nanomedicine as drug delivery vehicles or carriers of anticancer agents such as doxorubicin. P. vulgaris ethylacetate fraction showed cardioprotective effects with a concentration-dependent manner on isolated rat cardiomyocytes subjected to doxorubicin-induced oxidative stress [25]. PV-AuNPs can be applied as doxorubicin delivery vehicles with a cardioprotective ability. Therefore, our subsequent work will explore the anticancer activities of the PV-AuNPs loaded with doxorubicin for future biomedical and pharmaceutical applications. Diverse plant extracts have a potential to be effective reducing agents for biofabricating AuNPs. When the biofabrication reaction is conducted, it is essential to select a plant extract that possesses a high antioxidant activity in order to produce stable AuNPs. Additionally, P. vulgaris extract has a potential to be used as a reducing agent for the green synthesis of other novel metallic nanoparticles with valuable applications in the future.

Abréviations

ABTS:

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

AC-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of A. capillaris

AgNPs:

Silver nanoparticles

AuNP :

Nanoparticules d'or

BHT:

Butylated hydroxytoluene

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

FBS:

Fetal bovine serum

GAE:

Gallic acid equivalent

HR-TEM :

Microscopie électronique à transmission haute résolution

HR-XRD:

High-resolution X-ray diffraction

HT-29:

Human colorectal adenocarcinoma cell

IC₅₀ :

Half maximal inhibitory concentration

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

MDA-MB-231:

Human breast adenocarcinoma cell

PANC-1:

Human pancreas ductal adenocarcinoma cell

PO-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. oleracea

PV-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. vulgaris

SPR:

Surface plasmon resonance

WST assay:

Water-soluble tetrazolium assay