Thiacalix[4]arenes suppriment les effets inhibiteurs des cations Zn sur l'activité myosine ATPase

Contexte

Le problème de la pollution de l'environnement par les métaux lourds et la recherche de moyens de réduire leur impact sur les objets vivants est pertinent [1, 2].

Le zinc est un élément biogénique essentiel pour la plupart des organismes. [3]. Les ions zinc forment des complexes avec de multiples protéines qui remplissent des fonctions métaboliques vitales. L'ion zinc est un composant d'au moins 300 métalloenzymes qui catalysent plus de 50 réactions biochimiques (physiologiques) différentes [4, 5].

Cependant, le zinc est un métal lourd. Il se trouve dans le groupe IIb du tableau périodique des éléments, avec les deux métaux toxiques cadmium et mercure. Néanmoins, le zinc est considéré comme relativement non toxique pour l'homme [6]. Cet élément n'est nocif qu'à doses excessives [7].

Le LD oral₅₀ pour le zinc est proche de 3 g/kg de poids corporel selon la base de données TOXNET de la National Library of Medicine des États-Unis. Il est plus de 10 fois supérieur au cadmium et 50 fois supérieur au mercure [6]. L'excès de la concentration normale de ce microélément chez l'homme est le plus souvent causé par la prise de médicaments et d'additifs biologiquement actifs contenant du zinc redondant dans leur composition. Il a été enregistré comme des cas individuels d'intoxication au zinc à la suite de la consommation d'aliments stockés dans des récipients zingués ou entièrement en zinc. L'oxyde de zinc, le chlorure et le sulfate de zinc sont très utilisés dans l'industrie pour la production de verre; dans la fabrication de fibres artificielles, de peintures au zinc, de céramiques, d'allumettes et de ciment dentaire; dans l'industrie des pâtes et papiers, pour la conservation du bois, l'étamage et la soudure.

Une forte concentration de zinc a altéré la réponse immunitaire [8]. Les niveaux élevés de Zn, Al, Cu et Fe dans le cerveau peuvent faciliter le développement ou la progression de la maladie d'Alzheimer selon certaines études épidémiologiques [9, 10].

Les métaux lourds peuvent affecter la reproduction des femelles à différents stades tels que le début de la vie fœtale, le développement précoce et la maturation. Les cations de métaux lourds peuvent également être la cause d'hypofertilité, d'infertilité, de retard de croissance intra-utérin, d'avortements spontanés, de malformations, de malformations congénitales, de décès postnatal, de vieillissement prématuré et de troubles de l'apprentissage et du comportement [11, 12].

La fonction contractile utérine est associée à l'activité du complexe protéique - l'actomyosine - dans lequel la myosine présente une activité enzymatique, à savoir la capacité d'hydrolyser l'ATP. La myosine ATPase localisée dans le domaine catalytique du sous-fragment-1 (S1 ou tête) transforme l'énergie chimique déposée dans les liaisons macroergiques de l'ATP en mouvement mécanique. En conséquence, la myosine se déplace le long du filament d'actine, provoquant la contraction musculaire. Par conséquent, l'hydrolyse de l'ATP catalysée par la myosine est considérée comme l'un des processus essentiels du mécanisme moléculaire de la fonction myométriale [13, 14].

Le sous-fragment de myosine-1 est une partie N-terminale de la chaîne lourde de myosine qui se compose de deux domaines :le domaine moteur globulaire N-terminal (catalytique) contenant le site ATP-ase et le site de liaison à l'actine, et le domaine régulateur, ou bras de levier responsable du mouvement de la myosine le long des filaments d'actine. Le noyau du domaine moteur de la myosine est formé par une feuille β centrale à sept brins entourée d'hélices . Un grand domaine structurel qui représente six des sept brins du feuillet β central est généralement appelé domaine supérieur de 50 kDa (U50). Une grande fente sépare le domaine supérieur de 50 kDa du domaine structurel bien défini inférieur de 50 kDa (L50) qui est formé par les résidus d'acides aminés de 465 à 590. La région de liaison à l'actine et le site de liaison aux nucléotides de la myosine sont sur côtés opposés de la feuille β à sept brins avec le fragment phosphate du nucléotide à l'arrière de la poche de liaison des nucléotides. La boucle P, le commutateur 1 et le commutateur 2 sont situés dans le domaine supérieur de 50 kDa près du sommet de la grande fente. Les trois motifs de liaison des nucléotides entrent en contact avec la fraction phosphate du nucléotide à l'arrière de la poche de liaison des nucléotides et agissent comme des capteurs de -phosphate [15].

Il a été découvert dans nos études précédentes que les cations de métaux lourds inhibaient l'activité de la myosine ATPase du muscle lisse utérin [16, 17], ce qui peut affecter négativement les propriétés contractiles du myomètre.

L'impact néfaste des métaux lourds sur la contractilité utérine nécessite le développement de substances pharmacologiques capables d'éliminer ces effets nocifs.

Les calixarènes ont actuellement attiré l'attention des chercheurs en tant qu'effecteurs artificiels potentiels pour différents processus biochimiques. Ces composés sont des oligomères synthétiques de phénol macrocyclique qui ont une structure en forme de coupe. Leurs bords supérieur et inférieur peuvent être fonctionnalisés par divers substituants chimiques. Les calix[4]arènes sont formés de quatre fragments d'arène fonctionnalisés et caractérisés par une conformation macrocyclique assez flexible. Les calix[4]arènes ont montré une faible toxicité de la matrice et la capacité de pénétrer dans les cellules. Par conséquent, ces composés sont considérés comme des agents prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments efficaces [18, 19].

Une classe prometteuse de telles substances est constituée par les thiacalixarènes hydrosolubles [18] possédant les groupes de complexation des métaux au niveau de la plate-forme moléculaire macrocyclique. Les calixarènes en raison de leur capacité à former des complexes supramoléculaires avec des cations (bio)métalliques ont également été utilisés dans la recherche biomédicale comme extractants de métaux lourds [20,21,22].

Nous avons montré précédemment que le tétrahydroxy-thiacalix[4]arène-tétrasulfonate (С-798) éliminait les effets inhibiteurs du Pb ²⁺ , Cd ²⁺ , et Ni ²⁺ sur l'hydrolyse de l'ATP catalysée par la myosine S1 du myomètre porcin [23].

Cette étude visait à rechercher l'effet de fortes concentrations de cations zinc et leur action conjointe avec le tétrahydroxy-thiacalix[4]arène-tétrasulfonate (С-798) et le tétrahydroxy-thiacalix[4]arène-tétraphosphonate (C-800) sur la myosine. Activité S1 ATPase de l'utérus. Cette étude était nécessaire pour tester la capacité de ces thiacalixarènes à éliminer les effets indésirables de fortes concentrations de zinc sur l'activité enzymatique de la myosine utérine.

Les thiacalix[4]arènes C-798 et C-800 sont constitués d'une cupule formée de quatre fragments phénoliques modifiés au niveau du bord supérieur par quatre groupes anioniques sulfonate et quatre phosphonate, respectivement. Les deux thiacalix[4]arènes ont des groupes hydroxyle et des atomes de soufre bivalents densément situés sur le bord inférieur leur permettant de chélater les métaux lourds avec la formation de complexes métalliques stables [21] (Fig. 1).

La structure chimique du tétrahydroxy-thiacalix[4]arène-tétrasulfonate (C-798) (a ), tétrahydroxy-thiacalix[4]arène-tétraphosphonate (C-800) (b ), et le schéma du complexe chélatant du thiacalixarène avec cation métallique sur le rebord inférieur (position inversée) (c )

Ce travail est le résultat d'un projet conjoint de l'Institut Palladin de biochimie et de l'Institut de chimie organique du NAS d'Ukraine axé sur l'interaction de la myosine ATPase du myomètre avec les calix[4]arènes qui sont des inhibiteurs ou des activateurs (effecteurs) de la myosine ATPase utérine.

Résultats

Dépendance de l'activité de la myosine S1 ATPase sur Zn ²⁺ Concentration

Il a été constaté que l'effet inhibiteur le plus prononcé sur l'activité de la myosine S1 ATPase de l'utérus était de 5 mM (43 ± 8%, M ± SD) pour les cations Zn. La plage de concentration de Zn ²⁺ était de 0,5 à 5 mM dans le milieu d'incubation (contenant 3 mM d'ATP, 5 mM de Mg ²⁺ , et 0,01 mM de Ca ²⁺ ). Cent pour cent est la valeur de l'activité ATPase sans l'ajout de cations Zn (contrôle) (Fig. 2). Ainsi, les effets indésirables des cations Zn sur l'hydrolyse de l'ATP de la myosine S1 ont été étudiés plus avant avec 5 mM de Zn ²⁺ .

Activité myosine S1 ATPase du myomètre en présence de concentrations de 0,5 à 5,0 mM de cations Zn (M ± SD, n = 6). 100 % est la valeur de l'activité ATPase sans l'ajout de cations Zn

Dépendance de l'activité de l'ATPase de la myosine S1 sur la concentration d'ATP en présence 5 mM Zn ²⁺

Le Zn ²⁺ effet sur l'affinité de l'activité myosine S1 ATPase à son substrat (ATP) a été étudié. Augmentation de la concentration d'ATP dans le milieu d'incubation de 0,5 à 5 mM à un MgCl₂ fixe concentration (5 mM) à la fois dans le contrôle et en présence de 5 mM Zn ²⁺ a abouti à un graphique en forme de dôme avec une valeur maximale de l'activité ATPase à 3 mM d'ATP. La valeur de l'activité enzymatique à ce pic en présence de zinc était 30 % inférieure à celle du témoin (Fig. 3). Les graphiques de la dépendance de l'activité myosine S1 ATPase sur la concentration en ATP dans le contrôle et la présence du 5 mM Zn ²⁺ dans la partie ascendante ont été linéarisés selon la méthode de Lineweaver–Burk [27]. Le calcul des paramètres cinétiques à savoir la constante imaginaire de Michaelis (K _m ) et le taux maximal de myosine S1 ATPase pour l'ATP (V _{max, ATP} ) a révélé que V _{max, ATP} de l'activité enzymatique de la myosine en présence de 5 mM Zn ²⁺ diminué de 1,6 fois (38 ± 7 et 22 ± 6 nmol Pi/min par 1 mg de protéine dans le contrôle et la présence de Zn ²⁺ respectivement, n = 5). La valeur de К _m pour l'hydrolyse de l'ATP par la myosine S1 ne change pas statistiquement, bien qu'elle ait tendance à diminuer (0,49 ± 0,15 mM dans le contrôle, 0,38 ± 0,12 mM en présence de Zn ²⁺ ; M ± SD ; n = 5).

L'influence de 0,5 à 5 mM d'ATP sur l'activité de la myosine S1 ATPase de l'utérus en présence de 5 mM de Zn ²⁺ par rapport à un témoin (M ± SD, n = 5)

Dépendance de l'activité de la myosine S1 ATPase sur Mg ²⁺ Concentration en présence 5 mM Zn ²⁺

L'effet de 5 mM Zn ²⁺ sur Mg ²⁺ La dépendance de la concentration à l'activité ATPase de la myosine utérine a été étudiée. Augmenter le Mg ²⁺ concentration dans le milieu d'incubation de 0,5 à 5 mM à une concentration fixe d'ATP (3 mM) en présence de 5 mM de Zn ²⁺ n'entraîne pas de modification de l'activité de la myosine S1 ATPase. En même temps, le Mg ²⁺ une dépendance à la concentration de l'activité ATPase dans le contrôle (dans les conditions standard) a été détectée. Le niveau le plus élevé d'hydrolyse de l'ATP de la myosine dans le contrôle a été atteint à 3 mM Mg ²⁺ (Fig. 4). Par conséquent, l'activité de l'enzyme myosine S1 de l'utérus ne dépend pas de la concentration de Mg ²⁺ en présence de fortes concentrations de Zn (5 mM).

Dépendance de l'activité de la myosine S1 ATPase au Mg ²⁺ concentration en présence de 5 mM Zn ²⁺ par rapport à un témoin (M ± SD, n = 6)

Sites de liaison Zn dans Myosin S1

La simulation informatique montre que les cations Zn ont plusieurs régions de liaison dans la tête de myosine. L'un d'eux est situé dans la partie inférieure de la fente entre les sous-domaines supérieur et inférieur de 50 kDa, à proximité du site de liaison des nucléotides et directement à proximité de la boucle P. Zn ²⁺ est coordonné avec les atomes d'oxygène Glu177 (longueur de liaison 0,23 et 0,39 nm), avec l'atome d'oxygène Ser178 (longueur de liaison 0,31 nm) et Arg236 (longueur de liaison 0,32 nm).

L'autre région de liaison au Zn est située au bas du sous-domaine supérieur de 50 kDa (Leu218-Asp463, Glu605-Phe621) et à proximité du commutateur 1 (Gly233-Phe246) et de la boucle P. Zn ²⁺ peut se coordonner avec l'atome d'oxygène Glu327 (longueur de liaison 0,21 nm), avec un atome d'oxygène Glu326 (longueur de liaison de 0,34 nm) et un atome d'oxygène Asp323 (longueur de liaison 0,32 nm). Le cation Zn peut également interagir avec la myosine S1 dans la région qui entre en contact avec le commutateur 2, interagissant avec Glu 465 (0,24 nm), Asp468 (longueur de liaison 0,31 nm) et Leu653 (longueur de liaison 0,37 nm). Cette région de liaison est proche du site de liaison de l'actine et de la fente entre les sous-domaines supérieur et inférieur de 50 kDa. Le fond de cette fente est situé dans la poche de liaison à l'ATP. Ces liaisons Zn ²⁺ Les domaines myosine S1 jouent un rôle essentiel dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP. Ces régions subissent des transformations conformationnelles complexes lors du transfert d'énergie du site d'hydrolyse de l'ATP à la surface de liaison à l'actine.

Thiacalix[4]arènes éliminent les effets inhibiteurs du Zn ²⁺ sur l'activité Myosine ATPase

Cent micromolaires de solutions C-800 ou C-798 dans du tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) ont été ajoutées au milieu d'incubation contenant des cations Zn 5 mM pour éliminer l'impact négatif du Zn ²⁺ sur l'activité ATPase de la myosine S1 du muscle lisse utérin. Comme contrôle, il a été utilisé comme activité enzymatique sans ajout de zinc et/ou de thiacalix[4]arènes au milieu d'incubation. Il a été montré (Fig. 5) que le composé C-800 n'affecte pas l'activité ATPase de la myosine S1 du myomètre. Bien que le composé C-798 présente un petit effet inhibiteur sur l'activité de la myosine S1 ATPase qui est très probablement lié à l'extraction d'une certaine quantité de Mg ²⁺ [21], indispensable à la fixation de l'ATP dans le centre actif et à son hydrolyse, à partir du milieu d'incubation. Néanmoins, 100 μM C-798, ainsi que C-800, ont supprimé les effets inhibiteurs de 5 mM Zn ²⁺ sur le processus d'hydrolyse de l'ATP catalysée par la myosine S1.

Effet de 100 μM de C-798 et C-800 sur l'activité ATPase de la myosine S1 en présence de 5 mM de Zn ²⁺ (M ± SD, n = 5–6). 100% est la valeur de l'activité ATPase sans l'ajout de cation Zn. La différence entre le « Zn » et « Zn + C-798 », ainsi qu'entre les valeurs de « Zn » et « Zn + C-800 », est statistiquement significative (p < 0,05) et indiqué par * et **, respectivement

Mécanismes probables de l'action de restauration du C-798 et du C-800 sur l'activité ATPase de la myosine S1 en présence du Zn ²⁺

L'un des mécanismes les plus probables de l'action de restauration du C-798 et du C-800 sur l'activité ATPase de la myosine S1 dans le Zn ²⁺ la présence peut être la capacité des thiacalix[4]arènes à se lier aux cations Zn et, par conséquent, à exclure ces cations du milieu d'incubation. Il était intéressant de savoir si ces thiacalix[4]arènes peuvent se lier aux cations zinc qui sont déjà liés à la myosine.

La simulation informatique a montré que les thiacalix[4]arènes C-798 et C-800 avec des atomes de soufre de pont entre les cycles aromatiques sont dans la conformation de "cône" stabilisé par des liaisons intra-hydrogène entre les groupes phénoliques. La structure minimisée en énergie de ces calix[4]arènes a été obtenue. L'énergie totale du C-798 après la minimisation était de 64,5 kcal/mol. La présence de groupements ionisés sur les jantes calix[4]arène (en particulier les inférieures) augmente significativement la contribution des interactions électrostatiques à l'énergie totale de l'interaction hôte-invité. Nous avons également réalisé la « minimisation » du C-798—Zn ²⁺ complexe; son énergie totale était de 83 kcal/mole.

C-798 était intégré dans la structure de la myosine S1 coopérant avec le cation Zn qui était auparavant lié à la protéine dans la région de la boucle P. Dans ce cas, Zn ²⁺ interagit avec les atomes d'oxygène du bord inférieur et le soufre du pont de C-798 (O3, 0,21 nm ; S1, 0,30 nm ; O2, 0,34 nm). Il est montré que Zn ²⁺ s'écarte dans une certaine mesure des résidus d'acides aminés de la boucle P et affaiblit son interaction avec l'atome d'oxygène Glu177 (longueur de liaison de 0,43 nm) (Fig. 6).

Paramètres géométriques de l'interaction de Zn ²⁺ avec la région de la boucle P de la myosine S1 (a ) et l'influence du C-798 sur la coopération du cation Zn avec cette région (b )

La fixation du C-798 dans la «cavité» de la région de liaison à l'ATP de la myosine se produit avec la participation de plusieurs résidus d'acides aminés. En particulier, le panier hydrophobe du thiacalixarène a fixé par la myosine les résidus d'acides aminés aromatiques de Phe467 et Phe469; les atomes d'oxygène chargés négativement du thiacalixarène interagissent avec les résidus d'acides aminés chargés positivement de Arg570, Asn572 et His689.

L'étude de l'influence du C-798 sur le changement du Zn ²⁺ position lors de l'amarrage dans la zone proche du site de liaison à l'ATP de la myosine a démontré que Zn ²⁺ en présence de thiacalix[4]arène interagit avec les atomes d'oxygène du troisième groupe sulfonyle (O16-0,26 nm ; O15-0,27 nm), n'interagit presque pas avec les atomes d'oxygène Asp134 et Glu326, et la coordination avec Glu327 est beaucoup plus faible (longueur de couplage de 0,43 nm) (Fig. 7). Dans ce cas, le thiacalixarène est fixé dans la « cavité » de la protéine avec la participation de plusieurs résidus d'acides aminés. En particulier, les atomes d'oxygène chargés négativement des groupes thiacalixarène sulfonyle interagissent avec les résidus d'acides aminés chargés positivement de la myosine de Lys188, Lys195 et Gln221.

Paramètres géométriques de l'interaction de Zn ²⁺ dans la zone proche du commutateur de myosine 1 et de la boucle P de la myosine S1 (a ) et l'influence de C-798 sur la coopération de Zn ²⁺ avec cette région (b )

Il est montré que la sphère d'énergie conditionnelle du cation Zn entre en contact et même se chevauche quelque peu avec la surface de propagation des interactions électrostatiques en raison de la présence d'atomes d'oxygène et d'atomes de soufre dans C-798. Cela indique que le cation étudié est en interaction suffisamment étroite avec les atomes chargés négativement des couronnes C-798 supérieure et inférieure. Il est probable que le thiacalixarène tire sur lui-même un Zn ²⁺ , ce qui affaiblit l'interaction des cations avec les résidus d'acides aminés de l'enzyme.

Par conséquent, les résultats de l'amarrage du C-798 dans la région de la myosine S1, qui contient du Zn ²⁺ lié, indiquent la possibilité de l'interaction des groupes fonctionnels C-798 avec le cation Zn. Dans ce cas, la liaison cationique Zn avec les résidus d'acides aminés de la myosine S1 était considérablement affaiblie et la distance entre eux augmente. En conséquence, l'effet indésirable du cation Zn sur l'activité ATPase de la myosine peut être éliminé.

Nous avons également effectué une simulation informatique de l'effet du calix[4]arène C-800, avec un amarrage dans la zone proche de la région de liaison à l'ATP de la myosine S1, pour modifier la géométrie du cation Zn. En même temps, Zn ²⁺ est en contact avec Arg236 (longueur de liaison 0,37 nm), Glu675 (longueur de liaison 0,41 nm) et les atomes des résidus fonctionnels supérieurs calix[4]arène (H26, 2,36 nm ; H30, 2,96 nm ; C30, 0,31 nm ; O5, 3,7 nm ; O16, 0,4 nm ; O7, 0,48 nm ; et O11, 0,51 nm de longueur de liaison). Zn ²⁺ interagit avec le calix[4]arène C-800, similaire au C-798. Le cation est également retiré du site de liaison précédent dans cette région et est en contact avec Asp468 (longueur de liaison de 0,2 nm) et les atomes de la couronne inférieure de calixarène (C4, 1,96 nm ; C14, 2,07 nm ; S3, 2,16 nm ; O2 , 2,26 nm ; C3, 2,97 nm ; C20, 3,10 nm ; O4, 4,2 nm ; C14, 3,0 nm ; et O3, 4,1 nm).

L'amarrage des C-798 et C-800 dans la région du sous-fragment-1 de la myosine a montré que ces thiacalix[4]arènes pouvaient interagir avec les cations Zn se liant aux résidus d'acides aminés de la myosine près du site actif de l'ATPase. Par conséquent, leur effet protecteur pourrait être le résultat de l'affaiblissement de l'interaction entre ces cations et la myosine S1.

Discussion

De nombreuses anomalies de la reproduction féminine sont causées par des troubles du muscle lisse utérin (myomètre). Les métaux lourds ont un effet néfaste sur la contractilité du muscle lisse utérin. Le zinc, métal lourd, est un élément biogénique essentiel pour la plupart des organismes; de fortes doses de cet élément sont toxiques [5]. Plusieurs investigations sur les concentrations millimolaires de Zn ²⁺ sur des objets vivants ont été précédemment décrits [32]. Nous avons constaté que 5 mM Zn ont l'effet inhibiteur le plus prononcé sur l'activité de la myosine S1 ATPase de l'utérus. Ainsi, les effets indésirables des cations Zn sur l'hydrolyse de l'ATP de la myosine S1 ont été davantage étudiés avec cette concentration de Zn ²⁺ . Le calcul des paramètres cinétiques de la myosine S1 ATPase pour l'ATP a révélé que V _{max, ATP} de l'activité enzymatique de la myosine en présence de 5 mM Zn ²⁺ diminué de 1,6 fois. La valeur de К _m car l'hydrolyse de l'ATP ne change pas statistiquement, bien qu'elle ait tendance à diminuer.

La myosine dans des conditions physiologiques est un Mg ²⁺ -ATPase dépendante. Le cation magnésium est impliqué dans la liaison de l'ATP au site actif de la myosine, ainsi que dans l'hydrolyse de l'ATP. Le Mg ²⁺ est coordonné dans le site actif de l'enzyme avec les chaînes latérales des résidus d'acides aminés de myosine Thr-186 et Ser-237 ainsi qu'avec les groupes β- et -phosphate de la molécule d'ATP avec la formation des - et γ- complexe bidenté ainsi qu'avec des molécules d'eau actives, dont l'une effectue une attaque nucléophile sur l'-phosphate ATP [33, 34]. Mg ²⁺ interagit avec les groupes phosphore chargés négativement de l'ATP, les polarise et facilite ainsi une attaque nucléophile sur le -phosphate terminal [14].

Il a été constaté que l'activité myosine S1 ATPase n'est pas sensible à la présence de Mg ²⁺ à une concentration de 5 mM de Zn ²⁺ contrairement au témoin lorsque le zinc était absent dans le milieu d'incubation [35, 36].

L'activité de la myosine ATPase dépend de la nature des cations métalliques et est bien corrélée avec leur rayon ionique. Les rayons ioniques Mg ²⁺ et Zn ²⁺ dans les solutions sont très similaires (0,070 et 0,076 nm, respectivement) [37]. Par conséquent, l'interaction de Zn ²⁺ cations avec le Mg ²⁺ -des sites de liaison de la myosine sont possibles. Ainsi, le Mg ²⁺ -les sites de liaison peuvent être occupés par Zn ²⁺ cations dans ses concentrations élevées. L'activité ATPase de la myosine S1 dans de telles conditions peut être insensible aux cations magnésium. La myosine contient deux sites de haute affinité pour le Mg ²⁺ , et Mg ²⁺ lié à ces sites a un rôle physiologique important dans le processus de transduction d'énergie lors de la contraction musculaire. Il reste encore plusieurs Mg ²⁺ -des sites de liaison en plus du site ATPase dans la molécule de myosine, différant par l'énergie de liaison des ions magnésium et leur affinité [35]. Par conséquent, on peut supposer que Zn ²⁺ peut également se lier à d'autres sites fonctionnellement importants de la myosine S1 qui affectent la liaison et l'hydrolyse de l'ATP.

La simulation informatique montre que les cations Zn ont plusieurs régions de liaison dans la tête de la myosine situées à proximité du site de liaison de l'ATP, à savoir la boucle P et les sous-domaines supérieur et inférieur de 50 kDa switch 2. Ces liaisons Zn ²⁺ Les domaines myosine S1 jouent un rôle essentiel dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP. Ces régions subissent des transformations conformationnelles complexes lors du transfert d'énergie du site d'hydrolyse de l'ATP à la surface de liaison à l'actine.

Les résultats d'analyse obtenus par Zn ²⁺ l'amarrage dans la myosine S1 indique qu'un rôle clé dans la liaison de ce cation à la molécule de myosine joue son interaction avec les groupes chargés négativement des résidus d'acides aminés de l'enzyme, en particulier Glu et Asp.

L'influence néfaste des concentrations toxiques de Zn ²⁺ cations sur l'activité ATPase de la myosine S1 nécessite la recherche de composés pharmacologiques capables d'éliminer l'action de ce métal. Les objets de notre étude étaient le tétrahydroxythiacalix[4]arène-tétrasulfonate (C-798) et le tétrahydroxythiacalix[4]arène-tétraphosphonate (C-800) qui sont capables de chélater les métaux transitionnels et lourds avec la formation de complexes métalliques stables (Fig. 1). La couronne macrocyclique supérieure de C-798 et C-800 contient quatre groupes sulfonate anioniques ou quatre phosphonates, respectivement, qui assurent une bonne solubilité dans l'eau du thiacalixarène et une bonne adhérence aux molécules de protéines en raison des contacts électrostatiques avec les atomes d'azote chargés positivement des fragments d'acides aminés [21 ].

L'amarrage des C-798 et C-800 dans la région de la myosine S1 a montré que ces thiacalix[4]arènes pouvaient interagir avec les cations Zn se liant aux résidus d'acides aminés de la myosine près du site actif de l'ATPase. Par conséquent, leur effet protecteur pourrait être le résultat de l'affaiblissement de l'interaction entre ces cations et la myosine S1. Il a été émis l'hypothèse que les résultats obtenus pourraient être utilisés pour des recherches ultérieures dans le but d'utiliser ces thiacalix[4]arènes comme composés pharmacologiques dans le cas d'intoxications à fortes concentrations de zinc.

Conclusions

Une concentration élevée (5 mM) de cation Zn a inhibé l'activité de la myosine S1 ATPase de l'utérus. L'influence inhibée du Zn est liée à une diminution de la vitesse maximale de l'hydrolyse de l'ATP catalysée par la myosine S1 en présence de 5 mM de Zn ²⁺ . La valeur de К _m pour l'ATP ne change pas statistiquement, bien qu'il ait tendance à diminuer.

Le tétrahydroxythiacalix[4]arène-tétrasulfosphonate (C-798) et le tétrahydroxythiacalix[4]arène-tétraphosphonate (C-800) ont restauré l'activité de la myosine S1 ATPase au niveau de contrôle en présence de 5 mM de Zn ²⁺ .

Les cations Zn ont plusieurs régions de liaison dans la myosine S1 situées à proximité du site actif de l'ATPase. L'amarrage du C-798 et du C-800 dans la région de la myosine S1, qui contient du Zn ²⁺ lié, indique la possibilité de l'interaction de ces fonctions thiacalix[4]arène avec les cations Zn liés. La liaison cationique Zn avec les résidus d'acides aminés de la myosine S1 était significativement affaiblie et la distance entre eux augmente. En conséquence, l'effet indésirable du cation Zn sur l'activité ATPase de la myosine peut être éliminé.

Il est supposé que les résultats obtenus pourraient être utilisés pour des recherches ultérieures dans le but d'utiliser ces thiacalix[4]arènes comme composés pharmacologiques dans le cas d'intoxications à fortes concentrations de zinc.

Méthodes

Réactifs

Les réactifs suivants ont été utilisés :sérum albumine, EGTA, EDTA, ATP, acide ascorbique, Tris, tricine, dithiothréitol, acrylamide, (Sigma, USA), glycine (Merck, Allemagne), N, N′-méthylènebisacrylamide (Acros Organics, Belgique ) N,N,N′,N′-tétraméthylènediamine (Reanal, Hongrie), et réactifs de production nationale (grade R). Les solutions ont été préparées dans de l'eau purifiée sur système Crystal Bio (Adrona, Lettonie). La conductance de l'eau était inférieure à 0,1 μS. La concentration des cations métalliques divalents en solution a été déterminée par la méthode de Mohr.

Isolement du sous-fragment 1 de l'actomyosine et de la myosine

L'actomyosine a été isolée du muscle lisse utérin de porc par la méthode de Barany modifiée telle que décrite dans [17]. La myosine S1 a été obtenue à partir d'actomyosine de porc par la méthode de Suzuki modifiée [24]. The purity of the samples was controlled by PAAG-SDS electrophoresis [25].

ATPase Activity Assay

ATPase activity of myosin S1 was determined in a 96-well plate at 37 °C in an incubation medium (total volume 0.1 ml) of the following composition (mM):Tris-HCl buffer (pH 7.2), 20; KCl, 100; CaCl₂ , 0.01; MgCl₂ , 5; and ATP, 3 (standard conditions). Protein (myosin S1) concentration was 20 μg/ml. Incubation time was 5 min. Samples containing all components of the incubation medium without myosin S1 were taken as control of non-enzyme hydrolysis of ATP. The amount of inorganic phosphate released during ATP hydrolysis reaction was determined by the Chen method [26] by the measurement of optical absorbance of the solution at 820 nm using a microplate reader μQuwant (Biotek ^@ Instruments, Inc., USA) and specified as P_i  nmol/min per 1 mg of protein.

The Zn ²⁺ and thiacalix[4]arene effects on the ATPase activity of myosin S1 were studied using standard incubation medium with solutions of ZnCl₂ and thiacalix[4]arenes at the corresponding concentrations. The value of ATPase activity in the absence of ZnCl₂ and/or calix[4]arenes in the incubation medium was taken as 100% (control).

Kinetic and Statistical Analysis

The values of the imaginary constant of Michaelis (K _m ) and maximal rate of myosin S1 ATPase for ATP (V _{max, ATP} ) were calculated using the graph of the dependence of ATPase activity on the ATP concentration according to Lineweaver–Burk method [27]. Statistical processing of the obtained data was performed using standard methods of variation statistics. Experimental data were analyzed by using the standard software “MS Office” and “Statistica 4.5.” The statistical comparisons were performed using two-way analysis of variances (ANOVA).

Thiacalix[4]Arene Synthesis and Characterization

Tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetrasulphonate and tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetraphosphonate were synthesized and characterized using NMR techniques and IR spectroscopy in the Phosphoranes Chemistry Department of the Institute of Organic Chemistry, NAS of Ukraine. Infrared and NMR spectroscopy confirmed the structure of these synthesized thiacalix[4]arenes. This thiacalix[4]arenes were dissolved in water.

Computer Modeling

Computer modeling of the interaction between ligands (thiacalix[4]arenes, Zn ²⁺ , model bindings) and receptor (myosin S1) was performed using AutoDock software, version 4.2 [28]. We used the three-dimensional enzyme structure with the 1b7t identifier in RSCB PDB in our research [29]. Computer modeling of the thiacalix[4]arene structural peculiarities was carried out using HyperChem 7.01. Molecular dynamics calculations were performed by the MM2 method with the semi-empirical methods (CNDO).

Program AutoDockTools was used for preliminary “processing” of interacting molecules. One hundred runs of Lamarkian genetic algorithms (population size, 100; the maximal number of energy evaluations, 10 ⁶ ) were conducted. To analyze and visualize the docking results, we used the programs Chimera [30] and Yassara [31]. Calculation of the minimal total binding energy was implemented considering Van der Waals forces, electrostatic and hydrophobic interactions, and hydrogen bonds. The optimal ligand positions in the complex “receptor-ligand” were determined according to the energy values obtained by docking software calculator for binding energy in complex “receptor-ligand.” Thus, we selected a series of complexes with the lowest total energy and then calculated the optimal geometry of the complexes and determined the most energetically preferred arrangement of the ligands in the space of myosin subfragment-1 binding domain.

Abréviations

C-798:

Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetrasulfosphonate

C-800:

Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetraphosphonate

CNDO:

Complete Neglect of Differential Overlap (methods)

K _m :

Michaelis constant, the substrate concentration at which the reaction rate of the enzyme is half of the maximal velocity

L50:

Lower 50-kDa domain of myosin

LD₅₀ :

Lethal dose is the amount of an ingested substance that kills 50% of a test sample

MM2:

A class of force fields

Myosin S1:

Myosin subfragment-1

NASU:

National Academy of Science of Ukraine

PDB:

Protein Data Bank

P-loop:

Phosphate-binding loop of myosin

RCSB:

Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

U50:

The upper 50-kDa domain of myosin

V _max :

Maximal velocity of the enzyme

V _{max, ATP} :

V _max for ATP