Évaluation de la sécurité de nanotransporteurs liposomaux administrés par voie intratympanique à l'oreille interne du rat

Résumé

Les nanotransporteurs liposomaux (LPN) offrent une forte charge de médicament et une absorption efficace dans l'oreille interne après administration intratympanique peu invasive. Pourtant, leur biocompatibilité dans cet organe sensible n'avait pas été évaluée systématiquement. Dans cette étude, des LPN — avec ou sans acide gadolinium-tétra-azacyclo-dodécane-tétra-acétique (Gd-DOTA) — ont été injectés par voie transtympanique chez des rats Sprague-Dawley. L'imagerie par résonance magnétique rehaussée au gadolinium (Gd-IRM) a suivi la distribution des LPN et évalué l'intégrité des barrières, tandis que les réponses auditives du tronc cérébral (ABR) ont mesuré la fonction auditive. Les marqueurs inflammatoires (glycosaminoglycanes, acide hyaluronique, CD44, TLR2) et l'apoptose (TUNEL) ont été quantifiés dans les tissus cochléaires. Les résultats montrent une entrée efficace des LPN dans l'oreille interne sans perturber les barrières de l'oreille moyenne ou interne, aucune perte auditive, et aucune élévation des marqueurs inflammatoires ou apoptotiques. Ainsi, l'administration transtympanique de LPN est sûre pour la cochlée du rat et promet pour traiter la perte auditive neurosensorielle.

Contexte

Les LPN sont la plus ancienne plateforme nanothérapeutique en clinique, utilisée avec succès pour le cancer, les maladies infectieuses, l'inflammation et la douleur. Leur grande capacité de charge et leur absorption prouvée dans l'oreille interne les rendent attractifs pour la thérapie otologique. L'administration intratympanique est une approche ciblée rationnelle qui limite l'exposition systémique et est déjà employée cliniquement pour la maladie de Ménière et la surdité brusque neurosensorielle. Bien que des travaux antérieurs aient démontré que des LPN fonctionnalisés par peptides atteignent la cochlée, le profil de sécurité des LPN dans l'oreille interne — particulièrement concernant la fonction barrière, l'inflammation et la viabilité cellulaire — reste inconnu. Cette étude comble cette lacune en évaluant la biocompatibilité des LPN dans l'oreille interne du rat par Gd-IRM, ABR, et analyses histologiques complètes.

L'acide hyaluronique (AH) est un composant majeur de la matrice extracellulaire qui se lie à CD44 et TLR2/4, initiant des voies inflammatoires. L'accumulation d'AH a été liée à une perméabilité et une inflammation accrues dans divers tissus, y compris la cochlée, où des nanoparticules d'argent (AgNP) ont précédemment induit une accumulation d'AH. Par conséquent, AH, CD44 et TLR2 ont été examinés comme marqueurs inflammatoires critiques dans cette étude.

L'objectif était de déterminer si les LPN transtympaniques compromettent l'intégrité de la barrière interne, induisent une inflammation ou causent une perte auditive. La Gd-IRM a évalué la fonction barrière, l'ABR a mesuré les seuils auditifs, et l'immunohistochimie a quantifié AH, CD44, TLR2 et la fragmentation d'ADN apoptotique.

Résultats

Les LPN n'ont pas causé de changements fonctionnels dans la cochlée du rat

La Gd-IRM a démontré que les LPN entraient efficacement dans la cochlée, avec un signal fort dans la scala vestibuli et scala tympani dans les 3 h post-injection (Fig. 2c–f). À 6 h, la distribution du signal devenait homogène dans toute la cochlée, indiquant une équilibration complète (Fig. 2e–f). L'intégrité des barrières sang-périlymphe et sang-endolymphe est restée intacte, comme reflété par des intensités de signal comparables entre oreilles traitées et non traitées (Tableau 1). Les seuils ABR pour clics et rafales tonales (2–32 kHz) n'ont montré aucun décalage significatif à 2, 4 ou 7 jours post-injection, confirmant la fonction auditive préservée (Fig. 3).

Les LPN n'ont pas induit d'accumulation de glycosaminoglycanes dans la cochlée du rat

La coloration acide périodique-Schiff n'a révélé aucune augmentation des glycosaminoglycanes dans les structures cochléaires (limbe spiral, paroi osseuse, strie vasculaire) après traitement LPN ou LPN-Gd comparé aux témoins eau déionisée (Fig. 5, 6). La quantification a confirmé aucune différence statistiquement significative (p > 0,05).

Impact mineur sur la sécrétion d'acide hyaluronique par les LPN

L'immunofluorescence a détecté l'AH principalement dans les cellules du ganglion spiral, cellules basales striales, cellules du sulcus externe, et cellules endothéliales capillaires (Fig. 7). Bien que l'intensité d'AH dans les fibroblastes du ligament spiral ait légèrement diminué après administration de LPN ou LPN-Gd, ce changement ne s'est pas traduit en perméabilité barrière altérée ou perte auditive (Fig. 8).

L'expression de CD44 est restée inchangée après exposition aux LPN

Les cellules CD44-positives étaient abondantes dans la couche cellulaire basale de la strie, ligament spiral, cellules de Deiters, et endothélium capillaire dans tous les groupes, sans différences significatives d'intensité de coloration ou de comptage cellulaire entre oreilles traitées et témoins (Fig. 9, 10).

L'expression de TLR2 n'a pas été affectée par les LPN

L'immunoréactivité TLR2 était élevée dans les cellules basales striales, fibroblastes du ligament spiral, et endothélium mais ne différait pas entre oreilles traitées LPN, LPN-Gd et eau (Fig. 11, 12).

Aucune augmentation de l'apoptose cochléaire après administration de LPN

La coloration TUNEL a révélé des noyaux apoptotiques épars distribués dans toute la cochlée dans tous les groupes, sans élévation dans les cohortes LPN ou LPN-Gd comparé aux témoins (Fig. 13). L'apoptose occasionnelle observée dans le pied de l'étrier et la niche de la fenêtre ovale est considérée comme faisant partie du renouvellement cellulaire normal.

Discussion

Nos données démontrent que les LPN intratympaniques atteignent l'oreille interne efficacement, traversant les voies des fenêtres ovale et ronde, sans compromettre les barrières sang-périlymphe ou sang-endolymphe. L'absence de décalage des seuils auditifs et l'absence de marqueurs inflammatoires ou apoptotiques confirment que les LPN sont bien tolérés dans la cochlée du rat. La réduction mineure de la sécrétion d'AH par les fibroblastes du ligament spiral semble cliniquement non pertinente, reflétant probablement un passage vers un AH de haut poids moléculaire anti-inflammatoire sans induire de changements de perméabilité. Ces résultats s'alignent avec des rapports antérieurs que les LPN de 95 nm sont les plus efficaces pour la délivrance dans l'oreille interne et que les LPN plus grands (110–115 nm) maintiennent la sécurité.

Importamment, l'étude confirme que les LPN n'activent pas l'axe inflammatoire TLR2/CD44, voie clé impliquée dans les lésions cochléaires par espèces réactives de l'oxygène et toxines mitochondriales. Par conséquent, les LPN représentent un véhicule sûr pour la délivrance ciblée de médicaments à l'oreille interne, soutenant leur application clinique potentielle dans la perte auditive neurosensorielle et d'autres affections otologiques.

Conclusions

L'administration transtympanique de nanotransporteurs liposomaux est sûre pour l'oreille interne du rat, préservant l'intégrité des barrières, la fonction auditive et l'homéostasie cellulaire. Les LPN sont prometteurs comme plateforme de délivrance de médicaments pour futures thérapies de l'oreille interne.

Méthodes

Matériaux

Lipides (sphingosine, SOPC, DSPE-PEG-2000), colorants fluorescents (DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA (DOTAREM), et nanoparticules d'argent (AgNP) provenaient de fournisseurs commerciaux. La pureté des lipides a été vérifiée par chromatographie sur couche mince ; les concentrations déterminées gravimétriquement.

Préparation et caractérisation des LPN

Des LPN unilamellaires (~110 nm) encapsulant 500 mM Gd-DOTA (LPN-Gd) et des LPN vides (~115 nm) ont été préparés par une méthode d'hydratation de film mince décrite précédemment (Réf. 6, 3). La distribution de taille et le potentiel zêta ont été mesurés par diffusion dynamique de la lumière.

Administration des LPN

Sous anesthésie à l'isoflurane, 50 µl de LPN ou LPN-Gd ont été injectés transtympaniquement dans l'oreille moyenne gauche via un microscope opératoire. L'oreille controlatérale a reçu de l'eau déionisée comme contrôle négatif. Les animaux étaient positionnés avec l'oreille injectée vers le haut pendant 15 min post-injection.

Évaluation de la fonction barrière par Gd-IRM

La Gd-IRM a été réalisée sur un scanner Bruker 4,7 T avec un protocole RARE. Le contraste a été administré par voie intraveineuse 2 h avant l'imagerie. Les temps d'imagerie allaient de 5 h à 8 jours post-injection pour capturer les changements aigus et sous-aigus.

Réponse auditive du tronc cérébral (ABR)

Les seuils ABR pour clics et rafales tonales (2–32 kHz) ont été enregistrés à la ligne de base, 2, 4 et 7 jours post-injection avec un montage d'électrodes standard et une chambre atténuée au son.

Analyses histologiques et immunofluorescence

Après le dernier ABR, les cochlées ont été prélevées, décalcifiées, et sectionnées. Les colorations hématoxyline-éosine et acide périodique-Schiff ont évalué l'inflammation et la teneur en glycosaminoglycanes. L'immunofluorescence pour AH, CD44, TLR2 a été réalisée sur cryosections, et l'imagerie confocale a quantifié les intensités de signal. L'apoptose a été détectée par marquage TUNEL.

Analyse statistique

Les données ont été analysées avec SPSS 20. ANOVA à un facteur et tests de Kruskal-Wallis ont comparé les décalages ABR et intensités de coloration ; tests post-hoc LSD ont suivi les résultats significatifs. p < 0,05 considéré significatif.

Abréviations

ABR

Réponse auditive du tronc cérébral

AgNP

Nanoparticules d'argent

dH2O

Eau déionisée

Gd-DOTA

Gadolinium-tétra-azacyclo-dodécane-tétra-acide acétique (DOTAREM)

Gd-IRM

Imagerie par résonance magnétique rehaussée au gadolinium

LPN

Nanotransporteur liposomal

LPN-Gd

LPN contenant Gd-DOTA

ROI

Région d'intérêt

TLR

Récepteur de type Toll