Biocompatibilité des nanoporteurs de liposomes dans l'oreille interne du rat après administration intratympanique

Contexte

Les nanocarriers liposomiques (LPN) sont potentiellement l'avenir de la thérapie de l'oreille interne en raison de leur capacité de charge médicamenteuse élevée et de leur absorption efficace dans l'oreille interne après une administration intratympanique mini-invasive [1,2,3,4]. L'approche intratympanique est bien acceptée par les otologues comme une approche rationnelle d'administration de médicaments ciblée car elle évite l'accumulation inutile d'agents thérapeutiques dans des régions non ciblées, ce qui était une stratégie préalable en clinique pour le traitement de la maladie de Ménière et de la perte auditive neurosensorielle soudaine. utilisant de la gentamicine et des corticoïdes. Le ciblage moléculaire de modèles thérapeutiques dans la cochlée a été indiqué par l'administration intratympanique de LPN spécifiques fonctionnalisés par des peptides [5]. De plus, l'administration prolongée automatique de LPN à l'oreille interne via l'oreille moyenne a été réalisée à l'aide d'un nouveau dispositif composé d'une pompe osmotique et d'un tube en polyimide haute performance [6]. En tant que plate-forme nanothérapeutique la plus ancienne de la clinique, les IAA étaient sûres pour traiter le cancer, les maladies infectieuses, l'inflammation, la douleur, etc. [7,8,9]. Cependant, la biocompatibilité des IAA dans les oreilles moyenne et interne reste inconnue et doit être clarifiée avant qu'elles puissent être appliquées cliniquement en otologie.

L'oreille est composée d'oreilles externe, moyenne et interne (Fig. 1) qui peuvent être exposées aux LPN après l'accouchement intratympanique. L'oreille moyenne est le site principal qui est exposé aux IAA à leur concentration la plus élevée, l'oreille interne est le site thérapeutique et l'organe le plus sensible aux agents dangereux, et le conduit auditif externe a le potentiel d'être irrité par les agents sortant du cavité de l'oreille moyenne. Les barrières biologiques sont le premier système de défense, limitant la biodisponibilité des agents, et existent au niveau de la peau, des muqueuses et des structures périneurales. Le système de barrière dans l'oreille interne joue un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie ionique qui est essentielle à l'activité physiologique de l'oreille interne. L'altération fonctionnelle de ces barrières peut être évaluée avec précision en utilisant l'imagerie par résonance magnétique rehaussée de gadolinium (Gd-MRI). L'altération de la fonction auditive peut être mesurée avec précision grâce à la réponse auditive du tronc cérébral (ABR). Par conséquent, l'oreille (y compris les oreilles externe, moyenne et interne) elle-même constitue un excellent modèle pour la nanotoxicologie [10, 11].

Illustration de l'oreille de mammifère. L'oreille des mammifères (y compris les humains et les rats) est composée d'oreilles externe, moyenne et interne. L'oreille externe (OE ) est composé de l'oreillette et du conduit auditif externe (EAC ). L'oreille moyenne (ME ) est composé de la membrane tympanique (TM ) et la cavité qui abrite la chaîne ossiculaire, dont le marteau (Ma ), incus (Inc ) et l'étrier. La cavité de l'oreille moyenne est une extension du nasopharynx via la trompe d'Eustache (ET ) et communique avec l'oreille interne à travers la fenêtre ovale (OW ) et membrane de fenêtre ronde (RWM ). L'oreille interne est composée de la cochlée et du système vestibulaire. La cochlée est l'organe sensoriel de l'audition et possède trois chambres, c'est-à-dire les compartiments périlymphatiques de la scala tympani (ST ) et la scala vestibuli (SV ), et le compartiment endolymphatique de la scala media (SM ). Sur la paroi latérale du SM, il y a la strie vasculaire (StrV ) et le ligament spiral (SLig ). Au bas du SM se trouvent des organes de Cortis qui contiennent des cellules ciliées internes (IHC ) et les cellules ciliées externes (OHC ), membrane tectoriale (TM ), et limbe spiral (Slim ). Les cellules ganglionnaires spirales (SGC ) déclenchent un potentiel d'action correspondant à la transduction mécano-électrique des cellules ciliées et fournissent toutes les entrées auditives du cerveau. Le système vestibulaire est responsable de l'équilibre et est composé de trois canaux semi-circulaires (SCC ) et vestibule. La cupule ampullaire dans le SCC détecte les accélérations de rotation et la macula dans le saccule et l'utricule du vestibule détecte les accélérations linéaires. CN nerf cochléaire, SP proéminence en spirale, VN nerf vestibulaire, VS vas spiralis. (adapté de Zou J. Focal Drug Delivery in Inner Ear Therapy :in Focal Controlled Drug Delivery. Editeurs :Domb AJ et Khan W. Springer, Londres, Royaume-Uni. ISBN :978-1-4614-9433-1, 2014; p215- 224)

L'acide hyaluronique (hyaluronane) est un biopolymère polyanionique naturel et est un composant principal de la matrice extracellulaire dans la membrane basale. L'acide hyaluronique est composé d'acide D-glucuronique et de N-acétyl-D-glucosamine, qui sont liés par des liaisons glycosidiques -1, 4 et β-1, 3 alternées. L'accumulation d'acide hyaluronique pourrait contribuer à une augmentation de la perméabilité et de l'inflammation de la microcirculation dans les lésions de reperfusion ischémique rénale [12]. L'effet ototoxique des nanoparticules d'argent s'est avéré corrélé à l'accumulation d'acide hyaluronique dans la cochlée du rat dans notre précédent rapport [11]. L'acide hyaluronique se lie au CD44 et au récepteur Toll-like 2/4 (TLR2/4) dans les tissus et déclenche des réactions biologiques [13, 14]. Les activités biologiques médiées par CD44 lors de la liaison à l'acide hyaluronique se font principalement par l'interaction avec des molécules régulatrices et adaptatrices, telles que les SRC kinases, Rho GTPases, VAV2, Growth Factor receptor-bound protein 2-associated-binding protein 1 (GAB1), ankyrine, et ezrine [15,16,17]. Le CD44 médie également le métabolisme de l'acide hyaluronique par le biais d'approches d'absorption et de dégradation cellulaires, en plus de recruter des cellules T sur les sites inflammatoires et de réguler les lésions endothéliales induites par les cellules T [18]. Il a été rapporté que la cytotoxicité des cellules endothéliales de l'oreille interne par les anticorps anti-cellules endothéliales pourrait jouer un rôle dans l'atteinte de la strie vasculaire dans la surdité neurosensorielle soudaine à médiation immunitaire [19]. L'activation du facteur nucléaire κB dépendant du TLR2 aurait été impliquée dans la régulation positive de la protéine chimiotactique des monocytes induite par Haemophilus influenzae non typable 1 dans les fibrocytes du ligament spiral de l'oreille interne, ce qui pourrait être l'étape clé du dysfonctionnement de l'oreille interne secondaire à une otite moyenne chronique. 20]. Si les LPN induisent une atteinte de l'oreille interne après administration dans l'oreille moyenne, la voie de signalisation médiée par TLR2 devrait être le mécanisme important.

Notre objectif était d'évaluer la biocompatibilité des LPN dans l'oreille interne après injection transtympanique. Les fonctions des barrières biologiques dans la peau (conduit auditif externe), la muqueuse (cavité de l'oreille moyenne) et les compartiments de l'oreille interne ont été mesurées à l'aide de l'IRM-Gd à différents moments. La fonction auditive a été évaluée en utilisant la mesure ABR. Enfin, les modifications histopathologiques potentielles ont été analysées en mesurant les accumulations de glycosaminoglycanes et d'acide hyaluronique, les expressions de CD44 et TLR2, et la fragmentation de l'ADN dans la cochlée.

Résultats

Les IAA n'ont pas causé de changements fonctionnels dans la cochlée du rat

Dans le groupe témoin positif, signal lumineux dans la périlymphe de la cochlée (Coch) et le vestibulaire (Vest) des deux côtés (L, R) (Fig. 2a, b) indiquant l'absorption de Gd-DOTA. Après des injections transtympaniques de nanoparticules d'argent (AgNPs), les intensités de signal dans les compartiments périlymphatiques ont augmenté de manière significative tandis qu'un signal extrêmement intense a également été détecté dans la peau du conduit auditif externe, la muqueuse de l'oreille moyenne, indiquant l'absorption accrue de Gd-DOTA associée à l'administration d'AgNP ( L sur la figure 2a, b) (tableau 1). Le système d'évaluation a donc été validé. Chez l'animal recevant une injection transtympanique de LPN  +  Gd-DOTA, un signal lumineux a été détecté à la surface de la chaîne ossiculaire, de la rampe vestibulaire, de la rampe tympanique et du vestibule 3 h après l'injection, indiquant une distribution évidente de LPN dans ces régions (Fig. 2c , ré). L'intensité du signal dans la rampe vestibulaire du tour basal était visiblement plus forte que celle de la rampe tympanique, suggérant une entrée efficace de LPN à travers la fenêtre ovale chez l'animal actuel [21]. À 6 h après l'injection, les intensités de signal entre la rampe vestibulaire et la rampe tympanique dans le tour basal sont devenues similaires et l'ensemble de la cochlée a montré un signal presque homogène, mais il y avait des changements insignifiants dans le vestibule (Fig. 2e, f). Chez les animaux recevant des injections intraveineuses de Gd-DOTA après l'injection transtympanique de LPN vierges, les deux côtés ont affiché des intensités de signal similaires, sauf qu'il y avait des signaux forts dans l'oreille moyenne recevant l'injection transtympanique de LPN vierges suspectant une accumulation de LPN à la surface de la chaîne ossiculaire (Fig. . 2g, h). Le trou noir dans la chaîne ossiculaire indiquant la zone creuse de l'étrier (Fig. 2h). Des intensités de signal égales des deux côtés suggèrent que la propriété de transport du Gd-DOTA des barrières hémato-périlymphale sur les deux oreilles n'a pas changé après l'injection transtympanique de LPN (Fig. 2g, h) (Tableau 1).

IRM rehaussée au gadolinium de l'oreille interne de rat après administration de liposomes nanocarrier (LPN). Chez tous les animaux, des nanomatériaux ont été injectés sur la paroi médiale de la cavité de l'oreille moyenne gauche. Le contrôle positif a été imagé chez le rat 2 h après l'injection intraveineuse de Gd-DOTA secondaire à l'injection transtympanique de nanoparticules d'argent (AgNP) 5 h à l'avance (a , b ). La distribution dynamique des IAA dans les oreilles moyenne et interne a été montrée dans c , d , e , f par injection transtympanique de LPN contenant du Gd-DOTA sans administration intraveineuse de Gd-DOTA. L'impact des LPN vides sur la barrière biologique a été montré par IRM 2 h après l'injection intraveineuse de Gd-DOTA (i.v. Gd-DOTA) chez des rats recevant une injection transtympanique de LPN 5 h à l'avance (g , h ). Suis ampullaire du canal semi-circulaire postérieur, Coch cochlée, EES peau de l'oreille externe, L oreille gauche, LPN-Mu LPN dans la muqueuse de l'oreille moyenne, LPN-OC LPN sur la chaîne ossiculaire (OC ), ME-Mu , muqueuse de l'oreille moyenne, R oreille droite, SM scala media , ST scala tympani, SV scala vestibuli, Gilet vestibule, 1H tour basal supérieur de la cochlée, 1L tour basal inférieur de la cochlée, 2H deuxième tour supérieur de la cochlée, 2L deuxième tour inférieur de la cochlée. Barre d'échelle = 5 mm

Ni LPN + Gd-DOTA ni LPN n'ont causé de perte auditive significative, présentée comme un décalage du seuil ABR qui a été mesuré à l'aide de stimuli de clics et d'éclats de tonalité aux fréquences de 2, 4, 8, 16 et 32 kHz à 2, 4 et 7 jours après l'administration, par rapport aux oreilles recevant des injections transtympaniques d'eau déminéralisée (dH₂ O) (Fig. 3).

Impact de l'injection transtympanique de nanotransporteurs de liposomes sur la fonction auditive chez le rat mesuré par la réponse auditive du tronc cérébral. La perte auditive a été exprimée sous forme de décalages de seuil. Il y avait une différence non significative entre les groupes (p> 0,05, ANOVA unidirectionnelle). n = 6 dans chaque groupe. H2O injection transtympanique d'eau déminéralisée dans le groupe témoin négatif, LPN nanosupport de liposomes vide, LPN + Gd-DOTA LPN contenant Gd-DOTA, 2d , 4d , et 7j 2, 4 et 7 jours après l'injection

Les IAA n'ont pas induit d'accumulation de glycosaminoglycane dans la cochlée du rat

La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine n'a démontré aucune infiltration inflammatoire de leucocytes et de fibrine dans la cochlée de tous les animaux analysés, y compris l'étrier et la fenêtre ovale où passent les LPN (Fig. 4). La coloration à l'acide périodique de Schiff a démontré l'existence de glycosaminoglycanes dans la paroi osseuse, le limbe spiral, le ligament spiral, la membrane tectoriale, la membrane de Reissner, la lame spiralée osseuse et la strie vasculaire dans la cochlée des animaux recevant des injections transtympaniques de dH₂ O. Il y avait une augmentation progressive de l'intensité du signal du tour basal à l'apex, et la différence était significative dans la strie vasculaire (Figs. 5 et 6). Le gradient de signal dans la cochlée n'a pas été modifié chez les animaux recevant une injection transtympanique de LPN et de LPN + Gd-DOTA (Figs. 5 et 6).

Coloration à l'hématoxyline-éosine de cochlées de rats exposées à des nanocarriers de liposomes. Il n'y avait pas d'infiltration inflammatoire dans la cochlée après administration de LPN (a ), LPN+Gd (b ), et H2O (c ). Zone encerclée sélection indiquée de la région d'intérêt pour les mesures d'intensité (a ). LPN nanosupport de liposomes vide, LPN + Gd LPN contenant du Gd-DOTA. Sa saccule, SFP repose-pieds étrier, SVJ articulation stapédio-vestibulaire, SM scala media, ST scala tympani, SV scala vestibuli, Ut utricule. Barre d'échelle = 1 mm

La sécrétion de glycosaminoglycanes dans la cochlée de rat exposée à des nanosupports de liposomes a été détectée à l'aide de la microscopie optique à coloration de Schiff à l'acide périodique. Le limbe spiral (SLim ) et paroi osseuse (BW ) de la cochlée a montré la coloration la plus intense dans les groupes de contrôle négatif (H2O ) (a –c ), nanocarrier de liposomes vide (LPN) (d –f ) et LPN contenant du Gd-DOTA (LPN + Gd ) (g –je ). La zone de coloration avec des intensités visiblement plus élevées a été indiquée par * dans c , f , et h par rapport à la colonne de gauche. RM Membrane de Reissner, SGC cellule ganglionnaire spirale, SLig ligament spiral, StrV strie vasculaire, 1er tour basal, 2e deuxième tour. Barre d'échelle = 50 μm

Quantification de la sécrétion de glycosaminoglycanes dans la cochlée de rat exposée à des nanotransporteurs de liposomes détectés à l'aide de la coloration de Schiff à l'acide périodique. n = 3 dans chaque groupe. AU unité arbitraire, H2O contrôle négatif, LPN nanosupport de liposomes vide, LPN + Gd LPN contenant Gd-DOTA, SLig ligament spiral, Slim limbe spiral, StrV strie vasculaire, 1er tour basal, 2e deuxième tour. *p < 0,05, ***i>p < 0,01 (ANOVA à un facteur avec test LSD utilisé comme analyse post hoc)

Il y avait un impact mineur sur la sécrétion d'acide hyaluronique dans la cochlée du rat par les IAA

Dans la cochlée de rats recevant des injections transtympaniques de dH2O, une coloration positive pour l'acide hyaluronique a été détectée principalement dans les cellules du ganglion spiral, les cellules basales striales, les cellules du sillon externe et les cellules endothéliales capillaires, entre autres cellules (Fig. 7). Les intensités de signal dans les fibrocytes du ligament spiral du basal et du deuxième tour étaient significativement plus élevées que celles de l'apex. Ces différences sont devenues insignifiantes dans la cochlée des rats avec l'application de LPN et de LPN + Gd-DOTA, indiquant que la sécrétion d'acide hyaluronique par les fibrocytes du ligament spiral était affectée par l'administration de LPN (Fig. 8). LPN + Gd-DOTA a également réduit la coloration dans les fibrocytes du ligament spiral du tour basal. Cependant, il n'y a eu aucun impact sur la sécrétion d'acide hyaluronique dans la majorité des cellules cochléaires par l'injection transtympanique de LPN et de LPN + Gd-DOTA (Figs. 7 et 8).

La sécrétion d'acide hyaluronique dans la cochlée de rat exposée à des nanotransporteurs de liposomes a été détectée par microscopie confocale immunofluorescente. Une coloration positive a été trouvée dans la cellule basale de la strie (SBC ), cellule sulcus externe (OSC ), cellule ganglionnaire spirale (SGC ), et la cellule endothéliale capillaire (CEC ) de modiolus de groupes de contrôle négatif (H2O ) (a –c , j ), des nanoporteurs de liposomes vides (LPN ) (d –f , k ) et LPN contenant du Gd-DOTA (LPN + Gd ) (g –je , l ). Il n'y avait pas de coloration dans le contrôle négatif d'anticorps omis (AbNC ) (m ). CCE cellule endothéliale capillaire, ISC cellule du sulcus interne, SBC cellule basale de la strie, SL-I fibrocyte du ligament spiralé de type I, SLSF fibrocytes satellites du limbe spiral, SMC cellule marginale de la strie vasculaire. Barre d'échelle = 16 μm

Quantification de la sécrétion d'acide hyaluronique dans la cochlée de rat exposée à des nanotransporteurs de liposomes détectés par microscopie confocale immunofluorescente. n = 3 dans chaque groupe. AU unité arbitraire, H2O contrôle négatif, LPN nanosupport de liposomes vide, LPN + Gd LPN contenant Gd-DOTA, SBC cellules basales de la strie, SGC cellules ganglionnaires spirales, SLig , ligament spiral, Slim limbe spiral, 1er tour basal, 2e deuxième tour. **p < 0,01 (par rapport à l'apex), ##p < 0,01 (comparé aux groupes LPN et H2O du tour basal) (ANOVA à un facteur avec test LSD utilisé comme analyse post hoc)

Les IAA n'ont pas modifié la population de cellules CD44 dans la cochlée de rat

Dans les cochlées exposées à dH₂ O, les cellules intermédiaires striales, les cellules basales striales, les fibrocytes du ligament spiral, les cellules du ganglion spiral, les cellules de Deiters dans l'organe de Corti et les cellules endothéliales capillaires dans le modiolus et le ligament spiral ont montré une coloration intensive pour CD44. Il y avait une différence insignifiante dans les intensités de signal parmi les tours cochléaires. La population CD44-positive et l'intensité d'expression n'ont pas été affectées par l'injection transtympanique de LPN + Gd-DOTA ou de LPN (Figs. 9 et 10).

Distribution de cellules CD44-positives dans la cochlée de rat exposée à un nanocarrier de liposomes démontrée à l'aide de la microscopie confocale immunofluorescente. Les cellules CD44-positives ont été principalement détectées dans la strie basale (SBC ), ligament spiral (SL ), les cellules de Dieter (DC ), cellule ganglionnaire spirale (SGC ), et la cellule endothéliale capillaire (CEC ) dans les groupes de contrôle négatif (H2O ) (a –e ), des nanoporteurs de liposomes vides (LPN ) (f –j ) et LPN contenant du Gd-DOTA (LPN + Gd ) (k –n ). Il n'y avait pas de coloration dans le contrôle négatif d'anticorps omis (AbNC ) (o ). IHC cellules ciliées internes, M-CEC cellule endothéliale capillaire dans le modiolus, SL-CEC cellule endothéliale capillaire dans le ligament spiral :cellules ganglionnaires spirales, SL-III fibrocyte du ligament spiralé de type III, SL-IV fibrocyte du ligament spiralé de type IV, TM membrane tectoriale, OHC cellules ciliées externes. Barre d'échelle = 16 μm

Quantification du niveau de protéine CD44 dans la cochlée de rat exposée à des nanocarriers de liposomes détectés par microscopie confocale immunofluorescente. Il y avait une différence non significative entre les groupes (p> 0,05, ANOVA unidirectionnelle). n = 3 dans chaque groupe. n = 3 dans chaque groupe. AU unité arbitraire, H2O contrôle négatif, LPN nanosupport de liposomes vide, LPN + Gd LPN contenant Gd-DOTA, SBC cellules basales de la strie, SGC cellules ganglionnaires spirales, SLig ligament spiral, 1er tour basal, 2e deuxième tour

Les IAA n'ont pas modifié l'expression de TLR2 dans la cochlée du rat

Dans les cochlées exposées à la dH2O, les cellules basales striales, les fibrocytes du ligament spiral, les cellules radiculaires, les cellules ganglionnaires spiralées, les cellules piliers de l'organe de Corti et les cellules endothéliales capillaires dans le modiolus ont montré une coloration intensive pour TLR2. Il y avait une différence insignifiante dans les intensités de signal parmi les tours cochléaires. La population positive pour TLR2 et l'intensité d'expression n'ont pas été affectées par l'injection transtympanique de LPN + Gd-DOTA ou de LPN (Figs. 11 et 12).

Distribution de cellules positives pour TLR2 dans la cochlée de rat exposée à un nanocarrier de liposomes démontrée à l'aide de la microscopie confocale immunofluorescente. Les cellules TLR2-positives ont été principalement détectées dans la strie basale (SBC ), ligament spiral (SL ), cellule racine (RC ), cellule pilier (PC ), cellule ganglionnaire spirale (SGC ), et la cellule endothéliale capillaire (CEC ) dans les groupes de contrôle négatif (H2O ) (a –e ), des nanoporteurs de liposomes vides (LPN ) (k –n ) et LPN contenant du Gd-DOTA (LPN + Gd ) (f –j ). Il n'y avait pas de coloration dans le contrôle négatif sans anticorps (AbNC ) (o ). IHC cellules ciliées internes, SL-III fibrocyte du ligament spiralé de type III, OHC cellules ciliées externes. Barre d'échelle = 16 μm

Quantification du niveau de protéine TLR2 dans la cochlée de rat exposé à des nanocarriers de liposomes détectés par microscopie confocale immunofluorescente. Il y avait une différence non significative entre les groupes (p> 0,05, ANOVA unidirectionnelle). n = 3 dans chaque groupe. AU unité arbitraire, H2O contrôle négatif, LPN nanosupport de liposomes vide, LPN + Gd LPN contenant Gd-DOTA, SBC cellules basales de la strie, SGC cellules ganglionnaires spirales, SLig ligament spiral, 1er tour basal, 2e deuxième tour

Les IAA n'ont pas causé la mort cellulaire dans la cochlée du rat

Il y avait des cellules apoptotiques clairsemées qui sont réparties au hasard dans la cochlée des rats non traités. Étonnamment, il y avait des cellules apoptotiques abondantes dans la plaque de base de l'étrier et la niche de la fenêtre ovale. L'administration de LPN et de LPN + Gd-DOTA n'a eu aucun impact sur la quantité et le schéma de distribution des cellules apoptotiques (Fig. 13).

L'apoptose dans la cochlée de rat exposée à des nanotransporteurs de liposomes a été démontrée à l'aide de la microscopie confocale à coloration TUNEL. Les cellules apoptotiques ont été peu détectées dans les cellules cochléaires de rats dans des groupes de contrôle négatif (H2O ) (a –c ), des nanoporteurs de liposomes vides (LPN ) (f –je ) et LPN contenant du Gd-DOTA (LPN + Gd ) (j –l ). Il y avait des cellules apoptotiques abondantes dans la plaque de base de l'étrier (FP ) et niche de fenêtre ovale (OWN ) des deux groupes (d , e ). Dans un contrôle positif (PC), une coloration TUNEL abondante a été détectée dans les fibrocytes du ligament spiral (SL ), les cellules basales de la strie (SBC ) et les cellules stria margina (SMC ). PP processus périphérique de la cellule ganglionnaire spirale (SGC ), OC ostéocyte, OSC cellule du sulcus externe, SL-IV type IV des fibrocytes du ligament spiral, SLim limbe spiral, StrV strie vasculaire. Barre d'échelle un –l = 32 μm, m = 16 μm

Discussion

Les LPN ont pénétré efficacement dans l'oreille interne après une injection transtympanique démontrée par IRM utilisant Gd-DOTA en tant que médicaments mimétiques qui ont été encapsulés à l'intérieur des LPN (Fig. 2c-f). Bien qu'une étude précédente ait montré que la fenêtre ronde était la voie principale des IAA pour entrer dans l'oreille interne [6], la présente observation a montré que la voie de la fenêtre ovale était plus efficace que la fenêtre ronde pour transporter les IAA de l'oreille moyenne vers l'oreille interne. oreille. Ce résultat suggère que les deux voies sont importantes dans la charge de l'oreille interne des IAA après l'administration ciblée de la paroi médiale de l'oreille moyenne. En utilisant la méthode in vivo la plus efficace d'IRM de l'oreille interne rehaussée de gadolinium pour évaluer la barrière biologique et l'ABR spécifique à la fréquence pour évaluer la fonction auditive, la présente étude a démontré que l'injection transtympanique de LPN et de LPN + Gd-DOTA n'a ni perturbé la fonction de les barrières de l'oreille interne ni causé de déficience auditive chez les rats. En analysant les marqueurs biologiques inflammatoires critiques précédemment démontrés [11, 22], les LPN et LPN + Gd-DOTA n'ont pas induit la réponse inflammatoire dans la cochlée. Bien que la membrane de la fenêtre ronde n'ait pas été évaluée, l'absence d'inflammation dans l'étrier et la fenêtre ovale a exclu une réaction inflammatoire évidente dans la membrane de la fenêtre ronde puisque la présente étude a démontré que la voie de la fenêtre ovale était supérieure à l'approche de la fenêtre ronde pour les IAA.

L'IRM de l'oreille interne après injection intraveineuse de chélate de gadolinium est capable de détecter la perturbation induite par le stress oxydatif dans les barrières sang-périlymphe et sang-endolymphe induite par les toxines mitochondriales [23]. Il a été rapporté que les AgNPs provoquent une altération cellulaire par la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et l'activation de Jun amino-terminal kinases (JNK), conduisant à la libération du cytochrome C dans le cytosol et à la translocation de Bax vers les mitochondries [24 ]. En injection transtympanique, les AgNPs ont pénétré dans l'oreille interne et ont induit des changements de perméabilité dans les barrières biologiques de l'oreille interne du rat [11, 25]. Les LPN ont également pénétré dans l'oreille interne du rat après l'injection transtympanique selon un schéma dépendant de la taille, et les LPN de 95 nm de diamètre ont montré la plus grande efficacité pour traverser les barrières de l'oreille interne moyenne [3]. Dans la présente étude, la taille moyenne des LPN était de 100 à 115 nm, ce qui était légèrement plus grand que la taille la plus efficace. LPN + Gd-DOTA a montré que cette taille de LPN pénétrait dans l'oreille interne, ce qui est en accord avec le rapport précédent [3]. Cependant, l'entrée des LPN dans l'oreille interne n'a pas provoqué de changements de perméabilité dans les barrières hémato-périlymphale et hémato-endolymphale. Ce résultat suggère que les IAA sont sans danger pour l'oreille interne. Les résultats ABR indiquant une fonction auditive normale ont soutenu le résultat de l'IRM.

There was an association between hyaluronic acid secretion and permeability change and microcirculation inflammation in renal ischemic reperfusion injury [12]. The previous study also showed that AgNPs caused the accumulation of hyaluronic acid in the rat cochlea [11]. CD44 and toll-like receptor 2/4 (TLR2/4) work as receptors of hyaluronic acid and trigger biological reactions [13, 14]. CD44 also mediates the metabolism of hyaluronic acid through cellular uptake and degradation in addition to recruiting T cells to inflammatory sites and regulating T cell-mediated endothelial injury [18]. In the present study, hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were detected in the rat cochlea. LPN + Gd-DOTA reduced the secretion of hyaluronic acid in the spiral ligament fibrocytes. The expressions of CD44 and TLR2 were not changed after the transtympanic injection of either LPNs or LPN + Gd-DOTA. The total glycosaminoglycan, which contains hyaluronic acid in the cochlea was not affected by the administrations of LPNs and LPN + Gd-DOTA. The impact of LPNs on the hyaluronic acid distribution in rat cochlea did not cause either permeability change or hearing loss, indicating that the modification is unharmful. It was reported that macrophages undergo phenotypic changes dependent on molecular weight of hyaluronan that correspond to either pro-inflammatory response for low molecular weight hyaluronic acid or anti-inflammatory response for high molecular weight hyaluronic acid [26]. The observed minor changes of hyaluronic acid distribution in the cochlea might have high molecular weight and anti-inflammatory function. Therefore, there was no hint of an inflammatory reaction in the rat cochlea.

The observed apoptosis in the stapes footplate cells might be normal biological activity. A balance between survival and apoptosis in the stapes footplate cells was reportedly as necessary to inactivate the otosclerosis [27]. Administration of LPN + Gd-DOTA did not affect apoptosis in the rat stapes.

Conclusions

The present study demonstrated that the transtympanic injection of liposome nanocarriers neither impaired the biological barriers of the inner ear nor caused hearing loss in the rats. The critical inflammatory mechanism was not activated by the administration of liposome nanocarriers, either. The results suggested that transtympanic injection of liposome nanocarrier is safe for the cochlea of rat.

Methods

Materials

Sphingosine (Sph), 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC), and 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000] (ammonium salt) [DSPE-PEG-2000] were purchased from Avanti polar lipids (Alabaster, USA). DiI (Vybrant DiI cell-labeling solution, 1 mM in solvent) and N-(6-tetramethylrhodaminethiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-hosphoethanolamine, triethylammonium salt (TRITC-DHPE) were purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA). Gd-DOTA (DOTAREM) was from Guerbet, Cedex, France. Hepes and EDTA were from Sigma. The purity of the lipids was evaluated using thin-layer chromatography on silicic acid-coated plates (Merck, Darmstadt, Germany) developed with a chloroform/methanol/water mixture (65:25:4, v/v/v). An examination of the plates after iodine staining and, when appropriate, upon UV illumination revealed no impurities. The lipid concentrations were determined gravimetrically with SuperG (Kibron, Espoo, Finland); a high-precision microbalance. The polyvinylpyrrolidone-stabilized AgNPs were supplied by Colorobbia (Firenze, Italy). The AgNPs were dispersed in deionized water (370.7 mM), and scanning electron microscopy showed that the AgNPs are spheroids with a particle size of around 100 nm. Dynamic light scattering (DLS) showed a mean hydrodynamic size of 117 ± 24 nm and a mean zeta potential of −20 ± 9 mV.

In the visualization of nanocarrier uptake in the inner ear and the evaluation of biological barrier function, 5 male Sprague Dawley rats, weighing between 334 and 348 g, were provided by the Biomedicum Helsinki, Laboratory Animal Centre, University of Helsinki, Finland (this is the defined animal center that provides animals for MRI experiments in Biomedicum); in the ABR and histological studies, 18 Sprague Dawley rats, weighing between 300 and 400 g, were provided by the Experimental Animal Unit of the University of Tampere School of Medicine in Finland. Animal assignments in each study were shown in Table 2. All animal experiments were approved by the Ethical Committee of University of Tampere (permission number:ESAVI/3033/04.10.03/2011). Animal care and experimental procedures were conducted in accordance with European legislation. Animals in the Gd-MRI study were anesthetized with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min) for induction and 3% for maintenance via a facemask. Animals for the ABR and histological studies were anesthetized with a mixture of 0.5 mg/kg medetomidine hydrochloride (Domitor ^® , Orion, Espoo, Finland) and 75 mg/kg ketamine hydrochloride (Ketalar ^® , Pfizer, Helsinki, Finland) via intraperitoneal injection followed by an intramuscular injection of enrofloxacin (Baytril ^® vet, Orion, Turku, Finland) at a dose of 10 mg/kg to prevent potential infection. The animal’s eyes were protected by Viscotears® (Novartis Healthcare A/S, Copenhagen, Denmark).

Preparation and Characterization of LPNs with and without Gd

Preparation of Gd-containing LPNs

LPNs of unilamellar vesicles with an apparent hydrodynamic particle diameter (Z _av ) of 110 ± 15 nm that contain Gd-DOTA were prepared according to the previously published method [6]. A concentration of 1 mM Gd-DOTA-containing LPN (LPN + Gd-DOTA) refers to 1 mM liposomes encapsulating 500 mmol/L of Gd-DOTA.

Preparation of Blank LPNs

Blank LPNs of unilamellar vesicles with Z _av of 115 ± 10 nm were prepared according to a previous publication [6].

Administration of LPNs

Under general anesthesia with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min), 50 μl of either LPNs or LPN + Gd-DOTA were injected into the left middle ear cavity through the tympanic membrane penetration under an operating microscope (OPMI1-F, Carl Zeiss, Jena, Germany). The same amount of deionized water (H₂ O) was injected transtympanically in rats that were assigned to the negative group. After the injection, the animals were kept in the lateral position with the injected ear oriented upward for 15 min before further measurements.

Evaluation on Biological Barrier Function Using Gd-MRI

One animal receiving transtympanic injection of LPN + Gd-DOTA was selected to demonstrate distributions of LPN in the inner ear using MRI without contrast agent. Two animals receiving transtympanic injection of blank LPNs were engaged in MRI study for evaluation of the biological barrier function. Two animals receiving transtympanic injection of AgNPs (370.7 mM, 40 μl) were used as positive control. The contralateral ear without any injection was used as negative control in all studies. A 4.7T MR scanner with a bore diameter of 155 mm (PharmaScan, Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany) was utilized. The maximum gradient strength was 300 mT/m with an 80-μs rise time. A gadolinium-tetraazacyclododecane-tetraacetic acid (Gd-DOTA, 500 mM, DOTAREM, Guerbet, Cedex, France) solution was injected into the tail vein (0.725 mM/kg) 2 h before the MRI measurements. The imaging protocol and rapid acquisition with relaxation enhancement (RARE) sequences were applied according to a previous publication [10]. MRI scanning commenced at several time points after the transtympanic injection. The first MRI time of around 5 h was determined by taking the penetration time of liposome nanoparticles from the middle ear to the inner ear as a reference [1, 3, 6]. The final imaging time of 8 d was selected according to the course of potential acute inflammation and the availability of the scanner. ParaVision PV 4.0 (Bruker, MA, USA) software was used for the post-processing and quantification of MR images.

ABR Measurement

The auditory function of animals receiving injections of both blank and Gd-containing LPNs were evaluated using ABR measurements using BioSig32 (Tucker Davis Technologies, FL, USA) in a custom made, soundproof chamber. The ABR thresholds upon click and tone burst stimuli were recorded before and at a certain time point post-administration of LPNs. The first ABR measurement was followed on 2 days post-administration of AgNPs, allowing the animals to recover from the general anesthesia during the injection and to ensure the injected solution to be entirely cleared from the middle ear cavity. The second follow-up time of 4 days post-injection was chosen because it is close to the peak time of potential mitochondrial impairment-induced cell death in the cochlea [22]. The third follow-up time of 7 days is the time point when temporary threshold shifts remained significantly approved in an animal model of mitochondrial toxin-induced hearing loss [28]. The ABR recording procedure followed the previous report [11].

Glycosaminoglycan Staining in Rat Cochlea After Administration of LPNs

Hematoxylin-eosin staining to assess potential inflammatory infiltration and periodic acid Schiff’s staining to evaluate potential glycosaminoglycan accumulation in the cochlea after administration of LPNs were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11] The slices were observed and digital images were acquired under a light microscope (Leica DM2000 microscope equipped with an Olympus DP25 camera) for further analysis.

Immunofluorescence Staining for Hyaluronic Acid and Receptors

Immunofluorescence staining for hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11, 21].

Cell Death Detection

Potential nuclear DNA fragmentation in the cochlea was investigated using terminal transferase (TdT) to label the free 3′OH breaks in the DNA strands of apoptotic cells with TMR-dUTP (TUNEL staining) following the reported procedure [11]. Slices exposed to recombinant DNase I (Fermentas, Vantaa, Finland, 100 U/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mg/ml bovine serum albumin) at 37 °C for 10 min, which induced DNA strand breaks prior to the labeling procedures, were utilized as positive controls. The samples were observed under a confocal microscope.

Confocal Microscopy

The samples were observed under a Nikon inverted microscope (ECLIPSE Ti) combined with an Andor confocal system installed with Andor iQ 2.8 software (Andor Technology, Belfast, UK). The excitation lasers were 488 nm (green excitation) and 568 nm (red excitation) from an Andor laser combiner system, and the corresponding emission filters were 525/50 (Alexa Fluor-488) and 607/45 nm (Cy ^TM 3 and TMR Red). DAPI was excited with light at 405 nm generated from a light-emitting diode and was detected using a 450–465 nm filter.

Analysis and Statistics

ImageJ (1.45S, National Institutes of Health, Bethesda, USA) software was used for signal intensity measurements. For light microscopy of periodic acid Schiff’s staining, the region of interests (ROIs) including spiral ligament, spiral limbus, and stria vascularis were selected using freehand selections button. The “measure” function was used to obtain the mean gray scale value of the ROI, which was inversely correlated with the staining intensity. For confocal microscopy of immunofluorescence staining, the ROIs including stria basal cells, spiral ganglion cells, spiral ligament, and spiral limbus were extracted using photoshop CS6 (version 13.0, Adobe Systems Software Ireland Ltd, Dublin, Ireland) program and were imported into ImageJ program. The images were split into individual channel, and the green (corresponded to CD44 and TLR2) and red (corresponded to hyaluronic acid) channels were selected for further quantifications. The “Threshold” was adjusted using the “set” button in the “Image” menu, and “Limit to Threshold” option should be selected and “Direct to” should be defined to the corresponding channel in the “Analyze” menu. Then the gray scale value, which was inversely correlated with the staining intensity, was obtained using the “Measure” function in the same menu.

Statistical analyses were performed using the IBM ^® SPSS ^® Statistics Version 20 software package (SPSS Inc., Chicago, USA). A one-way ANOVA and Kruskal-Wallis test were used to compare ABR threshold shifts and signal intensities (grayscale) of staining for glycosaminoglycan and hyaluronic acid secretions, and TLR2 and CD44 staining between the LPN injected-ear and saline injected-ear groups in the different cochlear structures among various turns. Least significant difference (LSD) test was used as post hoc analysis. Higher numbers in the grayscale analysis correlate with lower signal intensities of the staining. p  < 0.05 was accepted as statistically significant.

Abréviations

ABR:

Auditory brainstem response

AgNPs:

Silver nanoparticles

dH₂ O:

Deionized water

GAB1:

Growth factor receptor-bound protein 2-associated-binding protein 1

Gd-DOTA:

Gadolinium-tetra-azacyclo-dodecane-tetra-acetic acid (DOTAREM)

Gd-MRI:

Gadolinium-enhanced magnetic resonance imaging

JNK:

Jun amino-terminal kinases

LPN + Gd-DOTA:

Gd-DOTA-containing LPNs

LPNs:

Liposome nanocarriers

ROI:

Region of interests

ROS:

Reactive oxygen species

TLR:

Toll-like receptor