La restauration du microARN-499-5p protège les souris atteintes de lésions pulmonaires induites par le sepsis via le ciblage de Sox6

Introduction

Le sepsis est une inflammation systémique qui survient à la suite d'une infection et provoque des dysfonctionnements de plusieurs organes, contenant un syndrome de détresse respiratoire aiguë [1]. Elle se caractérise par une hypotension profonde, une hypoxémie progressive, des lésions tissulaires et des modifications inflammatoires [2]. Le poumon est l'organe le plus critique et le plus vulnérable dans le sepsis, et les lésions pulmonaires aiguës (ALI) sont une maladie inflammatoire fréquente induite par le sepsis [3]. La sévérité de l'ALI induite par le sepsis peut être attribuée à une altération de la perméabilité du réseau alvéocapillaire, entraînant une réduction de l'apport d'oxygène [4]. L'apoptose des cellules pulmonaires est un facteur critique dans les lésions pulmonaires induites par le sepsis [5]. La physiopathologie de l'ALI induite par le sepsis est inconnue, les mesures de soutien et les antibiotiques sont les seuls traitements disponibles chez les patients atteints de sepsis et d'ALI, et leur impact sur les taux de mortalité élevés dus au sepsis est limité [6].

Les microARN (miARN) sont de petits segments non codants d'ARN exprimés de manière endogène, constitués d'environ 18 à 24 nucléotides, qui peuvent contrôler un large éventail de fonctions cellulaires et se lier aux régions cibles d'un gène particulier pour contrôler leur expression en inhibant ou en activant l'ARNm traduction/transcription [7]. MiR-499-5p est un membre récemment découvert des miARN codés par la myosine [8]. Une étude a rapporté que les taux sériques de miR-499-5p pourraient être utilisés pour indiquer une défaillance d'organe chez les patients atteints de sepsis [9]. Une autre étude a révélé que l'expression de miR-499-5p participe à l'apoptose cardiaque induite par le sepsis [10]. La famille des boîtes à haute mobilité (HMG) (SOX) liées à la région déterminant le sexe Y (SRY) est définie par un ensemble de gènes comprenant un domaine de liaison à l'ADN de classe HMG, dont l'identité de séquence avec SRY est supérieure à 50 % [11] . Le facteur de transcription Sox6 fait partie de la famille des HMG-box liées au SRY et est exprimé dans plusieurs tissus au cours de la progression, où il joue un rôle essentiel dans la transition des cellules progénitrices en prolifération vers les cellules fonctionnellement matures [12]. Il existe une étude rapportant que le Sox6 élevé est impliqué dans l'apoptose cardiaque induite par la septicémie [10]. Des études ont montré que l'expression de Sox2 et l'expression de Sox4 sont intensifiées dans le cancer du poumon à petites cellules humain [13, 14]. Mais la relation entre Sox6 et les lésions pulmonaires induites par la septicémie nécessite une étude plus approfondie. Ainsi, notre étude visait à explorer l'effet protecteur de miR-499-5p sur des souris atteintes de lésions pulmonaires induites par la septicémie en ciblant Sox6.

Matériaux et méthodes

Conformité aux normes éthiques

Toutes les expérimentations animales étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été autorisé par le Comité d'éthique des expérimentations animales de l'hôpital municipal de Weihai, Cheeloo College of Medicine, Shandong University.

Animaux d'expérimentation

Des souris BABL/c mâles en bonne santé et exemptes d'agents pathogènes (âgées de 6 à 8 semaines, pesaient de 18 à 22 g) ont été achetées au centre d'expérimentation animale de l'Université de Shandong (Shandong, Chine). L'environnement a été réglé à 24 ± 2 °C avec 12 cycles lumière-obscurité en alternance. Les souris ont été traitées avec un libre accès à de la nourriture aseptique et à de l'eau stérile. Les expériences ont commencé après une alimentation adaptative pendant 7 jours.

Établissement d'un modèle de lésion pulmonaire induite par une septicémie par ligature et ponction caecale (CLP) chez la souris

Les souris ont été réparties au hasard en 2 groupes :le groupe fictif (n = 8) et le groupe modèle. Les souris ont été à jeun pendant 12 h avant l'opération puis anesthésiées avec du pentobarbital sodique à 1 % (70 mg/kg) par injection intrapéritonéale. L'effet de l'anesthésie a été observé; la respiration et le rythme cardiaque des souris ont été remarqués. La tête et les membres des souris ont été fixés en décubitus dorsal, et la peau abdominale a été préparée et désinfectée par des boules de coton iodophore. Les souris du groupe modèle ont été traitées avec une incision longitudinale (1,0 cm) dans le segment médian de la ligne médiane abdominale, la cavité abdominale a été ouverte et le caecum a été retiré de la cavité abdominale en évitant de blesser les vaisseaux mésentériques. Il a été ligaturé avec un fil de soie 1-0 à 1/2 de l'extrémité du caecum, et le caecum a été perforé au bord controlatéral du mésentère avec une aiguille de ponction n° 16. Une quantité appropriée de contenu intestinal a été extrudée, le caecum a été remis en place et l'incision a été suturée. Après ouverture de la cavité abdominale, les souris du groupe simulé n'ont retiré que le caecum, puis le caecum a été remis en place. Les souris ont reçu une injection sous-cutanée de 1 ml de solution de chlorure de sodium à 0,9 % après l'opération, séparées dans des cages et nourries régulièrement.

Transfection In Vivo

Avant la modélisation, les souris ont été réparties en 7 groupes (n = 8) :le groupe modèle, le groupe miR-499-5p agomir, le groupe agomir contrôle négatif (NC), le petit groupe ARN interférent (si)-Sox6, le groupe si-NC, le miR-499-5p agomir + groupe surexpression (oe)-Sox6 et le groupe miR-499-5p agomir + oe-NC. Une heure avant le modelage, les souris ont été traitées selon le regroupement. Les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique à 1 % par injection intrapéritonéale, puis fixées en décubitus dorsal incliné à 45°, et la langue des souris a été déplacée de l'autre côté de la bouche pour assurer la perméabilité des voies respiratoires. La peau antérieure du cou des souris a été désinfectée et coupée pour exposer la trachée. Le complexe de transfection (50 L) a été absorbé par un micro-échantillonneur (égoutté conformément au groupe, la même quantité de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) a été égoutté dans le groupe modèle) puis lentement égoutté dans la trachée. Après la transfection, les souris ont été tournées verticalement et le complexe de transfection a été entièrement distribué dans les poumons [15]. Au cours du processus de transfection, les battements respiratoires et cardiaques des souris ont été observés. Si l'arrêt respiratoire et cardiaque se produisait, la transfection était immédiatement arrêtée et les voies respiratoires n'étaient pas obstruées. La transfection a été poursuivie lorsque la respiration et le rythme cardiaque des souris étaient stables. MiR-499-5p agomir et son NC ainsi que les plasmides correspondants de Sox6 ont été achetés auprès de Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Après transfection, les souris ont été séparées dans des cages et nourries pendant 1 jour, puis euthanasiées. Les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique à 1 % par injection intrapéritonéale, fixées en décubitus dorsal puis euthanasiées par saignée de l'aorte abdominale. La peau des souris a été désinfectée localement, la cavité thoracique a été ouverte, la trachée et la bronche principale droite ont été ligaturées, la bronche principale droite a été déconnectée et le poumon droit a été retiré. Le lobe inférieur du poumon droit a été placé dans du formol neutre à 10 % pour examen pathologique, le lobe moyen a été rapidement pesé pour calculer le poids humide (W) et cuit à 56℃, et le poids sec (D) a été calculé après 72 h, ainsi le rapport W/D a été calculé. Le lobe supérieur droit a été stocké dans de l'azote liquide pour la détection de l'ARNm et des protéines. Le poumon gauche a été lavé trois fois avec 0,4 ml de solution saline normale et environ 1 ml de liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) a été collecté, transféré dans un tube Eppendorf (EP) de 1,5 ml et placé sur de la glace. BALF a été centrifugé à 1500 tr/min pendant 5 min et transféré dans un nouveau tube EP, puis stocké à -80℃ pour la détection des facteurs inflammatoires.

De plus, les souris ont été divisées en 3 groupes (n = 10/groupe) :groupe sham, groupe modèle et groupe miR-499-5p agomir (50 μL miR-499-5p agomir ont été instillés dans la trachée 1 h avant la chirurgie). Le taux de survie a été surveillé toutes les 12 h, totalement pendant 7 jours. Le statut de survie des souris dans les 7 jours a été observé et la toxicité de miR-499-5p a été déterminée [16].

Score de coloration et de blessure à l'hématoxyline-éosine (H&E)

Les tissus pulmonaires ont été préparés en coupes de paraffine, colorés avec H&E et observés au microscope optique. Les lésions pulmonaires ont été notées (congestion alvéolaire, hémorragie, infiltration ou agrégation de neutrophiles dans la cavité alvéolaire ou la paroi vasculaire, épaississement de la paroi alvéolaire et/ou formation de membrane hyaline) par le système de notation pathologique des lésions pulmonaires publié par l'American Thoracic Society. 0 point n'indiquait aucune lésion ou des lésions très légères ; 1 point indiquait des lésions légères ; 2 points indiquaient des lésions modérées; 3 points indiquaient des lésions sévères; 4 points indiquaient des lésions très sévères. Le score total des quatre éléments représentait le score total des lésions pulmonaires [17].

Coloration de Masson et score

Les tissus pulmonaires ont été transformés en coupes de paraffine (4 µm) et traités par coloration de Masson [18]. Les fibres de collagène, le mucus et le cartilage étaient bleus, le cytoplasme, le muscle, la cellulose et la glie étaient rouges et les noyaux cellulaires étaient bleu-noir. Dans le système de notation semi-quantitative d'Ashcroft [19], 0 point indiquait un poumon normal; 1 point indiquait un léger épaississement fibreux de la paroi alvéolaire ou bronchique ; 3 points indiquaient un épaississement modéré de la paroi alvéolaire ou bronchiolaire sans endommager la structure pulmonaire ; 5 points indiquaient une aggravation de la fibrose accompagnée de lésions de la structure pulmonaire, formant des bandes ou des masses de fibres ; 7 points ont indiqué de graves dommages à la structure pulmonaire et de vastes zones de fibrose, formant des bandes ou des amas de fibres ; 8 points indiquaient tous les bourrages fibreux régionaux.

Marquage terminal à la désoxynucléotidyl transérase à la désoxyuridine triphosphate-biotine Nick End-Labeling (TUNEL)

L'apoptose des tissus pulmonaires a été testée par le kit TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) et observée au microscope optique. Les cellules apoptotiques étaient colorées en brun dans le noyau. L'indice d'apoptose indiquait le pourcentage de cellules TUNEL-positives [20].

Immunohistochimie

Les coupes de tissu pulmonaire ont été déparaffinées avec du xylène, incubées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % et bloquées avec du sérum de chèvre. Ensuite, Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) et SOX6 (ab30455, 1:500, tous de Abcam, MA, USA) ont été utilisés comme anticorps contre des coupes d'immunocoloration. Un microscope optique (Leica Microsystems, IL, USA) a été utilisé pour capturer des images qui ont ensuite été analysées avec le logiciel Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, USA) [21].

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)

Le kit OMEGA (Solarbio science &technology Co., Ltd., Pékin, Chine) a été adopté pour l'extraction de l'ARN total dans les tissus pulmonaires et la détermination de la concentration en ARN. L'ADN complémentaire (ADNc) a été composé par transcription inverse en ligne avec le kit de synthèse d'ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Les amorces ont été conçues par Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), comme indiqué dans le tableau 1. La réaction de PCR a été réalisée conformément au kit FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). L'expérience a été analysée quantitativement par 2 ^−△△Ct méthode. U6 était le contrôle de charge de miR-499-5p, et GAPDH était le paramètre interne d'autres gènes [22].

Analyse Western Blot

La protéine totale a été collectée en utilisant un tampon de lyse d'essai de radio-immunoprécipitation pour traiter les tissus pulmonaires. La concentration totale en protéines a été mesurée par la méthode à l'acide bicinchoninique. L'échantillon de protéine (30 g) a été traité par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sulfate de sodium à 10 %, transféré sur la membrane de fluorure de polyvinylidène, bloqué avec de la poudre de lait écrémé à 5 % et mis à réagir avec des anticorps primaires Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase -3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam ), interleukine-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, USA), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) et GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Californie, États-Unis). Ensuite, la membrane a été incubée avec l'anticorps secondaire (1:2000) et développée par chimiluminescence améliorée [23].

Essai immuno-enzymatique (ELISA)

Les niveaux d'IL-1β, IL-6 et TNF-α dans BALF ont été déterminés par kit ELISA (Boster, Hubei, Chine). La détermination colorimétrique a été réalisée à 450 nm.

Détection des indices de stress oxydatif

Les tissus pulmonaires dans l'azote liquide ont été pesés et dilués dans une certaine proportion de sérum physiologique à basse température, puis homogénéisés et centrifugés à 4℃, 3000 tr/min pendant 20 min à basse température, et le surnageant a été prélevé pour dosage. L'activité de la myéloperoxydase (MPO) a été testée par le kit de détection MPO (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine), et le malondialdéhyde (MDA), la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase (GSH-Px) et la catalase (CAT) ont été testés par des kits fournis par le JianCheng Bioengineering Institute.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

Sox6 peut être le gène cible de miR-499-5p qui a été établi par un site Web biologique (http://www.targetscan.org/vert_72/). Il y avait quatre sites de liaison entre miR-499-5p et la région non traduite de l'ARNm Sox6 3' (UTR). Les vecteurs de type sauvage pmiR-RB-REPORT-Sox6 (WT) et de type mutant pmiR-RB-REPORT-Sox6 (MUT) ont été construits par Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, Chine), et les plasmides rapporteurs de luciférase correspondants ont été généré. Cellules TC-1 (cellules épithéliales pulmonaires de souris, 1 × 10 ⁵ cellules/puits, Shanghai Yiyan biologique Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine) ont été ensemencées dans une plaque à 24 puits et transfectées avec miR-499-5p agomir ou agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT ou pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT via Lipofectamine2000. Un système de dosage double du gène rapporteur de la luciférase (Promega, WI, États-Unis) a été appliqué pour mesurer l'activité de la luciférase.

Analyse statistique

Toutes les données ont été analysées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure ont été transmises par la moyenne  ± déviation standard. Les comparaisons entre deux groupes ont été menées par t test, les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), et le test post hoc de Tukey a été utilisé pour une comparaison par paires après analyse ANOVA. La courbe de survie a été réalisée par la méthode de Kaplan-Meier. P value < 0.05 était indicatif d'une différence statistiquement significative.

Résultats

Le rapport W/D et Sox6 sont augmentés tandis que miR-499-5p est diminué dans les tissus pulmonaires des souris souffrant de lésions pulmonaires induites par le sepsis

La toxicité de miR-499-5p a été testée sur des souris pour détecter le temps de survie des souris septiques. Les résultats ont montré (Fig. 1a) que le taux de survie dans les 7 jours des souris du groupe fictif était de 100 % et que celui des souris septiques était réduit. Le taux de survie des souris septiques après le traitement miR-499-5p a été amélioré. Les résultats du rapport W/D des tissus pulmonaires ont démontré que (Fig. 1b) :par rapport au groupe fictif, le rapport W/D était augmenté dans le groupe modèle (P < 0,05). En comparaison avec le groupe agomir NC et le groupe si-NC, le rapport W/D a été réduit dans le groupe miR-499-5p agomir et le groupe si-Sox6 (tous deux P < 0,05). Le rapport W/D était nettement accru dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 par rapport au groupe miR-499-5p agomir + oe-NC (P < 0,05).

Le rapport W/D et Sox6 sont augmentés tandis que miR-499-5p est diminué dans les tissus pulmonaires des souris atteintes de lésions pulmonaires induites par la septicémie. un Courbe de survie des souris réalisée par Kaplan-Meier. b Rapport W/D du tissu pulmonaire dans chaque groupe. c Expression de miR-499-5p dans les tissus pulmonaires de souris. d Expression de l'ARNm Sox6 dans les tissus pulmonaires de souris. e Bande protéique de Sox6 par analyse western blot. f Expression protéique de Sox6 dans les tissus pulmonaires de souris. g Immunohistochimie Sox6 des tissus pulmonaires de souris. (a) P < 0,05 par rapport au groupe fictif. (b) P < 0,05 versus le groupe agomir NC. (c) P < 0,05 par rapport au groupe si-NC. (d) P < 0,05 versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-NC. Les données de mesure ont été représentées sous la forme d'une moyenne  ±  d'écart type, et les données ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

L'expression de MiR-499-5p et Sox6 a été détectée et nous avons constaté que (Fig. 1c-f) :contrairement au groupe fictif, miR-499-5p a diminué et Sox6 a augmenté dans le groupe modèle (tous deux P < 0,05). Par rapport au groupe agomir NC, miR-499-5p a augmenté et Sox6 a diminué dans le groupe miR-499-5p agomir (tous deux P < 0,05). Par rapport au groupe si-NC, Sox6 déprimé dans le groupe si-Sox6 (P < 0,05). En comparaison avec le groupe miR-499-5p agomir + oe-NC, Sox6 a considérablement augmenté dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

La teneur en protéines de Sox6 dans les tissus pulmonaires de souris septiques a été déterminée par immunohistochimie (Fig. 1g). Il a été observé que par rapport au groupe fictif, l'expression de la protéine Sox6 était augmentée dans le groupe modèle (P < 0,05) ; par rapport au groupe agomir NC et au groupe si-NC, une expression inférieure de la protéine Sox6 a été examinée dans le groupe miR-499-5p agomir et le groupe si-Sox6 (tous deux P < 0,05) ; par rapport au groupe miR-499-5p agomir + oe-NC, l'expression de la protéine Sox6 a été améliorée dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

MiR-499-5p restauré ou appauvri Sox6 soulage la pathologie des tissus pulmonaires, réduit le score de lésion pulmonaire, les fibres de collagène et le degré de fibrose pulmonaire dans les lésions pulmonaires induites par le sepsis Souris

Les résultats de la coloration HE ont montré que (Fig. 2a) :dans le groupe simulé, la structure du tissu pulmonaire était intacte, le septum alvéolaire se manifestait essentiellement sans œdème ni inflammation et la cavité alvéolaire était claire. Dans le modèle, les groupes agomir NC, si-NC et miR-499-5p agomir + oe-Sox6, une exsudation, un œdème et une hémorragie ont pu être observés dans la plupart des cavités alvéolaires des tissus pulmonaires, et une infiltration massive de cellules inflammatoires a été observée dans l'interstitiel pulmonaire. Dans les groupes miR-499-5p agomir, si-Sox6 et miR-499-5p agomir + oe-NC, la lésion des tissus pulmonaires était réduite par rapport au groupe modèle.

Le miR-499-5p restauré ou le Sox6 appauvri atténue la pathologie des tissus pulmonaires, réduit le score des lésions pulmonaires, les fibres de collagène et le degré de fibrose pulmonaire chez les souris atteintes de lésions pulmonaires induites par la septicémie. un Résultats de la coloration HE dans les tissus pulmonaires de souris. b Le score de lésion du tissu pulmonaire des souris dans chaque groupe. c Coloration de Masson du tissu pulmonaire chez la souris. d Les scores de fibrose pulmonaire des souris dans chaque groupe. (a) P < 0,05 par rapport au groupe fictif. (b) P < 0,05 versus le groupe agomir NC. (c) P < 0,05 par rapport au groupe si-NC. (d) P < 0,05 versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-NC. Les données de mesure ont été représentées sous la forme d'une moyenne  ±  d'écart type, et les données ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

Les résultats du score de lésion pulmonaire des souris et du score d'Ashcroft semi-quantitatif ont montré que (Fig. 2b, d) :par rapport au groupe fictif, le score de lésion pulmonaire et le degré de fibrose pulmonaire étaient manifestement améliorés dans le groupe modèle (P < 0,05). Par rapport au groupe agomir NC et au groupe si-NC, le score de lésion pulmonaire et le degré de fibrose pulmonaire ont été réduits dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous deux P < 0,05). Contrairement au groupe miR-499-5p agomir + oe-NC, le score de lésion pulmonaire et le degré de fibrose pulmonaire étaient nettement plus élevés dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

Les résultats de la coloration de Masson ont révélé que (Fig. 2c) :dans le groupe fictif, les tissus pulmonaires des souris contenaient une petite quantité de fibres de collagène bleu. Dans le modèle, les groupes agomir NC, si-NC et miR-499-5p agomir + oe-Sox6, les fibres de collagène étaient augmentées. Dans le groupe miR-499-5p agomir, si-Sox6 et miR-499-5p agomir + oe-NC, les fibres de collagène ont diminué par rapport au groupe modèle.

MiR-499-5p restauré ou Sox6 appauvri réduit les cellules positives TUNEL, l'expression des protéines Caspase-3 et Caspase-9 dans les tissus pulmonaires de souris atteintes de lésions pulmonaires induites par le sepsis

Les résultats du Western blot, de la coloration TUNEL et de l'immunohistochimie ont indiqué que (Fig. 3a–f) :le noyau normal était bleu et le noyau apoptotique était brun dans différentes nuances. Par rapport au groupe fictif, les cellules positives TUNEL, l'expression des protéines Caspase-3 et Caspase-9 ont été améliorées dans le groupe modèle (tous P < 0,05). Par rapport aux groupes agomir NC et si-NC, les cellules positives TUNEL, l'expression des protéines Caspase-3 et Caspase-9 ont été réduites dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous P < 0,05). Par rapport au groupe miR-499-5p agomir + oe-NC, les cellules positives TUNEL, l'expression des protéines Caspase-3 et Caspase-9 ont été intensifiées dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (tous P < 0,05).

Le miR-499-5p restauré ou le Sox6 appauvri réduit les cellules TUNEL positives, l'expression des protéines Caspase-3 et Caspase-9 dans les tissus pulmonaires de souris atteintes de lésions pulmonaires induites par la septicémie. un Cellules TUNEL positives dans les tissus pulmonaires de souris. b Nombre de cellules TUNEL positives dans les tissus pulmonaires de souris. c Immunohistochimie de la caspase-3 et de la caspase-9 dans le tissu pulmonaire de souris ; d Valeur moyenne de la DO de la caspase-3 et de la caspase-9 dans le tissu pulmonaire de souris. e Bandes protéiques de Caspase-3 et Caspase-9 dans les tissus pulmonaires de souris. f Expression des protéines Caspase-3 et Caspase-9 dans les tissus pulmonaires des souris de chaque groupe. (a) P < 0,05 par rapport au groupe fictif. (b) P < 0,05 versus le groupe agomir NC. (c) P < 0,05 par rapport au groupe si-NC. (d) P < 0,05 versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-NC. Les données de mesure ont été représentées sous la forme d'une moyenne  ±  d'écart type, et les données ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

MiR-499-5p restauré ou appauvri en Sox6 diminue les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le BALF et les tissus pulmonaires des lésions pulmonaires induites par le sepsis Souris

Les résultats des tests ELISA et Western blot ont montré que (Fig. 4a-g) :les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 ont augmenté dans le groupe modèle par rapport au groupe fictif (tous les P < 0,05). Par rapport aux groupes agomir NC et si-NC, les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 ont diminué dans les groupes miR-499-5p agomir et si-Sox6 (tous P < 0,05). Par rapport au groupe miR-499-5p agomir + oe-NC, les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 ont été augmentées dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (tous P < 0,05).

Le miR-499-5p restauré ou le Sox6 appauvri réduit les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le BALF et les tissus pulmonaires des souris atteintes de lésions pulmonaires induites par la septicémie. un Teneur en TNF-α dans le BALF des souris de chaque groupe. b Teneur en IL-1β dans le BALF des souris de chaque groupe. c Teneur en IL-6 dans le BALF des souris de chaque groupe. d bandes protéiques de TNF-α, IL-1β et IL-6 dans les tissus pulmonaires des souris de chaque groupe. e expression protéique du TNF-α dans les tissus pulmonaires des souris de chaque groupe. f expression protéique de l'IL-1β dans les tissus pulmonaires des souris de chaque groupe. G expression protéique de l'IL-6 dans les tissus pulmonaires des souris de chaque groupe. (a) P < 0,05 par rapport au groupe fictif. (b) P < 0,05 versus le groupe agomir NC. (c) P < 0,05 par rapport au groupe si-NC. (d) P < 0,05 versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-NC. Les données de mesure ont été représentées sous la forme d'une moyenne  ±  d'écart type, et les données ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

MiR-499-5p restauré ou appauvri Sox6 augmente les activités SOD, CAT et GSH-Px et réduit les contenus MDA et MPO dans les tissus pulmonaires induits par la septicémie Souris avec lésions pulmonaires

Les résultats de la détection des indices de stress oxydatif ont montré que (Fig. 5a-e) :par rapport au groupe fictif, les activités SOD, CAT et GSH-Px ont été altérées tandis que les teneurs en MDA et MPO ont augmenté dans le groupe modèle (tous les P < 0,05). Par rapport à l'agomir NC et aux groupes si-NC, les activités SOD, CAT et GSH-Px ont augmenté tandis que les contenus MDA et MPO ont diminué dans l'agomir miR-499-5p et les groupes si-Sox6 (tous P < 0,05). Par rapport au groupe miR-499-5p agomir + oe-NC, les activités SOD, CAT et GSH-Px sont supprimées tandis que les contenus MDA et MPO sont améliorés dans le groupe miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (tous P < 0,05).

Le miR-499-5p restauré ou le Sox6 appauvri augmente les activités SOD, CAT et GSH-Px et réduit les teneurs en MDA et MPO dans les tissus pulmonaires des souris atteintes de lésions pulmonaires induites par la septicémie. un Activité SOD dans les tissus pulmonaires de souris. b Teneur en MDA dans le tissu pulmonaire de souris. c Activité GSH-Px dans les tissus pulmonaires de souris. d Activité CAT dans les tissus pulmonaires de chaque groupe de souris. e Teneur en MPO dans les tissus pulmonaires de souris. (a) P < 0,05 par rapport au groupe fictif. (b) P < 0,05 versus le groupe agomir NC. (c) P < 0,05 par rapport au groupe si-NC. (d) P < 0,05 versus le groupe miR-499-5p agomir + oe-NC. Les données de mesure ont été représentées sous la forme d'une moyenne  ±  d'écart type, et les données ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey

miR-499-5p cible directement Sox6

Nous avons prédit via le site Web de bioinformatique TargetScan qu'il y avait des sites de liaison ciblés entre miR-499-5p et SOX4/6. À l'aide de la RT-qPCR, il a été constaté que par rapport au groupe fictif, l'expression SOX2/4/6 augmentait dans le groupe modèle et l'expression SOX6 augmentait principalement (tous les P < 0,05) ; par rapport au groupe agomir NC, le groupe miR-499-5p agomir n'a démontré aucun changement dans l'expression de SOX2 alors que l'expression de SOX4 a été réduite, principalement une diminution de SOX6 (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S1a, b). Par conséquent, nous avons finalement sélectionné SOX6 comme gène cible de miR-499-5p. Le site Web de prédiction biologique (http://www.targetscan.org/vert_72/) a révélé que miR-499-5p pourrait cibler Sox6 (Fig. 6a). Le double test du gène rapporteur de la luciférase a démontré que (Fig. 6b) par rapport au groupe témoin, l'activité de la luciférase était manifestement détruite après la co-transfection du vecteur pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT et de l'agomir miR-499-5p dans des cellules TC-1 (P < 0,05), alors que l'activité luciférase n'a montré aucune différence distincte après miR-499-5p agomir co-transfecté avec le vecteur pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT ou agomir-NC co-transfecté avec le vecteur pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT ( P> 0,05), suggérant que miR-499-5p pourrait se lier directement à Sox6 3′UTR WT, puis inhiber l'activité luciférase.

miR-499-5p cible directement Sox6. un La relation cible entre miR-499-5p et Sox6 fondée sur un site Web biologique. b Les résultats de la vérification du double test du gène rapporteur de la luciférase. *P < 0,05 par rapport au groupe NC mimé. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre deux groupes ont été effectuées par t tester