Nanocomposites de poly(N-isopropylacrylamide)-pyrrole thermosensible déclenchés par la lumière proche infrarouge pour la thérapie chimio-photothermique du cancer

Introduction

Le système d'administration de médicaments (DDS) est l'une des méthodes puissantes d'administration d'un composé pharmaceutique pour obtenir un effet thérapeutique dans le traitement du cancer [1]. Bien que le but du DDS soit de délivrer le médicament actif et de s'accumuler dans la zone souhaitée, le DDS conventionnel s'accompagne souvent d'effets secondaires graves et d'une efficacité thérapeutique inefficace [2, 3]. Pour surmonter ces obstacles, une variété de nanosupports, qui ont la capacité de répondre à des stimuli internes ou externes spécifiques, notamment la température, la lumière, le pH, le champ électrique, l'oxydoréduction, l'activité enzymatique et la concentration d'antigène, ont été développés pour les DDS avancés et utilisé pour induire une libération prolongée et contrôlée du médicament [4,5,6].

L'un des divers stimuli, le nanosupport thermosensible est une approche puissante pour améliorer le traitement du cancer, car les médicaments en nanoparticules pourraient être libérés à une certaine température [7]. De plus, l'avantage des nanoparticules thermosensibles pourrait être combiné à d'autres stimuli pour induire l'éradication complète du cancer [8, 9]. En tant que nanoparticule thermosensible, poly(N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) a reçu le plus d'attention, car il présente une transition de phase à une température de solution critique inférieure (LCST) d'environ 32 °C [10, 11]. En dessous du LCST, l'ensemble du réseau polymère dans le PNIPAM existe dans un état gonflé en raison des liaisons hydrogène. D'autre part, le PNIPAM passe à l'état hydrophobe et les liaisons hydrogène sont réduites, entraînant un effondrement du réseau polymère au-dessus du LCST [12, 13]. Comparé à d'autres nanoparticules, le nanosupport à base de PNIPAM présente l'avantage d'une efficacité élevée d'encapsulation de médicament, d'une capacité de libération contrôlée de médicament et d'une bonne biocompatibilité [14]. Cependant, en raison de la libération spontanée du médicament à la température corporelle, le nanosupport à base de PNIPAM n'est pas suffisant pour être utilisé dans le DDS avancé. Pour surmonter cela, les études précédentes ont ajouté les acides organiques (par exemple, l'acide vinylique acétique, acrylique et allylacétique) dans le processus de synthèse du PNIPAM, entraînant des effets secondaires réduits par la libération continue du médicament [15].

Récemment, un certain nombre d'études se sont concentrées sur de nouvelles approches thérapeutiques dans lesquelles l'intégration de deux ou plusieurs stimuli a déclenché des nanoparticules pour une efficacité thérapeutique accrue contre le cancer [16,17,18]. Par exemple, la thérapie photothermique (PTT) présente plusieurs avantages, tels qu'un contrôle précis de la lumière sur les tumeurs, une pénétration non invasive et une faible toxicité pour les cellules normales [19, 20]. Pour combiner les nanoparticules avec le PTT, les agents photothermiques (par exemple, les nanotiges d'or, les nanotubes de carbone, le polypyrrole (ppy) et l'oxyde de graphène) doivent être uniformément encapsulés dans des nanoparticules à base de PNIPAM [21,22,23]. L'étude précédente a fabriqué les nanotiges d'or recouvertes de silice mésoporeuses avec une coque PNIPAM thermo-réactive et sensible au pH et a exploré plus avant les applications de thérapie anticancéreuse in vivo [24]. Cependant, ces nanocomposites à base de PNIPAM nécessitent un processus de synthèse en plusieurs étapes. De plus, étant donné que les nanocomposites n'avaient pas de fraction de ciblage contre des cellules cancéreuses spécifiques, ils pourraient provoquer des effets secondaires graves sur d'autres organes ou tissus normaux. Dans notre rapport précédent, nous avons développé un système de libération contrôlée bidirectionnelle utilisant les propriétés thermo-sensibles et pH du PNIPAM [15]. Les nanogels PNIPAM ont été copolymérisés avec des contenus en acide acrylique (AAc) pour un contrôle efficace de la LCST. Pour mieux améliorer le ciblage du cancer et l'efficacité thérapeutique, nous avons développé la thérapie combinée ciblant le cancer en utilisant l'effet chimio- et photothermique (Schéma 1). À mesure que la température augmente par irradiation laser NIR, les médicaments des nanocomposites PNIPAM thermosensibles ont été libérés et l'effet photothermique a ensuite été activé. En raison de l'acide folique conjugué (AF), les nanocomposites à base de PNIPAM ont montré une efficacité thérapeutique significativement améliorée contre les cellules de cancer du sein MDA-MB-231.

Illustration schématique de a synthèse de lumière NIR et de nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA déclenchés par thermos et b application pour une thérapie combinée chimio-photothermique améliorée dans les cellules cancéreuses du sein

Matériaux et méthodes

Matériaux

NIPAM, N,N ′-méthylènebisacrylamide (MBA), persulfate de potassium (KPS, 99%), N-(3-Diméthylaminopropyl)-N Chlorhydrate d'′-éthylcarbodiimide (EDC) et N -L'hydroxysuccinimide (NHS) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La polyvinylpyrrolidone (PVP) et le pyrrole (98 %) ont été obtenus auprès d'Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). AAc a été acheté auprès de Dae Jung Chemicals &Materials. Co. Ltd (Corée). FA-PEG-amine (FA-PEG-NH₂ , MW :5 kDa) a été fourni par Nanocs, Inc. (New York, NY, États-Unis). Le chlorhydrate de doxorubicine (Dox) a été obtenu auprès de Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Tokyo, Japon). Tous les produits chimiques et matériaux ont été utilisés commercialement sans autre purification.

Synthèse de nanoparticule PNIPAM-AAc décorée ppy

Le PNIPAM thermo-sensible copolymérisé avec des nanoparticules d'AAc a été synthétisé selon le rapport précédent [15]. 1,13 g de monomère NIPAM, 0,077 g de MBA et 0,136 g d'AAc ont été dissous dans 100 ml d'eau désionisée et ajoutés dans un ballon à fond rond tricol de 250 ml. Au bout de 30 min, la température de réaction a été augmentée à 80 °C et sous agitation vigoureuse pendant 1 h. Pour induire la polymérisation, du KPS (1,5 mg) a été ajouté au mélange, suivi d'une agitation pendant 4 h. Le mélange a été dialysé contre une membrane de dialyse à poids moléculaire coupé (MWCO) de 12 à 14 kDa dans de l'eau déminéralisée pendant 7 jours pour éliminer le monomère n'ayant pas réagi, l'initiateur, les ions dispensables et la nanoparticule PNIPAM-AAc a été obtenue par lyophilisation pendant 48 h. Pour fonctionnaliser l'effet photothermique, ppy a été décoré en nanoparticules PNIPAM-Aac [25]. Le PVP (50 et 100 mg) et le monomère de pyrrole (50 et 100 μL) ont été rapidement ajoutés dans 10 mg/mL de solution de PNIPAM-AAc et ont été agités pendant 12 h à température ambiante. Ensuite, du KPS (3,4 mg) a été inséré dans la solution de PNIPAM-AAc et a été en outre agité pendant 14 h. Le PNIPAM-AAc décoré de ppy a été centrifugé trois fois avec de l'eau distillée. Les PNIPAM-ppy-5 et PNIPAM-ppy-10 ont été obtenus par lyophilisation pendant 48 h.

Synthèse de nanocomposites PNIPAM-ppy ciblés contre le cancer

Pour obtenir des nanocomposites PNIPAM-ppy ciblés contre le cancer (PNIPAM-ppy-FA), 10 mg de PNIPAM-ppy ont été dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 10 mL, pH 5,5) et ont été soumis aux ultrasons pendant 5 min. L'EDC (15 mg, 0,078 mmol) et le NHS (15 mg, 0,13 mmol) ont été ajoutés à la solution de PNIPAM-ppy. Après 1 h, FA-PEG-NH₂ (5 mg) a été ajouté et a été en outre agité pendant une nuit. FA-PEG-NH₂ n'ayant pas réagi , EDC et NHS dans une solution de PNIPAM-ppy ont été éliminés par une membrane de dialyse (MWCO 6-8 kDa) et les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été lyophilisés pendant 48 h.

Synthèse de nanocomposites PNIPAM-ppy-FA chargés de médicaments anticancéreux

10 mg de PNIPAM-ppy-FA ont été dissous dans de l'eau déminéralisée et ont été soumis aux ultrasons pendant 5 min. 0,5 mg/mL de Dox a été ajouté en gouttes à une solution de PNIPAM-ppy-FA, en agitant vigoureusement à température ambiante. Le Dox non chargé a été éliminé par centrifugation (14 000 tr/min, 10 min) et a été purifié avec de l'eau déminéralisée. Le PNIPAM-ppy-FA chargé en Dox (Dox@PNIPAM-ppy-FA) a été obtenu par lyophilisation pendant 48 h.

Caractérisation des nanocomposites NIR et thermo-sensibles PNIPAM-ppy-FA

La microscopie électronique à transmission (MET, JEOL-2100F, JEOL, Japon) a été utilisée pour caractériser la taille, la morphologie et la distribution des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA. Pour la mesure MET, les échantillons ont été préparés en plaçant une goutte de la solution d'échantillon dans de l'eau déminéralisée (concentration :1 g/L) sur une grille en cuivre de 200 mesh recouverte de carbone. La distribution granulométrique et la charge de surface des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA, qui ont été dissous dans de l'eau désionisée et soumis aux ultrasons pendant 5 minutes, ont été mesurées à l'aide d'un Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Royaume-Uni). La modification de surface et la liaison chimique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été confirmées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR). Les spectres FT-IR ont été enregistrés sur les pastilles de KBr à l'aide d'un instrument Nicolet iS50 (Thermo Fisher Scientific, Inc., États-Unis) dans la plage de 400 à 4000 cm ⁻¹ à une résolution de 4 cm ⁻¹ . La propriété optique et la capacité de charge Dox des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été observées par spectroscopie UV-Vis (UV 1800, Shimazu, Japon).

Propriété photothermique et photostabilité des nanocomposites NIR et thermo-sensibles PNIPAM-ppy-FA

La propriété photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA chargés Dox (Dox@PNIPAM-ppy-FA) a été évaluée en détectant les changements de température en temps réel. Dox@PNIPAM-ppy-FA a été dissous dans une solution aqueuse avec différentes concentrations de 0,05, 0,1 et 0,2 mg/mL et a été irradié pendant 20 min à l'aide d'un laser NIR de 808 nm (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., Chine) à une densité de puissance de 2 W/cm ² . L'influence de la densité de puissance du laser NIR a été étudiée par irradiation du laser NIR pendant 20 min avec une densité de puissance de 1, 2 et 3 W/cm ² , respectivement. De plus, pour étudier la stabilité photothermique contre le laser NIR, la solution Dox@PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/mL) a été exposée pendant 15 min et après le processus de refroidissement naturel cinq fois. Pendant l'irradiation laser NIR, la température de la solution Dox@PNIPAM-ppy-FA a été mesurée par un thermocouple relié à un thermomètre numérique (DTM-318, Tecpel Co., Taiwan) toutes les 60 s pendant 15 min.

NIR et libération de médicaments thermosensibles de nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Pour étudier les profils de libération de Dox par thermo-réponse, des solutions de Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 mg/mL) ont été préparées dans un flacon de 5 mL puis agitées à 25, 37 et 50 °C. À un temps de libération défini (0-72 h), le surnageant de chaque échantillon a été collecté par centrifugation et remplacé par un volume égal de milieu frais. La quantité de Dox libérée par les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été estimée par mesure de spectroscopie UV-Vis à 480 nm. De plus, le comportement de libération de Dox via une solution de Dox@PNIPAM-ppy-FA répondant aux stimuli laser NIR (1 mg/mL) a été vigoureusement agité à 37 °C et a été irradié pendant 10 min à des moments prédéterminés (1, 2, 3 , 4 et 5 h). Comme contrôle, une solution Dox@PNIPAM-ppy-FA sans irradiation laser NIR a été utilisée. Le Dox libéré a été déterminé par la méthode susmentionnée.

Analyse de cytotoxicité des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

La cytotoxicité des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA, y compris PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA, a été vérifiée en utilisant le test MTT. Les cellules A549 et MDA-MB-231 ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules par puits dans 200 µL de milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et ont été incubées à 37 °C sous atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ . Après 1 jour, 200 µL de nanocomposites PNIPAM-ppy-FA avec diverses concentrations (20 à 100 µL) ont été traités dans chaque cellule et la plaque a été incubée pendant 24 h. Les cellules ont été lavées avec du DPBS et le milieu a ensuite été remplacé par du milieu frais avec de l'agent MTT (0,5 mg/mL). Après une autre incubation de 4 h, le milieu a été soigneusement retiré et 200 µL de DMSO ont été ajoutés à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan violet internalisés. L'absorption a été mesurée à 595 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques iMark™ (Bio-rad, Hercules, CA, USA).

Analyse de l'absorption cellulaire des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Pour évaluer la capacité de ciblage vers des cellules cancéreuses spécifiques des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA, des cellules A549 et MDA-MB-231 ont été ensemencées dans une plaque à 8 puits (ibidi, Munich, Allemagne) à une densité de 2 × 10 ⁴ cellules/mL et ont été incubés pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été incubées avec des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA (60 ug/mL) pendant 6 h. Par la suite, les cellules ont été lavées deux fois avec du DPBS pour éliminer les nanocomposites restants et ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min. Après traitement de 0,1% de Triton-X pendant 15 min à température ambiante, les cellules ont finalement été colorées par Alexa Fluor 488 phalloïdine (1 : 200, Invitrogen, USA) pendant 1 jour à 4 °C et 4,6-diamidino-2- phénylindole (DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA) pendant 10 min, respectivement. Les images d'absorption cellulaire ont été observées en utilisant une microscopie confocale à balayage laser (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Allemagne).

Effets anticancéreux améliorés des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA via l'irradiation laser NIR

L'amélioration de l'efficacité thérapeutique à l'aide du NIR et du PNIPA-ppy-FA thermo-sensible sur les cellules cancéreuses du sein a été étudiée par dosage MTT. MDA-MB-231 (1 × 10 ⁴ cellules/mL) ont été ensemencés sur des plaques à 96 puits et ont été incubés pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été lavées avec du DPBS et des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA à différentes concentrations (20, 40, 60, 80 et 100 μg/mL) ont été ajoutés dans chaque puits d'une manière dépendante de la concentration. . Après incubation pendant une nuit, le milieu a été retiré, suivi par l'ajout de milieu frais. Pour les groupes d'irradiation laser NIR, les cellules ont été traitées avec 5 W/cm ² pendant 5 minutes. Ensuite, les MDA-MB-231 ont été lavés avec du DPBS et le milieu frais comprenant la solution de MTT a été ajouté. Après 4 h, le milieu a été soigneusement retiré et 200 L de DMSO ont été ajoutés dans chaque puits. Enfin, l'absorbance à 595 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques iMark™ pour déterminer la viabilité cellulaire. En tant qu'autre méthode d'observation des effets thérapeutiques du cancer, l'analyse des vivants et des morts a été réalisée. PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/mL) ont été traités dans MDA-MB-231. Après 24 h, les MDA-MB-231 ont été exposés avec ou sans irradiation laser NIR (5 W/cm ² , 5 min) et ont été colorées avec de la calcéine AM et de l'éthidium homodimère-1. Après 30 min, les cellules ont été lavées plusieurs fois avec du DPBS. Les images vivantes/mortes ont été obtenues en utilisant la microscopie à fluorescence inversée (Olympus Ix73, Japon).

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation de nanocomposites PNIPAM-ppy ciblés NIR et Thermos

Pour la génération de nanocomposites thermosensibles à base de PNIPAM, des nanoparticules de PNIPAM-AAc ont été fabriquées par une méthode de polymérisation radicalaire [15]. Pour contrôler la LCST via une irradiation laser NIR, le ppy a été recouvert par une réaction de polymérisation dans du PNIAPM-AAc tel que préparé. Le PNIPAM-ppy-FA ciblé contre le cancer a été synthétisé en conjuguant chimiquement FA-PEG-NH₂ au groupe carboxyle dans PNIPAM-AAc. Selon les images MET de la figure 1a, la morphologie, la taille et la dispersité de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA ont été observées. Tel que préparé, le PNIPAM-AAc présentait la forme homogène avec un diamètre moyen de 274,32 Â ± 11,62 nm. Après décoration du ppy, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA ont montré des tailles similaires avec 275,99 ± 11,41 et 285,77 ± 17,92 nm. La taille du PNIPAM-ppy-FA chargé de Dox a légèrement augmenté de 285,77 ± 17,92 à 290,73 ± 12,28 nm, indiquant que les médicaments anticancéreux étaient chargés dans des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA [26]. Fait intéressant, par rapport au PNIPAM-AAc, la présence du ppy dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA était clairement démontrée par de petites taches noires. De plus, en raison de la chaîne PEG, les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA étaient bien dispersés en solution aqueuse sans agrégation [27]. Les diamètres hydrodynamiques moyens de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été mesurés par analyse DLS (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S1). Les diamètres de PNIPAM-AAc, PNIPAM -ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA étaient respectivement de 432, 450,7, 468,6 et 486,7 nm. En raison de différentes méthodes d'analyse, le diamètre de chaque nanocomposite était plus grand que celui du MET, mais la taille des particules et la distribution des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA présentaient une tendance similaire.

un Images MET des nanocomposites PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA. b Analyse LCST de Dox@PNIPAM-ppy-FA par DLS. c Diamètres moyens du PNIPAM-AAc et du Dox@PNIPAM-ppy-FA en fonction des différentes conditions de température (à 25 °C, 37,5 °C et 50 °C)

Pour étudier l'influence du ppy polymérisé dans PNIPAM-AAc, les valeurs LCST de PNIPAM-AAc et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été mesurées à différentes températures (Fig. 1b). Par rapport à nos précédents travaux [15], la LCST de Dox@PNIPAM-ppy-FA était légèrement diminuée par rapport à celle de PNIPAM-AAc (42 °C). Cette différence pourrait être causée par les groupes carboxyle réduits dans le PNIPAM-AAc en raison du ppy polymérisé et du ligand de ciblage du cancer conjugué [28]. Par la suite, nous avons surveillé le changement de taille des particules en fonction de la température sur la figure 1c. Pour cela, les diamètres de PNIPAM-AAc et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été mesurés dans la plage de température de 25 à 50°C. Au fur et à mesure que la température augmentait, le PNIPAM-AAc diminuait de 436 à 177 nm. De plus, la taille de Dox@PNIPAM-ppy-FA a été considérablement réduite de 630 à 420 nm, ce qui indique que le ppy-décoré dans des nanocomposites PNIPAM n'a pas eu d'incidence importante sur les applications de DDS contrôlé et thermo-réactif [27].

Les valeurs de potentiel zêta de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont affiché le changement de surface des nanocomposites avant et après modification (Fig. 2a). Le potentiel zêta du PNIPAM-AAc était de − 37,1 ± 1,61 mV en raison des groupes carboxyle de l'AAc [29]. Les valeurs de PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA ont augmenté à − 29,6 ± 0,96 et − 15,6 ± 0,26 mV, indiquant que le polypyrrole chargé positivement et FA-PEG-NH₂ ont été introduits avec succès dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA [27]. En raison du Dox chargé négativement, le potentiel zêta de Dox@PNIPAM-ppy-FA est passé à des charges plus négatives (− 28,6 ± 0,23 mV). Comme le montre la figure 2b, la synthèse réussie de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA a été confirmée par spectroscopie FT-IR. Le spectre de PNIPAM-AAc a montré les pics de vibration d'étirement de C-N et CH₂ entre 1 100 et 1 200 cm ⁻¹ et les pics de C=O, N–H et COOH ont été observés à 1545, 1645 et 1750 cm ⁻¹ , qui appartenait au PNIPAM-AAc [15]. Le polypyrrole dans PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA a démontré les pics supplémentaires à 935 et 1050 cm ⁻¹ ont été observés [30]. Dans les spectres du PNIPAM-ppy-FA, les nouveaux pics de vibration sont apparus à 1107 et 2880 cm ⁻¹ , qui a attribué au C–O–C de la chaîne PEG. Ce résultat a indiqué la conjugaison chimique réussie de FA-PEG-NH₂ [31]. Cependant, le ligand de ciblage de FA n'a pas été détecté par FT-IR, car sa structure était similaire à celle du PEG. Pour confirmer la présence de FA dans les nanocomposites PNIPAM, PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA ont été réalisés par spectroscopie UV-Vis (Fig. 2c). Alors que les spectres de PNIPAM-AAc et PNIPAM-ppy (sans FA) n'ont montré aucun pic d'absorption, PNIPAM-ppy-FA a montré le pic supplémentaire à 280 nm, qui était distinctif dans FA [32]. Ce résultat a soutenu que les molécules FA ont été greffées sur des nanocomposites à base de PNIPAM.

un Analyse du potentiel zêta de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA. b Spectres FT-IR de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA. c Spectres UV-Vis de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA

Propriété photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA via l'irradiation laser NIR

Pour utiliser des nanocomposites à base de PNIPAM pour la thérapie photothermique, les propriétés optiques des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été examinées par spectroscopie UV-Vis. Comme le montre la figure 2c, le PNIPAM-AAc n'a montré aucune absorbance dans la région NIR (λ = 700–1000 nm). Cependant, les spectres de PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont manifestement montré la forte absorbance dans la même gamme due aux nanoparticules de ppy polymérisées. Ces résultats d'absorbance ont démontré que les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA pouvaient convertir la lumière NIR en chaleur [26]. Ensuite, nous avons évalué la propriété photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA par irradiation laser NIR (Fig. 3). Pour optimiser l'effet photothermique, PNIPAM-FA (sans pyrrole), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 μL) et PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μL) ont été préparés à la même concentration (0,1 mg/mL ) puis ont été exposés à une irradiation laser NIR de 808 nm à une densité de 2 W/cm ² pendant 20 min (Fig. 3a). La température du PNIPAM-ppy-10-FA a augmenté jusqu'à 14,5°C, ce qui était 2 fois plus élevée que celle du PNIPAM-ppy-5-FA. Comme contrôle, le PNIPAM-FA sans ppy a été irradié, mais la température a augmenté de façon négligeable (2,4 °C). Par conséquent, nous avons choisi PNIPAM-ppy-10-FA pour enquêter sur des expériences photothermiques supplémentaires. Pour observer les changements de température selon les concentrations, le laser NIR a été irradié au PNIPAM-ppy-FA à différentes concentrations (0,05, 0,1 et 0,2 mg/mL). Sur la figure 3b, en fonction de la concentration, la température a augmenté à 10, 14,5 et 18 °C, respectivement. De plus, la solution de PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/mL) a été irradiée avec différentes densités de puissance laser (1 à 3 W/cm ² ) sur la figure 3c. Comme prévu, l'élévation de température du nanocomposite dépendait fortement de la puissance du laser. Par la suite, nous avons observé la stabilité photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA sur la Fig. 3d. Bien que l'irradiation laser NIR ait été effectuée de manière répétitive au moins 5 fois, la température a augmenté régulièrement jusqu'à 33 °C, montrant que le nanocomposite PNIPAM-ppy-FA était un nanosupport approprié comme thérapie photothermique.

Performance photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA. un Analyse de température de Dox@PNIPAM-ppy-5-FA et Dox@PNIPAM-ppy-10-FA sous irradiation laser NIR 808 nm (2 W/cm ² ). b Analyse de température de différentes concentrations de Dox@PNIPAM-ppy-FA sous irradiation NIR 808 nm (2 W/cm ² ). c Effet photothermique de Dox@PNIPAM-ppy-FA avec différentes densités de puissance (1, 2 et 3 W/cm ² ). (D) Courbe de température de Dox@PNIPAM-ppy-FA sur cinq cycles marche/arrêt utilisant une irradiation laser NIR (2 W/cm ² )

NIR et libération de médicament thermosensible à partir de nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Pour évaluer les profils de libération de médicaments via NIR et thermo-réponse, nous avons analysé les propriétés d'encapsulation et de libération des nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA. Initialement, nous avons mesuré les spectres d'absorption UV-Vis du PNIPAM-ppy-FA chargé de médicament et un fort pic d'absorption a été observé près de 480 nm (Fig. 2c). Ce résultat a indiqué que Dox chargé avec succès dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA. L'efficacité de chargement Dox des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été calculée à 15 % en utilisant la courbe d'étalonnage Dox (données non présentées). Sur la figure 4a, le profil de libération de Dox de PNIPAM-ppy-FA a été étudié à différentes températures. Nous avons observé un comportement de libération de Dox pendant 72 h à 25 °C, 37 °C et 50 °C et la libération cumulée de Dox de PNIPAM-ppy-FA était de 15 %, 42 % et 67 %, respectivement. Étant donné que la LCST de PNIPAM-ppy-FA a légèrement diminué à 42 °C, la libération cumulée à la température corporelle s'est avérée relativement plus élevée que la température ambiante. Une grande quantité de Dox a été libérée, cependant, la Dox libérée n'a pas affecté l'efficacité thérapeutique, car les nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA ne pouvaient être internalisés que dans les cellules positives pour les récepteurs de folate, comme décrit précédemment [26, 32]. Au-dessus de la LCST (50 °C), la quantité de Dox des nanocomposites PNIAPM-ppy-FA était libérée quatre fois plus élevée que la température ambiante, ce qui suggère que les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA pourraient être utilisés dans un système de libération contrôlée de médicaments par réponse thermique. De plus, nous avons étudié le comportement de libération déclenchée par la lumière NIR des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA sur la figure 4b. La solution Dox@PNIAPM-ppy-FA (1 mg/mL) a été exposée au laser NIR (3 W/cm ² ) irradiation pendant 10 min et cette opération a été répétée toutes les 1 h. Pendant 6 h, la quantité totale de Dox via l'irradiation laser NIR a atteint 35 %, tandis que le profil de libération de Dox sans irradiation laser NIR était d'environ 5 % et 15 % (25 °C et 37 °C). Ce résultat a montré que l'irradiation laser NIR entraînait une température plus élevée que la LCST des nanocomposites et induisait la libération de Dox à partir des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA.

un Profils de libération Dox cumulés de Dox@PNIPAM-ppy-FA via thermo-réponse et b Irradiation laser NIR 808 nm

Analyse de la cytotoxicité et de l'absorption cellulaire des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Selon la littérature, la cytotoxicité des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été étudiée vis-à-vis des cellules cancéreuses du poumon et du sein (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S2) [33, 34]. Quelles que soient les concentrations de l'échantillon, après incubation avec PNIPAM-ppy-FA pendant 24 h, les deux viabilités cellulaires ont été observées (> 85 %). Par conséquent, nos nanocomposites PNIPAM-ppy-FA n'ont pas montré de cytotoxicité en tant que nanosupport pour les applications d'administration de médicaments [35, 36]. Pour déterminer si PNIPAM-ppy-FA pouvait sélectivement délivrer aux cellules cancéreuses, nous avons examiné les signaux fluorescents des nanocomposites intracellulaires PNIPAM-ppy-FA en utilisant la microscopie confocale à balayage laser (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S3). Les comportements d'absorption cellulaire des PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été évalués dans des lignées cellulaires négatives pour les récepteurs de folate (A549) et positives (MDA-MB-231) [37]. Après incubation des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 avec Dox@PNIPAM-ppy-FA, une forte fluorescence rouge a été observée, montrant que Dox@PNIAPM-ppy-FA étaient internalisés dans les lysosomes des cellules MDA-MB-231. En constante, lorsque PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été traités avec des cellules A549, les signaux Dox n'ont pas été observés. Ces images confocales ont démontré que les nanocomposites PNIAPM-ppy-FA pouvaient être sélectivement internalisés dans des cellules cancéreuses surexprimées par les récepteurs folates via la voie d'endocytose médiée par les récepteurs, comme décrit précédemment [38, 39].

Effets anticancéreux chimio-photothermiques des nanocomposites NIR et thermo-sensibles PNIPAM-ppy-FA

Pour confirmer l'efficacité thérapeutique de la combinaison in vitro des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA, les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été évalués sur des cellules MDA-MB-231 avec ou sans irradiation laser NIR et les viabilités cellulaires ont été évaluées par dosage MTT dans la Fig. 5a . Pour la thérapie photothermique, les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 avec PNIPAM-ppy-FA ont été incubées pendant 12 h et ont ensuite été exposées au laser NIR (5 W/cm ² , 5 minutes). La viabilité cellulaire des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 a diminué à 70-90% selon les concentrations de PNIPAM-ppy-FA. Pour confirmer le seul effet chimiothérapeutique, des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA chargés de Dox ont été traités. Nous avons observé que les viabilités diminuaient à 50 % en raison de la libération de Dox par les nanocomposites, ce qui correspond au profil de libération de la figure 4. Fait intéressant, après irradiation laser NIR dans les cellules MDA-MB-231 avec des nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA, le la viabilité cellulaire a considérablement diminué jusqu'à 24 %, ce qui était supérieur à ceux des groupes témoins (PNIPAM-ppy-FA avec irradiation laser NIR, Dox@PNIPAM-ppy-FA sans irradiation laser NIR). Ce résultat a indiqué un effet de synergie optimal de la thérapie combinée chimio-photothermique par irradiation laser NIR. De plus, pour observer directement l'efficacité thérapeutique dans les cellules cancéreuses, le test vivant/mort a été réalisé sur la figure 5b. En tant que groupe témoin, nous avons observé la viabilité de seules cellules MDA-MB-231 avec ou sans irradiation laser NIR (5 W/cm ² , 5 min) et la plupart des cellules présentaient une fluorescence verte (cellules vivantes). Il a démontré que l'irradiation laser NIR n'affectait évidemment pas la viabilité cellulaire. In addition, the MDA-MB-231 cells with PNIPAM-ppy-FA under NIR laser irradiation showed a few red fluorescence (dead cells), indicating photothermal therapeutic effect caused from PNIPAM-ppy-FA nanocomposites. Despite no NIR laser irradiation in MDA-MB-231 cells with Dox@PNIPAM-ppy-FA, a few sporadic red fluorescence was observed, indicating chemotherapy. Furthermore, when MDA-MB-231 cells were treated with nanocomposites and NIR laser irradiation, the most cancer cells exhibited a few red fluorescence [39, 40]. These results supported the synergistic therapeutic effects of chemo-photothermal therapy via NIR laser irradiation and thermo-responsive Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposites.

un Quantitative analysis of viability of MDA-MB-231 breast cancer cells treated with PNIPAM-ppy-FA and Dox@PNIPAM-ppy-FA with different concentrations and with or without 808 nm NIR laser irradiation. b Fluorescence images of live/dead assay in MDA-MB-231 cells after treatment of PNIPAM-ppy-FA and Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposites (60 μg/mL) with or without NIR laser irradiation. The live and dead cells are stained with Calcein AM (green) and Ethidium homodimer-1 (red). Scale bars are 200 μm

Conclusion

We have successfully constructed a cancer targeted NIR and thermo-responsive PNIPAM-ppy-FA nanocomposites for chemo-photothermal combination therapy. To induce the controlled release and photothermal effect via 808 nm NIR laser irradiation, ppy nanoparticles were uniformly decorated on PNIPAM-AAc by polymerization method. Dox-loaded PNIPAM-ppy-FA showed significant photothermal effect and photostability. Furthermore, Dox@PNIPAM-ppy-FA showed favorable properties of thermo-sensitive transition at different conditions and the drug release from PNIPAM-ppy-FA nanocomposites could be controlled by NIR light and thermo-response. In vitro studies verified that PNIPAM-ppy-FA nanocomposites showed excellent biocompatibility and enhanced therapeutic efficacy toward breast cancer cells. This enhanced anticancer efficacy via nanocomposites was contributed to the following reasons:(1) specific cellular uptake of nanocomposites in folate-receptor mediated endocytosis, (2) accumulated Dox release from PNIPAM-ppy-FA via NIR and thermo-response, and (3) synergistic therapeutic effect by chemo-photothermal combination. Therefore, our PNIPAM-ppy-FA nanocomposite could be potentially used as a multi-functional nanocarrier for synergistic therapeutic approaches toward different types of cancers with reduced side effect.

Disponibilité des données et des matériaux

Les données et l'analyse du présent travail sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Abréviations

PTT:

Thérapie photothermique

NIR :

Proche infrarouge

FA :

Acide folique

FA-PEG-NH₂ :

FA-PEG amine

LCST:

Lower critical solution temperature

PNIPAM :

Poly(N -isopropylacrylamide)

ppy:

Polypyrrole

TEM :

Transmission microscopy

UV–Vis:

Ultraviolet–visible spectroscopy