Le microARN à médiation HDAC1-124-5p régule le NPY pour affecter les capacités d'apprentissage et de mémoire chez les rats souffrant de dépression

Introduction

La dépression fait référence à une psychose invalidante grave qui entraîne de graves fardeaux économiques et des conséquences sociales à l'échelle mondiale [1]. La dépression se caractérise par des changements physiologiques, cognitifs et comportementaux qui menacent la santé globale des patients [2]. Les traitements accessibles à la dépression se sont développés avec l'application de la kétamine comme antidépresseur à action rapide et le raffinement d'équipements capables de répondre sélectivement à l'activité de populations de sous-types neuronaux [3]. De plus, des nanoarchitectures polyvalentes telles que les points de carbone sont applicables pour les troubles neurologiques [4]. Cependant, un traitement inadéquat de la dépression peut entraîner de mauvaises performances, des dysfonctionnements du comportement, des maladies physiques, la toxicomanie et même le suicide [5]. Ainsi, il existe un besoin désespéré de découvrir des agents innovants dans le traitement de la dépression.

Il a déjà été documenté que le niveau de microARN (miR)-124 augmente dans le plasma avec la dépression et les antidépresseurs [6]. Au cours de la dépression induite par un stress léger chronique imprévisible (CUMS), l'expression de miR-124 dans l'hippocampe montre des variations dynamiques, indiquant divers changements pathologiques à différents stades de la dépression [7]. De plus, miR-124 est le candidat pour améliorer les comportements de type dépressif dans le trouble dépressif majeur [8]. En outre, la suppression de miR-124 sert d'antidépresseur dans le cortex préfrontal, comme en témoignent les comportements atténués de type dépression chez la souris [9]. L'histone désacétylase 1 (HDAC1) est un médiateur de miR-124 [10] qui forme un complexe multiprotéique pour la régulation transcriptionnelle et la modification épigénétique [11]. À notre connaissance, une altération de l'activité HDAC1 favorise la résilience dans le trouble dépressif majeur [12]. De plus, la suppression de HDAC1 dans le cerveau peut améliorer les troubles de l'humeur et d'autres maladies cérébrales altérées neuroplastiquement [13]. Les inhibiteurs de HDAC pourraient atténuer les comportements anxieux et liés à la consommation d'alcool, et peuvent élever l'expression du neuropeptide Y (NPY) [14]. De plus, une altération de l'activité HDAC peut entraîner une augmentation de l'expression du NPY dans le noyau central de l'amygdale et le noyau médian de l'amygdale [15]. Le NPY est un neuropeptide orexigène hypothalamique suffisant pour prévenir l'anxiété, les troubles sociaux et les symptômes dépressifs [16]. En plus de cela, il a été démontré que le NPY et ses récepteurs imposent des effets anti-inflammatoires et antidépresseurs sur les modèles de rats souffrant de dépression induite par les lipopolysaccharides [17]. Pris ensemble, l'interaction combinée de l'axe HDAC1/miR-124-5p/NPY dans la dépression est ambiguë. Ainsi, cette étude a l'intention de déterrer le mécanisme de cet axe pour étudier un candidat curatif pour le traitement de la dépression.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

Les expérimentations animales impliquées dans cette étude ont été conformes aux exigences de l'éthique animale expérimentale du premier hôpital affilié de l'Université médicale de Harbin. Les expériences ont été optimisées pour améliorer les conditions d'alimentation des animaux expérimentaux, réduire le nombre d'animaux utilisés et soulager les souffrances des animaux.

Animaux expérimentaux

Des rats mâles Sprague-Dawley (SD) de qualité sans agent pathogène spécifique (SPF), pesant 200 à 220 g, ont été fournis par le Animal Research Center, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University (Harbin, Chine). Les rats ont été maintenus dans un environnement de qualité SPF (22 à 24 °C, 60 à 64 % d'humidité, cycles de lumière et d'obscurité de 12 h). À l'exception de la période de modélisation et d'autres moments spécifiques, les rats étaient libres d'obtenir de l'eau et de la nourriture.

Regroupement de rats et établissement de modèles

Les rats modélisés ont été répartis au hasard en 8 groupes (n = 10) :groupe normal (rats sans aucun traitement), groupe CUMS (rats dépressifs induits par CUMS), groupe témoin sh-négatif (NC) (rats dépressifs induits par CUMS injectés avec le lentivirus sh-HDAC1 NC), groupe sh-HDAC1 (rats souffrant de dépression induite par CUMS injectés avec le lentivirus sh-HDAC1), groupe anti-miR-NC (rats souffrant de dépression induite par CUMS injectés avec lentivirus anti-miR-124-5p NC), groupe anti-miR-124-5p (CUMS- rats souffrant de dépression induite injectés avec lentivirus anti-miR-124-5p), groupe anti-miR-124-5p + sh-NC (rats souffrant de dépression induite par CUMS injectés avec lentivirus anti-miR-124-5p et lentivirus sh-NPY NC) , et groupe anti-miR-124-5p + sh-NPY (rats dépressifs induits par CUMS injectés avec lentivirus anti-miR-124-5p et lentivirus sh-NPY).

Des modèles de rat de dépression induite par CUMS ont été établis par la méthode de Willner [18]. Les rats du groupe normal ont été nourris avec de la nourriture et de l'eau sans aucun stimuli tandis que les rats des 7 autres groupes ont reçu 35 jours de CUMS dans des cages indépendantes. Ces rats ont été stimulés par une nage dans de l'eau glacée à 4°C pendant 5 min dans un bac (30 cm de profondeur d'eau), une inversion diurne et nocturne (les rats restant dans l'obscurité pendant 12 h pendant la journée et dans un espace lumineux éclairé par lampes à incandescence pendant 12 h pendant la nuit), serrage de la queue par une pince à queue d'aronde pendant 30 s, secousses de 1 min, jeûne de 24 h et privation d'eau, stimulation ultrasonique de 30 min (50 Hz), rembourrage humide et climatisation à 17℃. Les rats ont été stimulés au hasard par l'un de ces stimuli quotidiennement, et le même stimulus n'a pas été appliqué plus de 5 fois au total.

Des rats ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique à 2 % (50 mg/kg) et l'hippocampe bilatéral (diamètre antéropostérieur = 4,8 mm, distance médiolatérale =  ± 2,5 mm, distance entre la cavité arrière et la fontanelle antérieure = −3,5 mm) a reçu une injection de lentivirus à 1 L/min par une micro-seringue Hamilton avec une aiguille 26-G. L'aiguille a été maintenue au site d'injection pendant 5 minutes pour éviter le reflux. Les crânes ont été scellés avec de la cire d'os et les incisions ont été suturées, et les rats ont été récupérés pendant 7 jours [19]. lentivirus sh-HDAC1 et sa NC, lentivirus anti-miR-124-5p et sa NC, ainsi que sh-NPY et sa NC (titre :10 ⁸ TU/mL) ont été achetés à GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, Chine).

Tests des fonctions comportementales

Les rats ont été pesés la veille de la modélisation CUMS (le 0 jour), après la modélisation CUMS (le 36e jour) et après l'interférence des lentivirus (le 52e jour).

Le test en champ ouvert (OFT) pourrait détecter les comportements autonomes et exploratoires des rats dans un nouvel environnement, qui était couramment utilisé pour évaluer les comportements dépressifs. Ce test a été réalisé dans une boîte à ciel ouvert en bois noire (100 cm x 100 cm x 50 cm) avec un système de suivi vidéo placé au-dessus de la boîte à champ ouvert pour enregistrer les activités des rats. Le fond de la boîte ouverte a été divisé en 25 grilles (20 cm x 20 cm) avec des lignes blanches. Les rats ont été placés dans la grille centrale dans un ordre aléatoire prédéfini et la quantité de franchissement de la grille (rats entrant dans une grille avec des membres ou des membres antérieurs doubles avec un membre postérieur) et l'incidence de l'élevage (rats soulevant les membres antérieurs et debout avec un membre postérieur) ont été enregistrés par le système de suivi vidéo. Ce test a été effectué dans un environnement intérieur calme et sombre. Après chaque test, la boîte à champ ouvert a été nettoyée avec de l'alcool à 75 % pour éliminer les odeurs.

L'anhédonie était l'un des symptômes cruciaux de la dépression. Le test de préférence pour le saccharose (SPT) pourrait évaluer les comportements de type dépressif des rats. Avant le SPT, chaque rat a reçu 2 bouteilles d'eau sucrée (1% de saccharose, p/p) pendant 24 h, et avec 1 bouteille d'eau stérile et 1 bouteille d'eau sucrée pendant encore 24 h. Après cela, le pourcentage de préférence pour le saccharose (SPP) des rats a été détecté comme suit :après 23 h de jeûne et de privation d'eau, les rats ont été autorisés à prendre 1 bouteille d'eau stérile et 1 bouteille d'eau sucrée (1% de saccharose) pendant 30 min. Après 1 h, l'emplacement des deux bouteilles a été inversé et les rats étaient libres de ces deux bouteilles pendant 30 minutes supplémentaires. Pendant cette 1 h, la consommation (mL) de ces deux bouteilles d'eau stérile et d'eau sucrée (1% de saccharose) a été mesurée et le SPP a été calculé. SPP = consommation d'eau sucrée/(consommation d'eau sucrée + consommation d'eau stérile) × 100%.

Le test du labyrinthe aquatique de Morris (MWM) a été largement appliqué pour évaluer les capacités d'apprentissage spatial et de mémoire des rats. Le test MWM a été réalisé dans un réservoir d'eau circulaire (150 cm de diamètre et 60 cm de hauteur) avec une profondeur d'eau de 40 cm. La température de l'eau a été maintenue à 22 ± ± 1 °C et l'eau a été teinte en noir avec un colorant non toxique et facile à nettoyer. Le réservoir et la surface de l'eau ont été divisés en 4 quadrants (quadrants SE, SW, NW et NE) avec chaque quadrant décoré de son icône correspondante avec une couleur vive et une forme spéciale sur la paroi intérieure. La plate-forme cible était une plate-forme circulaire transparente (11 cm de diamètre), située au centre du quadrant NE et immergée à 1,5 cm sous la surface de l'eau. Un système de suivi vidéo a été installé au-dessus du centre du réservoir pour enregistrer la vitesse de nage, la trajectoire et le temps passé par les rats à pénétrer dans la plate-forme cible et à nager dans les quadrants. Les rats ont été placés dans l'eau à partir de 4 quadrants dans un ordre aléatoire et ils ont été autorisés à explorer et à embarquer sur la plate-forme cible dans les 60 s. Le temps pris par les rats pour monter à bord de la plate-forme a été enregistré comme la latence d'échappement. Si les rats ne montaient pas à bord de la plate-forme cible dans les 60 s, ils étaient guidés et la latence d'échappement était enregistrée comme 60 s. Après chaque test, les rats ont été autorisés à rester sur la plate-forme cible pendant 15 s et les rats ont été entraînés 4 fois par jour pendant 5 jours. La latence d'échappement finale était la moyenne de la latence d'échappement du 3 au 5. Le 6ème jour du test MWM, un test d'exploration spatiale a été effectué. La plate-forme cible a été retirée du réservoir d'eau et les rats sont entrés dans l'eau par le quadrant SW. Le temps pendant lequel les rats nageaient dans le quadrant NE en 60 secondes a été enregistré comme temps d'exploration de l'espace.

La chronologie de cette expérience est illustrée à la figure 1.

Chronologie de la présente étude

Collection de spécimens

Un jour après le dernier test MWM, les rats ont été euthanasiés et injectés par voie intrapéritonéale avec du pentobarbital sodique à 2 % (50 mg/kg). La cavité thoracique a été ouverte pour obtenir du sang cardiaque avec une seringue, qui a été centrifugée 3 fois à 3500 tr/min pendant 15 min, et le surnageant a été conservé à - 20 °C. Après le prélèvement sanguin, un cathéter a été inséré du ventricule gauche à l'aorte, et 500 ml de solution saline normale ont été perfusés pour rincer le sang total. Les tissus hippocampiques ont été séparés et placés dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml, pesés et conservés à - 80 °C. Une partie de l'hippocampe a été fixée avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 2 h, déshydratée avec du saccharose en gradient et incluse dans de la paraffine.

Détection de l'indice de stress oxydant et inflammatoire

Le sérum a été réchauffé pour la détection de la superoxyde dismutase (SOD), de la malondialchehyche (MDA), du glutathion (GSH), de l'interleukine (IL)-β, du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et de l'oxyde nitrique (NO). Les kits de détection de SOD, MDA et GSH ont été fournis par le Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Chine), tandis que les kits ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) pour la détection de l'IL-β, du TNF-α et du NO par le NanJing JianCheng Bioengineering Institute ( Nanjing, Chine).

Coloration à l'hématoxyline-éosine (HE)

Les coupes en paraffine ont été déparaffinées, hydratées à l'éthanol, rincées à l'eau distillée et colorées avec une solution de coloration à l'hématoxyline pendant 20 min. Après cela, les sections ont été rincées avec de l'eau du robinet jusqu'à ce que les sections deviennent bleues. Ensuite, les coupes ont été placées dans une solution d'acide chlorhydrique éthanolique à 1 % pendant 10 s, rincées à l'eau du robinet et déshydratées à l'éthanol, ce qui a été suivi d'une coloration à l'éosine pendant 2 min, d'une déshydratation à l'alcool à haute concentration et d'une perméabilisation au xylène. Enfin, les coupes ont été scellées et observées au microscope biologique.

Détection d'expression de neurotransmetteur

Les tissus hippocampiques ont été pesés et homogénéisés par ultrasons dans une solution saline normale (100 μL/10 mg). L'homogénat a été maintenu à 4 °C pendant 30 min, centrifugé à 12 000 tr/min (4 °C) pendant 3 min pour récupérer le surnageant. La concentration en protéines du surnageant a été détectée par le kit de détection de protéines d'acide bicinchoninique (BCA) (CWBIO, Pékin, Chine) et les niveaux d'expression de la noradrénaline (NE), de la sérotonine (5-HT) et de la dopamine (DA) par des kits ELISA. Les kits ELISA NE, 5-HT et DA ont été fournis par Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Pékin, Chine).

Réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcription inverse (RT-qPCR)

L'ARN a été extrait des tissus hippocampiques par un kit d'extraction d'ARN (Promega, Madison, WI, USA), et la concentration et la pureté de l'ARN ont été détectées par un spectrophotomètre ultraviolet. Suivie des instructions du kit de transcription inverse (DRR047S, Takara, Dalian, Chine), une transcription inverse de l'ARN en ADN complémentaire (ADNc) a été réalisée. L'ARNm a été inversement transcrit en ADNc par le kit de RT-PCR en une étape GoldScript (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, États-Unis) tandis que le miARN par le kit de détection quantitative miARN Hairpin-it™ (GenePharma). Le kit de détection RT-qPCR (Promega) a été appliqué pour détecter l'expression de HDAC1, miR-124-5p et NPY dans les tissus. U6 a été indiqué comme contrôle interne pour miR-124-5p tandis que la -actine pour HDAC1 et NPY. Les amorces de PCR ont été obtenues auprès de Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Chine) (tableau 1). L'expression relative des gènes cibles a été calculée par 2 ^−△△ Méthode Ct.

Analyse Western Blot

Les tissus hippocampiques ont été découpés en morceaux sur de la glace et lysés par dosage de radio-immunoprécipitation lysat (Beijing Solarbio Science &Technology Co. Ltd., Pékin, Chine) pour extraire les protéines. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode BCA. La protéine totale (50 ug) a été ajoutée avec du tampon de charge 5 x   de dodécyl sulfate de sodium (SDS) à 1:4 et chauffée dans un bain d'eau bouillante pendant 5 min. Ensuite, la protéine a été soumise à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sulfate de sodium, électrotransférée sur une membrane et bloquée avec du lait à 5 % pendant 1 h. Après cela, la protéine a été sondée avec les anticorps primaires contre HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, California, USA) et la β-actine (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, Royaume-Uni) pendant la nuit et sondé avec un anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort. La membrane a été développée par chimiluminescence améliorée et la densité optique a été calculée par le logiciel d'analyse Quantity One Gray. L'expression protéique du gène cible a été exprimée comme le rapport de la valeur grise à la valeur grise de l'-actine.

Test d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Le test ChIP a été réalisé conformément aux instructions du kit EZ-ChIP (Millipore, Bedford, MA, USA). Les cellules HEK293T ont été incubées avec du formaldéhyde à 1 % pendant 10 min et terminées par de la glycine. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 2000 tr/min pendant 5 min et ajoutées avec du tampon de lyse SDS pour ultrasonication. Centrifugées à 10 000 g à 4℃ pendant 10 min, les cellules (100 L) ont été mises à réagir avec 900 L de tampon de dilution ChIP, 20 L de 50 × PIC et 60 L d'ADN de protéine Agarose/Sperme de saumon à 4℃ pendant 1 h, et ont été laissé au repos pendant 10 min. Les précipités ont été centrifugés à 700 rpm pendant 1 min avec 20 L en entrée. Un tube a été ajouté avec l'anticorps HDAC1 (1 L) et l'anticorps d'immunoglobuline G et l'autre tube a été ajouté sans anticorps. Les échantillons dans les deux tubes ont été incubés pendant une nuit, élués et déréticulés. Après la récupération de l'ADN, l'échantillon a été testé par RT-qPCR.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

Le site Web de bioinformatique (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) a analysé les sites de liaison de miR-124-5p et NPY. Les plasmides de type sauvage NPY (WT) et de mutant NPY (MUT) ont été générés par Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, Chine). Combiné avec mimic NC ou miR-124-5p mimic, les plasmides ont été transfectés dans des cellules HEK293T. L'activité de la luciférase cellulaire a été déterminée par le kit de détection de luciférase (BioVision) et le luminomètre Glomax20/20 (Promega).

Analyse statistique

Le logiciel statistique SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) a été utilisé pour l'analyse des données. Les résultats ont été exprimés en moyenne ±  écart type. Les comparaisons entre deux groupes ont été testées par t test. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), après quoi des comparaisons par paires par le test post hoc de Tukey. P représenté des tests bilatéraux et P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

L'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p augmente le poids des rats déprimés

Les rats ont été pesés 1 jour avant la modélisation CUMS (jour 0), 1 jour après l'arrêt de la modélisation (jour 36) et 7 jours après l'interférence des lentivirus (jour 52). Aucune différence n'a été détectée dans le poids corporel des rats dans chaque groupe avant la modélisation (tous les P> 0,05). Après modélisation, le poids du rat a diminué dans le groupe CUMS, le groupe sh-NC, le groupe sh-HDAC1, le groupe anti-miR-NC et le groupe anti-miR-124-5p par rapport au groupe normal (tous P < 0,05). Aucune différence n'a été remarquée quant au poids des rats dans le groupe CUMS, le groupe sh-NC, le groupe sh-HDAC1, le groupe anti-miR-NC et le groupe anti-miR-124-5p (tous P> 0,05). Après interférence, le poids du rat a diminué dans le groupe CUMS par rapport au groupe normal (tous les P < 0,05). Aucune différence n'a été remarquée quant au poids des rats dans le groupe CUMS, le groupe sh-NC et le groupe anti-miR-NC (tous P> 0,05). Le poids du rat a augmenté dans le groupe sh-HDAC1 et le groupe anti-miR-124-5p par rapport à leurs groupes NC (tous deux P < 0,05), indiquant que l'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p augmentait le poids des rats déprimés (Fig. 2a).

L'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p augmente le poids et améliore les capacités d'apprentissage et de mémoire des rats déprimés. un Effets de l'inhibition avec HDAC1 ou miR-124-5p sur le poids corporel des rats déprimés ; b SPP avant et après inhibition avec HDAC1 ou miR-124-5p; c Fréquence de croisement de la grille en OFT avant et après inhibition avec HDAC1 ou miR-124-5p; d Incidence de l'élevage en OFT avant et après inhibition avec HDAC1 ou miR-124-5p; e Latence d'échappement dans le test MWM avant et après inhibition avec HDAC1 ou miR-124-5p ; f Temps d'exploration spatiale en test MWM avant et après inhibition avec HDAC1 ou miR-124-5p; n = 10 ; un P < 0,05 par rapport au groupe normal ; b P < 0,05 par rapport au groupe sh-NC ; c P < 0,05 par rapport au groupe anti-miR-NC. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur et les comparaisons par paires par le test post hoc de Tukey

L'inhibition de SOIT HDAC1 ou miR-124-5p améliore les capacités d'apprentissage et de mémoire chez les rats déprimés

Les tests SPT, OFT et MWM ont été appliqués pour détecter le SPP, la fréquence de croisement de la grille et l'incidence de l'élevage, ainsi que la latence d'échappement et le temps d'exploration spatiale. Il a été souligné que (Fig. 2b-f) avant interférence, par rapport au groupe normal, SPP, la fréquence de franchissement de la grille, l'incidence de l'élevage et le temps d'exploration spatiale sont réduits, alors que la latence d'échappement est prolongée dans le groupe CUMS, sh-NC groupe, groupe sh-HDAC1, groupe anti-miR-NC et groupe anti-miR-124-5p (tous P < 0,05), suggérant le développement de comportements de type dépression chez les rats. Il n'y avait aucune différence dans SPP, la fréquence de franchissement de la grille, l'incidence de l'élevage, le temps d'exploration spatiale et la latence d'échappement entre le groupe CUMS, le groupe sh-NC, le groupe sh-HDAC1, le groupe anti-miR-NC et anti-miR-124 -5p groupe (tous les P> 0,05). Après interférence, versus le groupe sh-NC et le groupe anti-miR-NC, SPP, la fréquence de franchissement de la grille, l'incidence de l'élevage et le temps d'exploration spatiale ont augmenté tandis que la latence d'échappement a diminué dans le groupe sh-HDAC1 et anti-miR-124- Groupe 5p (tous les P < 0,05). Aucune différence n'a été observée dans le SPP, la fréquence de franchissement de la grille, l'incidence de l'élevage, le temps d'exploration spatiale et la latence d'échappement entre le groupe CUMS, le groupe sh-NC et le groupe anti-miR-NC (tous P> 0,05), suggérant que le silence de HDAC1 ou la suppression de miR-124-5p pourrait atténuer les comportements de type dépression et améliorer les capacités d'apprentissage et de mémoire chez les rats.

L'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p atténue les dommages neuronaux pathologiques chez les rats déprimés

L'observation des lésions hippocampiques par coloration HE (Fig. 3a) a révélé que les neurones bien disposés dans l'hippocampe des rats du groupe normal présentaient une morphologie claire, une structure normale, des couches denses, des noyaux cellulaires clairs et des nucléoles évidents. Les neurones des rats du groupe CUMS étaient rétrécis, diminués en nombre et disposés de manière lâche avec une chromatine inégalement répartie et une couche amincie. Les rats des groupes sh-NC et anti-miR-NC ont présenté la même situation que le groupe CUMS. Les rats des groupes sh-HDAC1 et anti-miR-124-5p présentaient une augmentation des neurones dans l'ordre et des dommages atténués par rapport à leurs groupes NC. Il a été indiqué que le knockdown de HDAC1 ou l'inhibition de miR-124-5p soulageait les lésions hippocampiques chez les rats déprimés.

L'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p atténue les dommages pathologiques de l'hippocampe et régule à la hausse l'expression des neurotransmetteurs chez les rats déprimés. un Coloration HE des lésions hippocampiques de rats déprimés ; b ELISA de l'expression de NE dans les tissus hippocampiques ; c ELISA de l'expression 5-HT dans les tissus hippocampiques ; d ELISA de l'expression de la DA dans les tissus hippocampiques ; n = 6; un P < 0,05 par rapport au groupe normal ; b P < 0,05 par rapport au groupe sh-NC ; c P < 0,05 par rapport au groupe anti-miR-NC. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur et les comparaisons par paires par le test post hoc de Tukey

L'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p régule l'expression des neurotransmetteurs chez les rats déprimés

La dépression était liée à des troubles des neurotransmetteurs cérébraux. Par conséquent, les niveaux de neurotransmetteurs DA, NE et 5-HT dans l'hippocampe de rat ont été mesurés par ELISA. Les résultats ont indiqué que (Fig. 3b-d) avec le groupe normal en revanche, des niveaux réduits de DA, NE et 5-HT ont été trouvés chez les rats du groupe CUMS, groupe sh-NC, groupe sh-HDAC1, anti-miR -Groupe NC et groupe anti-miR-124-5p (tous P < 0,05). Aucune différence n'a été observée dans l'expression des neurotransmetteurs dans le groupe CUMS, le groupe sh-NC et le groupe anti-miR-NC (tous P> 0,05). Par rapport aux groupes sh-NC et anti-miR-NC, les niveaux de DA, NE et 5-HT ont augmenté chez les rats des groupes sh-HDAC1 et anti-miR-124-5p (tous P < 0,05), ce qui implique qu'une régulation à la baisse de HDAC1 ou une réduction de miR-124-5p pourrait réguler à la hausse les niveaux de DA, NE et 5-HT dans l'hippocampe de rats déprimés.

L'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p supprime le stress oxydatif et l'inflammation chez les rats déprimés

L'expression des facteurs liés au stress oxydatif et inflammatoire dans le sérum a été mesurée. En ce qui concerne le groupe normal, les activités SOD et GSH étaient altérées, tandis que les niveaux de MDA, d'IL-1β, de TNF-α et de NO étaient augmentés dans les autres groupes de modèles de dépression (tous les P < 0,05). Les activités SOD et GSH, et les niveaux de MDA, IL-1β, TNF-α et NO parmi le groupe CUMS, le groupe sh-NC et le groupe anti-miR-NC n'ont montré aucune différence (tous les P> 0,05). En ce qui concerne le groupe sh-NC et le groupe anti-miR-NC, une augmentation a été observée dans les activités SOD et GSH et une diminution a été observée dans les niveaux de MDA, IL-1β, TNF-α et NO dans le sh- Groupe HDAC1 et groupe anti-miR-124-5p (tous P < 0,05) (Fig. 4a–f), indiquant que l'épuisement de HDAC1 ou la régulation à la baisse de miR-124-5p pourrait atténuer le stress oxydatif et l'inflammation chez les rats déprimés.

L'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p supprime le stress oxydatif et l'inflammation chez les rats déprimés. un –c Effet de l'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p sur la concentration de SOD, MDA et GSH dans le sérum de rats déprimés ; d –f Effet de l'inhibition de HDAC1 ou de miR-124-5p sur les concentrations d'IL-1β, de TNF-α et de NO dans le sérum de rats déprimés ; n = 10 ; un P < 0,05 par rapport au groupe normal ; b P < 0,05 par rapport au groupe sh-NC ; c P < 0,05 par rapport au groupe anti-miR-NC. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur et les comparaisons par paires par le test post hoc de Tukey

HDAC1 arbitre miR-124-5p pour réguler le NPY

L'analyse RT-qPCR et western blot a été adoptée pour la détection de HDAC1, miR-124-5p et NPY dans l'hippocampe. Il a été souligné que (Fig. 5a, b) par rapport au groupe normal, HDAC1 et miR-124-5p ont augmenté et NPY a diminué dans le groupe CUMS (tous les P < 0,05). L'expression HDAC1, miR-124-5p et NPY n'a montré aucune variation dans le groupe CUMS et le groupe sh-NC (tous P> 0,05). Par rapport au groupe sh-NC, le groupe sh-HDAC1 s'est traduit par une diminution de HDAC1 et miR-124-5p et des niveaux d'expression NPY élevés (tous les P < 0,05). Les résultats ci-dessus suggèrent l'interférence réussie des lentivirus et la relation positive entre miR-124-5p et l'expression HDAC1.

HDAC1 médie miR-124-5p pour réguler le NPY. un Expression de l'ARNm de HDAC1, miR-124-5p et NPY dans les tissus hippocampiques après inhibition de HDAC1 par RT-qPCR (n = 6) ; b Expression des protéines HDAC1 et NPY dans les tissus hippocampiques après inhibition de HDAC1 par analyse western blot (n = 6) ; c Expression de l'ARNm de MiR-124-5p et NPY dans les tissus hippocampiques après inhibition de miR-124-5p par RT-qPCR (n = 6) ; d Expression de la protéine NPY dans les tissus hippocampiques après inhibition de miR-124-5p par analyse western blot (n = 6) ; un P < 0,05 par rapport au groupe normal ; c P < 0,05 par rapport au groupe sh-NC. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur et les comparaisons par paires par le test post hoc de Tukey

En outre, l'expression de miR-124-5p et de NPY après la suppression de miR-124-5p a été détectée avec les résultats (Fig. 5c, d) démontrant que par rapport au groupe normal, miR-124-5p élevé et NPY réduit ont été présentés dans le groupe CUMS (à la fois P < 0,05). Au contraire, le groupe anti-miR-124-5p avait tendance à diminuer miR-124-5p et à augmenter le NPY par rapport au groupe anti-miR-NC (tous deux P < 0,05). Aucune divergence n'a été reconnue dans l'expression miR-124-5p et NPY dans le groupe CUMS et le groupe anti-miR-NC (tous deux P> 0,05). Les résultats étaient révélateurs de l'interférence réussie des lentivirus et de la connexion négative entre NPY et miR-124-5p.

Le test ChIP visait à tester si HDAC1 pouvait se lier au promoteur miR-124-5p, et les résultats ont montré que (Fig. 6a, b) HDAD1 n'était lié qu'au promoteur miR-124-5p (P < 0.001), indiquant que HDAC1 pourrait réguler directement miR-124-5p.

HDAC1 se lie au promoteur de miR-124-5p. un Abondance de liaison de la région du promoteur HDAC1 et miR-124-5p dans les cellules HEK293T par dosage ChIP (n = 3) ; b Abondance de liaison de HDAC1 et des régions intergéniques non apparentées dans les cellules HEK293T par test ChIP (n = 3) ; c Site de liaison MiR-124-5p et NPY par le site Web du logiciel d'information biologique ; d Relation de ciblage entre miR-124-5p et NPY par double dosage du gène rapporteur de la luciférase (n = 3) ; Les comparaisons entre deux groupes ont été testées par t tester

La relation de ciblage entre miR-124-5p et NPY a été prédite et vérifiée grâce à l'outil RNA22 et au test du gène rapporteur double luciférase (Fig. 6c, d). With respect to the cells co-transfection with NPY-3′UTR-WT and mimic NC, the cells with co-transfection of NPY-3′UTR-WT and miR-124-5p mimic showed impaired luciferase activity (P < 0,05). No difference was recognized in the luciferase activity in the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and mimic NC, and the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and miR-124-5p mimic (P  > 0.05).

Knockdown of NPY Abolishes the Protective Effects of Inhibited miR-124-5p on Depressed Rats

Spontaneous depletion of NPY and miR-124-5p was programmed to explore their interplay in depressed rats. It was exhibited that (Fig. 7a, b) lower NPY expression level was noticed in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (P < 0,05). Body weight and behavioral function tests illustrated that (Fig. 7c–f) by comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group presented reduced weight, SPP, frequency of crossing the grid, incidence of rearing and space exploration time with increased escape latency (all P < 0,05). HE staining of the hippocampal lesions pictured that (Fig. 8a) in comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the number of hippocampal neurons was reduced, and hippocampal neurons were darkly stained, sparsely and disorderly arranged in an irregular shape with reduced cell layers in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group. Moreover, versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group was accompanied by reduced DA, NE and 5-HT (all P  < 0.05) (Fig. 8b). Besides, impaired SOD and GSH activities, and increased MDA, IL-1β, TNF-α and NO levels existed in the rats of the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (all P  < 0.05) (Fig. 8c, d). Collectively, knockdown of NPY abolished the protective effects of repressed miR-124-5p on depressed rat.

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. un MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); b NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); c Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); e Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); f Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); Comparisons between two groups were tested by t tester

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. un HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); b ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n  = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n = 10). Comparisons between two groups were tested by t tester

Discussion

Depression is a type of psychiatric disorder comprising a variety of conditions with diverse symptoms [20]. Though emerging studies have implied the role of miRNAs in depression, the precise action of miR-124-5p has been rarely investigated. Hence, the present study is projected for better comprehension of the mechanism of miR-124-5p/HDAC1/NPY axis in depression with the major outcome elaborating that silencing of either HDAC1 or miR-124-5p up-regulated NPY to improve memory and learning abilities of depressed rats.

To begin with, this study discovered HDAC1 expression in hippocampal tissues with the findings suggesting the elevation in the HDAC1 expression. Subsequently, with the purpose to decipher the functional roles of HDAC1 in depressed rats, loss-of-function assays were performed and it was disclosed that knockdown of HDAC1 increased the body weight, improved learning and memory abilities, attenuated pathological damage, up-regulated neurotransmitter expression, and suppressed oxidative stress and inflammation in depressed rats. Currently, a study has implied an increment in the expression of HDAC1 in depressive-like and anxiety-like phenotypes resulted by stress-offspring [21]. Moreover, the expression of HDAC1 is documented to up-regulate in penumbra in photothrombotic stroke [22]. Besides that, the incremental HDAC1 mRNA expression is found in granule and pyramidal cells in temporal lobe epilepsy [23]. As to the functional role of HDAC1, it has been reported that virus-mediated overexpression of neuronal HDAC1 in the hippocampus of mice imposes influences on loss of contextual fear memory in particular [24]. Mechanically, HDAC inhibitors reverse cognitive deficits found in neurodegenerative diseases and age-related memory loss [25]. Actually, it is accepted that the HDAC1 suppression by tianeptinaline has advanced neuroplasticity and reinforced memory [26]. As mentioned in a prior study, it is concluded that repression of HDAC1 inhibits the pathogenic processes that lead to motor neuron degeneration in mitochondrial diseases [27]. Experimentally, the silencing of HDAC1 by 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type is partially involved in the prevention of neuronal cell death in Parkinson's disease models [28]. Further supported by those researches, the protective effects of silenced HDAC1 have been witnessed in brain diseases, including but not limited to depression.

Then, our study discovered a targeting relationship between HDAC1 and miR-124-5p, which was supported by a prior study which suggests miR-124 transcription is in the charge of EVI1, acting by connection with the deacetylase HDAC1 [29]. miR-124-5p was the overexpressed gene in depressed rats and knockdown of miR-124-5p had the similar functions of silenced HDAC1 in depressed rats. In fact, there is a study indicating that the expression of miR-124 in the hippocampus is up-regulated from 5 to 6 weeks in depression-like behavior phenotypes [7]. Another study has identified the increase in the miR-124 expression in female with cocaine use disorder [30]. Also, it is previously described that miR-124-3p is highly expressed in stressed rodents in major depressive disorder [31]. Regarding to the effects, knockdown of miR-124 in the prefrontal cortex is reported to attenuate depression-like behavior of mice [9]. Besides that, miR-124 knockdown is believed to serve as an antidepressant agent of chronic corticosterone-induced gypenosides in mice [32]. Drawn from a prior study, knockdown of miR-124 can result in improved behavioral susceptibility to a milder stress paradigm [33]. It is reported that suppression of miR-124 by lentivirus transfection in the hippocampus can protect ketamine-induced neurodegeneration in vivo and in vitro [34]. Anyway, miR-124-5p suppression is an active actor to attenuate depression.

Furthermore, NPY expression was verified to be regulated by HDAC1 and miR-124-5p. The deteriorated deficits associated with HDAC2 in histone acetylation may be related to the decreased expression of NPY and can used to control anxiety-like and drinking behaviors [14]. NPY was down-regulated in depressed rats and up-regulation of NPY promoted learning and memory ability recovery in depressed rats. In the development of depressive-like behaviors, the rat models are manifested with reduced NPY expression [17]. Academically, the expression of NPY is evidenced to decline in mice with depression [35]. Consistently, the above-mentioned study findings are as same as the previous literature to some extent.

The novel findings of study suggested that inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities and increased body weight of depressed rats. In addition, knockdown of miR-124-5p or inhibition of HDAC1 suppressed oxidative stress and inflammation and promoted neurotransmitter expression of depressed rats. Moreover, HDAC1 mediated miR-124-5p to regulate NPY. In the rescue experiments, knockdown of NPY abolished the protective effects of inhibited miR-124-5p on depressed rats.

Conclusion

In summary, this study highlighted the effect of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression with the major findings suggesting inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities, increased body weight, suppressed oxidative stress and inflammation, as well as promoted neurotransmitter expression in depressed rats. HDAC1/miR-124-5p/NPY axis may provide a reference to treat neurological disorder, which may also update the existed knowledge of depression. However, further studies are still required for thorough comprehension of the complex mechanism of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression.

Disponibilité des données et des matériaux

Non applicable.

Abréviations

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

Histone deacetylase 1

NPY:

Neuropeptide Y

CUMS:

Chronic unpredictable mild stress

SD :

Sprague–Dawley

SPF:

Specific pathogen-free

NC :

Negative control

OFT:

Open field test

SPT:

Sucrose preference test

SPP:

Sucrose preference percentage

MWM:

Morris water maze test

SOD:

Superoxide dismutase

MDA:

Malondialchehyche

GSH :

Glutathion

IL-β:

Interleukin-β

TNF-α:

Tumor necrosis factor-α

NO:

Nitric oxide

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

HE:

Hematoxylin–eosin

BCA:

Bicinchoninic acid

NE:

Norepinephrine

5-HT:

Serotonin

DA :

Dopamine

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

cDNA:

Complementary DNA

FDS :

Dodécyl sulfate de sodium

ChIP:

Chromatin immunoprecipitation

UTR:

Untranslated region

MUT:

Mutant type

WT:

Wild type

ANOVA:

One-way analysis of variance