Le miR-18b-3p exosomal des MSC de cordon ombilical humain réduit le risque de prééclampsie en ciblant la leptine

Résumé

Les exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses de cordon ombilical humain (hucMSC) exprimant des microARN sont mis en avant dans les maladies humaines. Cependant, le mécanisme moléculaire détaillé du miR-18b-3p exosomal des hucMSC sur la prééclampsie (PE) nécessite investigation. Nous étudions l'effet des exosomes et de l'axe miR-18b-3p/leptine (LEP) sur la survenue de PE. La morphologie des hucMSC et hucMSC-exosomes (Exos) est identifiée. Les exosomes sont infectés par différents lentivirus exprimant miR-18b-3p pour explorer son rôle dans la PE. Le modèle rat PE est établi par injection intrapéritonéale de N-nitro-L-arginine méthyl ester (L-NAME). L'expression de LEP et miR-18b-3p est testée dans les tissus placentaires de rats PE. L'effet des exosomes sur LEP et miR-18b-3p est détecté. La pression artérielle systolique (PAS), la protéinurie, les facteurs inflammatoires, le poids du fœtus et du placenta, et l'apoptose cellulaire chez les rats PE sont mesurés. La relation miR-18b-3p/LEP est vérifiée par test double luciferase et ARN pull-down. Les exosomes, la restauration de miR-18b-3p ou l'inhibition de LEP réduisent la PAS et la protéinurie, augmentent le poids fœtal/placentaire, diminuent les facteurs inflammatoires sériques et suppriment l'apoptose chez les rats PE, freinant la progression de la PE. miR-18b-3p est diminué et LEP augmenté dans le placenta PE. LEP est gène cible direct de miR-18b-3p. La surexpression de miR-18b-3p ou le traitement exosomal suppriment LEP et réduisent la PE, tandis que la sous-expression de miR-18b-3p a l'effet inverse. La réduction de LEP 역전 l'effet de la réduction de miR-18b-3p. Le miR-18b-3p exosomal des hucMSC cible LEP pour participer à la survenue et au développement de la PE. Cette étude fournit une base théorique novatrice pour le mécanisme et l'investigation de la PE.

Introduction

La prééclampsie (PE), caractérisée par protéinurie et hypertension, est une cause majeure de mortalité/morbidité fœtale et maternelle. Son étiologie et sa pathogénie restent obscures, associées à une invasion trophoblastique anormale entraînant dysfonction endothéliale maternelle, malperfusion placentaire chronique et hypertension avec issues défavorables. Hormis l'accouchement, il n'existe pas de thérapie spécifique. Il est urgent d'explorer des cibles thérapeutiques pour améliorer le pronostic.

Le cordon ombilical humain (huc) est une source adéquate de cellules souches mésenchymateuses (MSC) qui sécrètent divers facteurs trophiques et cytokines, avec de fortes capacités anti-inflammatoires et immunomodulatrices. Une étude a vérifié que la PE accélère l'expression de marqueurs neurogliaux dans les MSC de gelée de Wharton du cordon. Un effet protecteur des exosomes hucMSC sur la morphologie placentaire et l'angiogenèse chez rats PE a été rapporté. Les exosomes sont de petites vésicules sécrétoires (50–100 nm) médiant la communication intercellulaire dans le microenvironnement tumoral via encapsulation/transmission de facteurs cancérigènes. Une étude a révélé le transfert efficace de sFlt-1 et sEng dans les cellules endothéliales par exosomes chez patientes PE, altérant les fonctions vasculaires. Les microARN (miARN) sont des ARN non codants endogènes (18–25 nt) régulant l'expression génique post-transcriptionnelle. Des données montrent que l'expression de miR-18b affecte l'invasion, la viabilité et la migration des cellules trophoblastiques dans la PE. Wu et al. ont proposé que miR-18b atténue la prolifération des cellules endothéliales rétiniennes humaines induite par glucose élevé, offrant un aperçu sur la rétinopathie diabétique. Cependant, le rôle du miR-18b-3p exosomal des hucMSC dans la PE reste inconnu. La leptine (LEP) a des effets pléiotropes sur différenciation/prolifération cellulaire et immunité, provenant principalement d'adipocytes mais aussi du placenta. Une méthylation anormale du promoteur LEP est impliquée dans la progression PE. Le placenta est un site majeur d'expression de LEP pendant la grossesse. La relation de liaison miR-18b-3p/LEP reste élusive. Nous explorons le rôle du miR-18b-3p exosomal des hucMSC dans la PE avec implication de LEP, hypothèse : inhibition de la progression PE via ciblage de LEP.

Matériaux et méthodes

Approbation éthique

Étude approuvée par le Comité d'éthique de l'Hôpital du Peuple de l'Université de Wuhan. Consentement éclairé signé. Expériences animales conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Comités internationaux Hôpital du Peuple Wuhan).

Isolation, culture et identification des hucMSC

Cordon ombilical de parturiente saine collecté, haché, tamisé, mélangé PBS. Centrifugation 1500 tr/min 5 min (rayon 10 cm). Suspension dans DMEM/F12 + 10 % FBS, flacon culture. Changement milieu jour 4, puis tous les 3 jours. Sous-culture à 90 % confluence. Morphologie adhésive observée microscope inversé. Coloration Oil Red O (Beyotime) pour différenciation adipogénique ; coloration phosphatase alcaline (ALP, Beyotime) pour ostéogénique. Cytométrie flux (Beckman Coulter) : CD73, CD166 (1:10, BD Biosciences), CD105 (1:20, AbD Serotec).

Extraction et identification des hucMSC-Exos

hucMSC bien cultivés. Surnageant collecté, centrifugation 28 500 tr/min 1 h (rayon 10 cm). Surnageant éliminé, cellules fixées glutaraldéhyde 2 % + acide osmique 1 %, déshydratation éthanol, immersion oxyde de propylène, séchage 2 h, inclusion Epon812, coupe. Coloration uranium/plomb. Observation microscope électronique. Détecteur Nanosight (Malvern) : mouvement brownien, taille particules. Marqueurs surface hucMSC-Exos par Western blot : CD9, CD81, CD63 exprimés.

Méthode infection lentivirale

hucMSC infectés lentivirus vecteur faible expression miR-18b-3p et NC (GenePharma, Shanghai). Obtention hucMSC-antagomir NC et hucMSC-miR-18b-3p antagomir stables. Culture 48 h, surnageant collecté, ultracentrifugation → Exos-antagomir NC et Exos-miR-18b-3p antagomir.

Animaux expérimentaux

Rats Wistar (200–250 g, 8 semaines, sexe indifférent), niveau santé-propre, maturité sexuelle (Centre Animal Wuhan). Élevage barrière : 18–28 °C, humidité 40–70 %, aliment/eau ad libitum.

Établissement modèle rat PE

Injection intrapéritonéale 50 mg/kg L-NAME (Beyotime) jour 13 à 20 gestation (référence [17]). Succès : PAS augmentée ≥20 mmHg et >115 mmHg + protéinurie accrue.

Groupes animaux

Cohabitation femelle/mâle 1:1, cage individuelle jour précédent 17-18h. Détection sperme sécrétions vaginales (bouchon vaginal + microscope) lendemain. Si positif simultané : jour 0 gestation. À partir jour 13 : 6 groupes (10 rats/groupe) : normal (saline intrapéritonéale jour 13-20 + 20 µL saline placenta jour 16-19), PE (L-NAME 50 mg/kg/jour 13-20 + 20 µL saline placenta jour 16-19), PE+miR-NC (L-NAME + 20 µL 4 nmol miR-NC placenta jour 16-19), PE+miR-18b-3p agomir (L-NAME + 20 µL 4 nmol miR-18b-3p agomir placenta jour 16-19), PE+miR-18b-3p antagomir (L-NAME + 20 µL 4 nmol miR-18b-3p antagomir placenta jour 16-19), PE+miR-18b-3p antagomir+si-LEP (L-NAME + 20 µL 4 nmol miR-18b-3p antagomir + si-LEP placenta jour 16-19), PE+si-LEP (L-NAME + 20 µL 4 nmol si-LEP placenta jour 16-19). Traitement exosomes + exosomes lentivirus : 5 groupes (10 rats) : normal (saline), PE (L-NAME + saline placenta), PE+Exos (L-NAME + 20 µL Exos 80 µg/20 µL saline placenta jour 16-19), PE+Exos-antagomir NC (L-NAME + Exos-antagomir NC), PE+Exos-miR-18b-3p antagomir (L-NAME + Exos-miR-18b-3p antagomir).

Détection PAS et protéinurie 24 h

PAS : mesure pression artérielle queue-rat (Tensys Medical, San Diego). Mesure jours 10, 13, 16, 19 gestation. 3 mesures rapprochées, moyenne retenue. Protéinurie 24 h : urine collectée jours 10, 13, 16, 19 (régime libre), dosage protéines service néphrologie Hôpital du Peuple Wuhan.

Prélèvement échantillons

Jour 21 gestation : anesthésie pentobarbital sodique 3 %. Sang périphérique prélevé, centrifugé, sérum -20 °C. Césarienne : fœtus et placenta prélevés, membranes fœtales/cordon ombilical retirés, cordon coupé. Placenta/fœtus sur gaze stérile, séchage sang/liquide amniotique, pesée. Partie placenta : fixation 4 % paraformaldéhyde, déshydratation éthanol, clarification xylène, inclusion paraffine, coupes transversales continues 5 µm pour HE et TUNEL. Reste -80 °C pour RT-qPCR, Western blot, ELISA.

ELISA

TNF-α, IL-1β, IL-6 sériques : kits R&D Systems (Minneapolis). DO 490 nm lecteur micropuces (Thermo Fisher). Courbe étalon DO/abscisse, concentration/ordonnée. Calcul concentrations.

Coloration HE

Coupes paraffine : xylène, alcool gradient, hématoxyline, différenciation HCl alcool 1 %, retour bleu ammoniaque 1 %, contre-coloration éosine 1 %, déshydratation (75, 90, 95 %, alcool absolu), xylène, séchage, montage, observation microscope électronique.

Coloration TUNEL

Coupes paraffine : déparaffinage, déshydratation routine. Apoptose : kit TUNEL (Nanjing Kejin). DAPI (Shanghai Baitai) pour cellules TUNEL+ microscope fluorescence (Nikon).

RT-qPCR

Tissus placenta pesés. 50–100 mg + 1 mL TRIzol (Invitrogen), dissolution complète. +200 µL chloroforme, centrifugation 4 °C 12 000 tr/min, ARN total. Concentration/pureté : spectrophotomètre DU-800 (Beckman). Contrôles charge : U6, β-actine. Amorces Sangon Biotech (Shanghai). Transcription inverse : kit Sangon. PCR amplifiée, produits vérifiés électrophorèse agarose. Données : méthode 2⁻ΔΔCt.

Western Blot

Protéines totales placenta : tampon lyse RIPA (Beyotime). hucMSC-Exo : tampon abstraction, centrifugation 14 000 tr/min. Surnageant pour marqueurs exosomaux CD81, CD63, CD9 sériques. Concentration protéines : kit BCA (Beyotime P0010). Chargement selon quantification, électrophorèse SDS-PAGE 10 %, transfert membrane. Blocage lait écrémé 5 %. Anticorps primaires LEP, CD63, CD81, CD9, β-actine (4 mL, 1:1000, Santa Cruz). Anticorps secondaires chèvre anti-lapin IgG/peroxydase (4 mL). Revelation. β-actine référence interne. Analyse densitométrique Image Lab.

Test double luciferase

Prédiction cible miR-18b-3p/LEP et site liaison 3'UTR LEP : logiciel https://cm.jefferson.edu/. Séquence promoteur 3'UTR LEP contenant site liaison miR-18b-3p composée. Plasmides LEP 3'UTR-WT et LEP 3'UTR-MUT construits. Co-transfection cellules 293T : miR-18b-3p mimic + LEP 3'UTR-WT ; mimic + LEP 3'UTR-MUT ; mimic NC + WT ; mimic NC + MUT. 30 h. Activité luciférase lucioles/renilla : kit double luciferase (Promega).

Test ARN pull-down

Sondes ARN biotinylées (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p, Bio-miR-18b-3p-Mut) incubées lysat cellules 293T, extraction billes magnétiques streptomycine. Kit Pierce magnetic RNA pull-down (Pierce). ARN élué/purifié TRIzol (Pierce). Enrichissement LEP quantifié RT-qPCR.

Analyse statistique

SPSS 21.0 (IBM). Moyenne ± écart-type. Test t indépendant (2 groupes). ANOVA unidirectionnelle + Tukey post-hoc (groupes multiples). Seuil significativité p < 0,05.

Résultats

Morphologie et identification hucMSC et hucMSC-Exos

Masses tissulaires cordon observées microscope inversé. Jour 3 : cellules migraient hors masse. Jour 5 : forme fusiforme, filandreuses, croissance en colonies. Passage 3 : morphologie uniforme fuseau long, type fibroblaste, arrangement régulier (Figure 1a). 2 sem adipogénique : gouttelettes lipides cytoplasme, structure Kranz microscope inversé (Figure 1b) → capacité adipogénique. 2 sem ostéogénique : nombreux nodules calcium bruns microscope inversé (Figure 1c) → capacité ostéogénique. Cytométrie : surexpression marqueurs surface MSC CD73, CD105, CD166 (Figure 1d).

Morphologie hucMSC-Exos MET : exosomes ronds/ovaux, densité centrale faible, coloration épaisse bords (Figure 1e). Nanosight : taille 40–100 nm, pic ~80 nm (Figure 1f). Western blot : CD81, CD63, CD9 exprimés (Figure 1g).

La restauration de miR-18b-3p atténue les caractéristiques pathologiques rats PE

PAS et protéinurie 24 h (Figure 2a,b) : pas différence jour 10 (avant traitement). Jour 19 : pas différence rats normaux. Rats PE ou PE+miR-NC/miR-18b-3p agomir/antagomir/antagomir+si-LEP/si-NC/si-LEP : PAS/protéinurie augmentent jour 13. Pas différence jour 16/19 rats PE+miR-18b-3p agomir et si-LEP. Rats PE : PAS/protéinurie augmentées jour 19 ; augmentation réduite par élévation miR-18b-3p, majorée par inhibition miR-18b-3p ; réduction LEP abolit rôle downregulation miR-18b-3p sur PAS/protéinurie jour 19.

Poids fœtus/placenta (Figure 2c,d) : réduits rats PE ; miR-18b-3p up ou LEP down augmentent ; miR-18b-3p down diminue ; silencing LEP 역전 effet inhibition miR-18b-3p.

Facteurs inflammatoires sériques (Figure 2e) : TNF-α, IL-1β, IL-6 augmentés rats PE ; miR-18b-3p up ou LEP inhibition suppriment ; miR-18b-3p down favorise ; déplétion LEP abolit effet inhibition miR-18b-3p.

La surexpression de miR-18b-3p améliore les changements histopathologiques placenta rats PE

Rats normaux : villosités placentaires riches vaisseaux, structure claire, syncytiotrophoblastes principaux, peu cytotrophoblastes. Rats PE ou PE+miR-NC/antagomir/si-NC/antagomir+si-LEP : villosités diminuées, structure floue/atrophique, nécrose fibrinoïde, nodules syncytiotrophoblastiques augmentés, villosités immatures, trophocytes réduits. Changements pathologiques atténués rats PE+miR-18b-3p agomir et si-LEP (Figure 3a).

TUNEL (Figure 3b,c) : peu cellules apoptotiques normaux. Rats PE : apoptose augmentée, réduite par miR-18b-3p up et silencing LEP, majorée par inhibition miR-18b-3p ; silencing LEP 역전 effet inhibition miR-18b-3p. Ensemble : rats miR-18b-3p up ou LEP inhibé → degré progression PE réduit histologiquement ; silencing LEP abolit effet thérapeutique inhibition miR-18b-3p.

miR-18b-3p sous-exprimé, LEP surexprimé dans placenta rats PE ; miR-18b-3p cible LEP

Western blot + RT-qPCR (Figure 4a-c) : rats PE : miR-18b-3p diminué, LEP augmenté ; traitement miR-18b-3p agomir : miR-18b-3p up, LEP down ; traitement antagomir : LEP up ; silencing LEP 역전 effet promoteur downregulation miR-18b-3p sur LEP.

Rôle exosomes (Figure 4d-f) : exosomes up miR-18b-3p, down LEP chez rats PE → effet suppresseur développement PE. Exosomes portant miR-18b-3p antagomir → down miR-18b-3p, up LEP.

Relation cible (Figure 4g-i) : prédiction bioinformatique (https://cm.jefferson.edu/) → site liaison. Double luciferase : mimic miR-18b-3p diminue activité luciferase LEP 3'UTR-WT, pas effet sur MUT. ARN pull-down : enrichissement LEP augmenté par WT-biotin-miR-18b-3p. LEP est gène cible direct miR-18b-3p.

Les hucMSC-Exos atténuent les caractéristiques pathologiques rats PE

PAS/protéinurie (Figure 5a,b) : pas différence jour 10. Jour 19 : pas différence normaux. Rats PE : augmentation jour 13. Pas différence jour 16/19 rats PE+Exos et PE+Exos-antagomir NC. Jour 19 : augmentation rats PE, réduite par injection hucMSC-Exos. Inhibition miR-18b-3p 역전 effet Exos sur PAS/protéinurie jour 19.

Poids fœtus/placenta (Figure 5c,d) : rats PE poids diminués ; downregulation miR-18b-3p abolit rôle Exos.

Facteurs inflammatoires (Figure 5e) : TNF-α, IL-1β, IL-6 augmentés rats PE. Traitement Exos diminue ces facteurs, majorés par injection Exos inhibant miR-18b-3p.

Les exosomes améliorent les changements pathologiques et inhibent l'apoptose placenta rats PE

HE (Figure 6a) : normaux : villosités abondantes vaisseaux, structure claire, syncytiotrophoblastes principaux, peu cytotrophoblastes. Rats PE et PE+Exos-miR-18b-3p-antagomir : villosités réduites, structure floue/atrophique, nécrose fibrinoïde, nodules syncytiotrophoblastiques augmentés, villosités immatures. Amélioration rats PE+Exos ou PE+Exos-antagomir NC vs PE et PE+Exos-miR-18b-3p antagomir.

TUNEL (Figure 6b,c) : normaux : peu apoptose. Rats PE : apoptose augmentée ; downregulation miR-18b-3p 역전 impact Exos sur apoptose placenta.

Discussion

PE : trouble multisystémique grossesse (protéinurie + hypertension/autres conditions), lié à dysfonction endothéliale maternelle. hucMSC-Exo améliore morphologie placenta rats PE via suppression apoptose et angiogenèse dose-dépendante. miR-18b affecte migration/viabilité/invasion cellules PE. LEP maternel accru et hypométhylation promoteur LEP placenta PE précoce. Cette étude explore effet exosomes et miR-18b-3p ciblant LEP sur survenue PE. Résultats : hucMSC-Exos miR-18b-3p inhibe progression PE via réduction LEP.

Nos résultats : miR-18b-3p réduit, LEP élevé placenta PE. Littérature : ARNm miR-18b marqué supprimé placenta PE vs normal. miR-18b réduit mélanome malin vs tissus adjacents non tumoraux. LEP placenta élevé PE preterm vs témoins. LEP élevé placenta prééclamptique. Base théorique pour expression anormale miR-18b-3p/LEP PE. Prédiction bioinformatique : LEP ciblé par miR-18b-3p, confirmé double luciferase. LEP cible pour miR-1301, miR-223, miR-224 PE précoce. LEP diminue miR-93 ostéoarthrite/polyarthrite. Liaison miR-18b-3p/LEP maladies humaines, surtout PE, peu étudiée → nouveauté. Exosomes augmentent miR-18b-3p, diminuent LEP placenta PE. miR-18b-5p élevé exosomes plasma cancer colorectal. Relation hucMSC-Exos/miR-18b-3p/LEP PE à approfondir.

miR-18b-3p restauré réduit PAS/protéinurie, augmente poids placenta, diminue TNF-α/IL-1β/IL-6 sérique/placenta, supprime apoptose → atténuation symptômes/changements pathologiques PE. Surexpression stable miR-18b : activité inhibitrice tumeur (viabilité mélanome, apoptose, croissance tumeur in vivo). hucMSC-Exos : même effets bénéfiques. Exosomes modèles rats PE : augmentation nombre/qualité fœtus, qualité placenta, apoptose réduite. Exosomes bovins fœtaux : baisse TNF-α/IL-6 macrophages. Exosomes purifiés : suppression IL-1β macrophages stimulés LPS/nigéricine. Exosomes MSC pluripotentes humaines : marqueurs inflammatoires TNF-α/IL-6 dramatiquement réduits. PAS élevée groupe femmes développant PE ultérieurement. Patients PE : PAS, pression diastolique, protéinurie positivement associées. Protéinurie croissante gestation PE. Rats PE : TNF-α accru vs normaux gravides. Femmes PE : IL-6/IL-1β sériques élevées vs témoins. PE : PAS haute, protéinurie, facteurs inflammatoires élevés. Inférence : miR-18b-3p exosomal hucMSC a effet thérapeutique PE.

Conclusion

En conclusion, notre étude prouve que les exosomes dérivés des hucMSC surexpriment miR-18b-3p, qui cible LEP pour supprimer les facteurs inflammatoires et réduire l'apoptose dans le placenta de rats PE, inhibant ainsi la survenue de PE. Le miR-18b-3p exosomal est un candidat thérapeutique potentiel pour la PE via ciblage de LEP. Cette recherche identifie pour la première fois le rôle du miR-18b-3p exosomal des hucMSC ciblant LEP lors du développement de la PE, apportant un nouvel éclairage pour le traitement. Cependant, vu les limites des connaissances actuelles, l'étude doit être rigoureusement surveillée et rapportée dans de futurs essais cliniques.