Le microARN-133a-3p restauré ou le PSAT1 épuisé retient l'anévrisme intracrânien induit par les cellules endothéliales en supprimant la voie GSK3β/β-caténine

Présentation de l'hypothèse

Dans cette étude, nous pourrions supposer que l'axe miR-133a-3p/PSAT1 pourrait affecter l'IA induite par les lésions des cellules endothéliales via la modulation de la voie GSK3β/β-caténine.

Test de l'hypothèse

Pour vérifier cette hypothèse, nous avons collecté des échantillons cliniques, des cellules endothéliales (CE) de l'IA humaine et établi des modèles de rat IA pour élucider les fonctions de miR-133a-3p et PSAT1 dans le processus IA.

Implications de l'hypothèse

Notre étude confirme notre hypothèse selon laquelle la surexpression de miR-133a-3p ou la régulation négative de PSAT1 restreignent les dommages aux cellules endothéliales et font progresser la prolifération des cellules endothéliales en inhibant la voie GSK3β/β-caténine dans l'IA. Ces résultats fournissent un nouvel aperçu d'une nouvelle thérapie cible pour l'IA.

Introduction

L'anévrisme intracrânien (IA) est une sorte de trouble cérébrovasculaire, qui se caractérise par une artère non conventionnelle bombée dans le cerveau ainsi qu'une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) causée par une rupture de l'IA, accompagnée d'une mortalité et d'une morbidité élevées [1]. Comme c'est une maladie destructrice, la pathogenèse de l'IA n'a pas été clarifiée [2]. L'IA est une forme familiale rare, mais on pense généralement qu'elle est le résultat d'une lésion vasculaire acquise causée par l'hypertension, le tabagisme et d'autres facteurs de risque traditionnels [3]. L'enroulement endovasculaire ou le clipping microchirurgical ont été utilisés pour prévenir la rupture future d'un anévrisme non rompu chez les patients présentant un risque élevé de rupture [4]. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés en chirurgie IA, une mauvaise récupération postopératoire est toujours présente chez les patients IA [5]. La situation difficile du traitement de l'IA rend nécessaire d'approfondir l'exploration du mécanisme et de trouver une nouvelle stratégie thérapeutique.

Les microARN (MiARN) sont une classe d'ARN non codants qui modulent l'expression de gènes cibles en inhibant la traduction au niveau post-transcriptionnel ou en médiant la dégradation des ARNm [6]. Il a été révélé que miR-133a-3p en tant qu'inhibiteur tumoral dans plusieurs néoplasies malignes et la surexpression de miR-133a-3p peuvent inhiber la croissance des cellules du cancer colorectal (CRC) [7]. Une étude précédente a soutenu qu'à la lumière du blocage de la glutaminolyse médiée par l'autophagie, miR-133a-3p supprime davantage les métastases et la croissance du cancer gastrique [8]. De plus, une étude a montré que miR-133a-3p participe à la régulation du développement cardiaque et de l'hypertrophie cardiaque [9]. Une étude a démontré que la régulation à la hausse de miR-195-5p diminue l'angiogenèse et la résistance au cisplatine dans le cancer de l'ovaire en supprimant la voie de signalisation GSK3β/β-caténine dépendante de la phosphosérine aminotransférase 1 (PSAT1) [10]. Une autre étude a rapporté que miR-365 réprime l'invasion et la croissance cellulaires dans le carcinome épidermoïde de l'œsophage (ESCC) en modulant PSAT1 [11]. PSAT1 est une enzyme impliquée dans la biosynthèse de la sérine; il est à l'origine purifié à partir de cerveaux de mouton et a des niveaux élevés dans de nombreux tissus [12]. Il a été démontré que PSAT1 médie la progression du cycle cellulaire dans le cancer du sein par modulation de la voie de signalisation GSK3β/β-caténine [13]. Liu et al. souligne également que PSAT1 exerce une fonction sur le développement de l'ESCC et prévoit une faible survie ; par conséquent, il peut être une cible prometteuse pour les thérapies anticancéreuses [14]. Compte tenu des analyses susmentionnées, cette étude devait apporter des contributions à une nouvelle approche pour le rôle fonctionnel de l'axe miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-caténine dans l'IA.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

L'étude a été approuvée par le Conseil d'examen institutionnel du premier hôpital universitaire de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Tianjin. Tous les participants ont signé un document de consentement éclairé. Toutes les expérimentations animales ont été compilées avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire par les comités internationaux.

Sujets à étudier

De janvier 2016 à mars 2018, les cas d'HSA causée par l'IA traités dans la neurochirurgie du premier hôpital universitaire de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Tianjin ont été sélectionnés. Les échantillons pathologiques de 75 cas d'IA obtenus par microchirurgie ont été rassemblés et classés dans le groupe IA, comprenant 29 hommes et 46 femmes âgés de 31 à 55 ans, avec un âge moyen de 44,98 ± 6,79 ans. Les patients atteints de traumatisme crânien traités en neurochirurgie en même temps dans le premier hôpital universitaire de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Tianjin ont été sélectionnés comme groupe témoin. Aussi, 75 cas de tissus artérioles intracrâniens normaux ont été amassés par opération traumatique ou décompression interne, dont 43 hommes et 32 ​​femmes âgés de 34 à 56 ans, avec un âge moyen de 48,14 ± 8,68 ans. Les patients ont été exclus s'ils avaient des antécédents d'hypertension, de diabète ou de tumeurs. Il n'y avait pas de différence marquée en termes de sexe et d'âge entre le groupe IA et le groupe témoin (les deux P> 0,05).

Traitement et conservation des échantillons

Après résection chirurgicale, certains des échantillons de deux groupes ont été fixés avec du formaldéhyde, déshydratés avec un gradient d'alcool de faible à forte concentration et inclus avec de la paraffine. Ensuite, les échantillons ont été découpés en tranches pour la coloration à l'hématoxyline-éosine (HE) et la coloration immunohistochimique. Certains échantillons ont été rapidement placés dans des réservoirs d'azote liquide, puis transférés dans un réfrigérateur cryogénique à - 80 °C pour la détection de l'analyse par western blot et la transcription inverse quantitative de la réaction en chaîne de la polymérase (RT-qPCR). Certains échantillons ont été fixés avec du glutaraldéhyde pour l'observation au microscope électronique, et certains échantillons ont été utilisés pour l'isolement des CE.

Observation au microscope électronique

Les échantillons ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 3 %, puis refixés avec du tétroxyde d'osmium à 1 %. Les échantillons ont été déshydratés avec de l'acétone, inclus avec Epon812, et tranchés en sections semi-fines d'une épaisseur de 3 um. Enfin, les échantillons ont été teints en double avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb et observés au microscope électronique à transmission H-600IV (Hitachi, Tokyo, Japon).

Coloration HE

Les coupes en paraffine préparées ont été cuites à 60°C pendant 30 min. Une fois les étapes ci-dessus terminées, les tranches de tissu ont été fixées dans du xylène, déshydratées avec de l'alcool absolu à gradient et nettoyées par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les tranches de tissus ont été teintes à l'hématoxyline, traitées dans l'ammoniaque pendant quelques secondes, teintes à l'éosine pendant 2 min, déshydratées et clarifiées. Ensuite, les tranches de tissu ont été égouttées avec de la gomme neutre et scellées avec une lamelle de verre. Enfin, un microscope (Nikon, Tokyo, Japon) a été adopté pour l'observation et l'enregistrement.

Coloration immunohistochimique

Le kit d'immunohistochimie a été produit par Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA). Les tranches de paraffine ont été déparaffinées et hydratées, et les tranches de paraffine ont été immergées dans une solution de xylène pendant 5 min × 3 fois. Les tranches ont été placées dans de l'alcool absolu à 100% pendant 3 min × 2 fois, puis trempées dans de l'alcool à 95-75% pendant 3 min à tour de rôle. Après déparaffinage, les tranches ont été incubées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % pendant 15 min pour éliminer l'activité de la peroxydase endogène. Les tranches ont été égouttées avec une solution de blocage et incubées avec une solution de travail de sérum de chèvre normal pendant 15 min, puis sondées avec un anticorps primaire contre la métalloprotéase matricielle (MMP)-9 (5 g/mL) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) (1:250 , Abcam, Cambridge, MA, USA) (PBS pour contrôle négatif (NC)) et incubé pendant 1 à 2 h. Les tranches ont été re-sondées avec une solution de travail d'anticorps secondaire de biotinylation pendant 30 à 60 min. Les tranches ont été additionnées de fluide de travail streptavidine/peroxydase marqué par la peroxydase de raifort, égouttées avec une solution de diaminobenzidine (DAB) nouvellement préparée, contre-colorées et bloquées. L'image a été connue par le système d'imagerie Nikon SPOT FlexTM. La zone d'expression des protéines MMP-9 et VEGF a été évaluée par un logiciel d'analyse quantitative immunohistochimique. Cinq champs visuels à fort grossissement ont été détectés au hasard dans la zone d'accumulation de cellules positives dans chaque échantillon, et l'absorbance moyenne de chaque écran a été utilisée comme valeur moyenne pour l'analyse statistique.

Isolement et culture des CE

Les CE ont été isolées des tissus normaux de l'artériole intracrânienne et des tissus IA et cultivées. Le tissu a été tranché en 3 mm ² fragments et incubés pendant 25 min dans 0,1% collagénase B/0,1% dispase (Roche, Bâle, Suisse). Le tissu a été détaché, trituré pendant 2 min par une pipette de 2 ml et filtré PAR une passoire de 100 µm (BD Biosciences, NJ, USA) pour isoler les CE. La suspension cellulaire a été centrifugée puis remise en suspension dans un milieu de culture MV2 contenant des facteurs de croissance et 20 % de sérum bovin foetal (PromoCell, Heidelberg, Allemagne). Ensuite, les cellules ont été ensemencées sur des boîtes recouvertes de fibronectine (Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) avec une densité de 10 ⁴ cellules/cm ² (1 g/cm ² ) et cultivé pendant 1 jour avec 5% de CO₂ . Le lendemain de l'ensemencement, les cellules ont été rincées avec du PBS pour éliminer les cellules non attachées et placées dans un milieu frais. Lorsqu'elles ont atteint environ 80 à 100 % de confluence, les cultures ont été exposées à une immunoséparation par des billes revêtues d'Agglutinine I (UEA) d'Ulex europaeus (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, Royaume-Uni) (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, Royaume-Uni) pour obtenir des EC purs. Les CE liées aux billes recouvertes de lectine ont été amassées avec un concentrateur de particules magnétiques tandis que les cellules non liées ont été éliminées par lavage avec du milieu de base deux fois. Les cellules positives à l'UEA ont été remises en suspension dans un milieu de culture et ensemencées sur des boîtes recouvertes de fibronectine pour améliorer leur adhérence et leur croissance. Les cultures sont devenues confluentes en 4 à 6 jours.

Identification des CE

Les CE ont été identifiées par coloration immunocytochimique avec un anticorps CD31 de surface cellulaire et un antigène lié au facteur FVII. Les cellules ont été nettoyées deux fois avec du PBS, fixées avec du paraformaldéhyde 4%, incubées avec 3% H₂ O₂ pendant 10 à 15 min pour éliminer l'activité de la peroxydase endogène, puis incubé avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 min sur des cellules perforées. Les cellules ont été égouttées avec un anticorps primaire spécifique :Facteur VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Bâle, Suisse) et incubées à 4°C pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été égouttées avec de l'immunoglobuline G (1:50) marquée avec un anticorps secondaire à la peroxydase de raifort. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 45 min et développées par DAB en évitant la lumière pendant 4 min. Ensuite, le développement de la couleur a été interrompu avec de l'eau distillée et la photographie a été observée au microscope. Les cellules ont été observées au microscope à différence de phase inversé à fluorescence, et les cellules positives et le nombre total de cellules ont été comptés au hasard à partir de 10 champs visuels. Le taux de cellules de coloration positive =(le nombre de cellules positives/le nombre total de cellules) × 100 %. Le groupe NC correspondant a été établi et l'anticorps primaire a été remplacé par du PBS, et les autres étapes ont été effectuées comme ci-dessus.

Regroupement et transfection de cellules

Pour étudier les effets entre miR-133a-3p et PSAT1 sur les CE d'IA, les CE ont été regroupées en groupe témoin (CE vasculaires normales sans aucune transfection), groupe IA (CE vasculaires IA sans aucune transfection), groupe mimique NC (transfecté avec miR -133a-3p mimic NC), groupe miR-133a-3p mimic (transfecté avec miR-133a-3p mimic), petit groupe ARN interférent (si)-NC (transfecté avec si-PSAT1 NC), groupe si-PSAT1 (transfecté avec si-PSAT1), et miR-133a-3p mimic + groupe surexpression (oe)-PSAT1 (transfecté avec miR-133a-3p mimic et oe-PSAT1). Parmi eux, mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-PSAT1, si-NC et oe-PSAT1 ont été conçus et composés par GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, Chine). La transfection a été réalisée en stricte conformité avec les instructions de Lipofectamine ^TM 2000 réactif de transfection (Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Cytométrie en flux

Le milieu dans la boîte de culture a été jeté, et les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS. Les cellules ont été détachées par 0,25% de trypsine, centrifugées à 800 tr/min pendant 5 min et suspendues avec 1 × tampon de liaison, et la densité cellulaire a été ajustée à 1 × 10 ⁷ cellules/mL. La suspension cellulaire (100 L) a été incubée avec 5 L d'iodure de propidium (PI, 20 g/mL) et l'annexine V-FITC pendant 20 min, puis mélangée avec 400 L de tampon de liaison 1 x. Un cytomètre en flux (trieur de cellules BD FACSArial I) a été utilisé pour détecter l'apoptose des cellules en 1 h. Les résultats étaient que le quadrant inférieur gauche (Q4) sur la carte de dispersion montrait des cellules vivantes saines (FITC ⁻ /PI ⁻ ), le quadrant inférieur droit (Q3) en tant que cellules apoptotiques précoces (FITC ⁺ /PI ⁻ ), et le quadrant supérieur droit (Q2) était les cellules apoptotiques tardives et apoptotiques (FITC ⁺ /PI ⁺ ); taux d'apoptose =pourcentage d'apoptose précoce (Q3) + pourcentage d'apoptose tardive (Q2).

Dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-Yl)-2, 5-diphényltétrazolium (MTT)

Les cellules ont été détachées avec de la trypsine pour préparer une suspension cellulaire. Les cellules ont été comptées au microscope inversé. La concentration cellulaire a été ajustée à 5 × 10 ⁴ cellules/mL. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de culture à 96 puits. Après 48 h, les cellules ont été incubées avec 20 L de solution MTT pendant 4 h. Le MTT dans chaque puits a été dissous avec 150 pi de diméthylsulfoxyde. La valeur de densité optique (DO) des CE a été mesurée à la longueur d'onde de 570 nm. Le taux de prolifération des CE a été calculé à la lumière de la valeur OD.

Test de grattage

Les cellules de chaque groupe ont été ensemencées dans une plaque à 24 puits avec 2 × 10 ⁵ cellules/puits. Trois puits parallèles ont été placés dans chaque groupe. Lorsqu'il a atteint environ 90 % de confluence, le plan de croissance cellulaire a été rayé avec un embout de micropipette jetable stérilisé de 1 ml ; chaque puits a été gratté une fois et la longueur et la profondeur de rayure de chaque puits étaient cohérentes. Après grattage, les cellules flottantes ont été retirées, le milieu de culture a été remplacé par du neuf, et l'espacement des grattages a été observé au microscope après 24 h de culture. La zone de cicatrisation de la plaie éraflée a été dénombrée par le logiciel National Instrument Vision Assistant 8.6. La migration cellulaire =zone de cicatrisation/zone de rayure initiale × 100 %.

Animaux d'expérimentation et établissement de modèles de rats IA

Quatre-vingt-quatre rats Sprague-Dawley (SD) âgés de 7 semaines et pesant de 180 à 200 g (Laboratory Animals Center, Academy of Military Medical Sciences, Pékin, Chine) ont été sélectionnés. Les rats ont été hébergés dans le centre d'expérimentation animale. Les conditions d'alimentation ont été contrôlées à 22-25 °C et 50-60% d'humidité avec la lumière naturelle. Tous les rats ont été nourris dans des cages à rats standard avec 4 rats par cage. Les rats ont été nourris avec de l'eau potable sanitaire urbaine et du fourrage commun pour rats. Les coussins ont été changés tous les 3 jours, et la cage a été lavée et stérilisée. Les rats IA ont été modélisés conformément à la référence [15]. Une rupture d'anévrisme a été identifiée lorsque les symptômes suivants sont apparus chez le rat [16] : 1, diminution de l'activité d'alimentation ou de boisson résultant d'une perte de poids (environ 10 % de perte de poids) sur 24 h ; 2, flexion du torse et des membres antérieurs au levage; 3, marchant d'un côté dans une posture normale; 4, penché d'un côté au repos, aucune activité spontanée. Les rats présentant ces symptômes ont été euthanasiés 3 mois après l'opération. Des tissus IA ont été obtenus pendant l'opération et perfusés avec du PBS, et le colorant bleu contenant de l'acide glutamique a été perfusé dans l'artère cérébrale.

Traitement et intervention des rats IA

Les 84 rats ci-dessus ont été séparés au hasard en 7 groupes avec 12 rats dans chaque groupe. Les modalités de traitement étaient les suivantes :groupe normal (aucune modélisation n'a été réalisée); groupe IA (stéréotaxique injecté avec 100 L de mélange de PBS et de Lipofectamine 2000); groupe mimic NC (injection stéréotaxique avec 100 L de mélange de miR-133a-3p mimic NC et Lipofectamine 2000); groupe miR-133a-3p mimic (injection stéréotaxique avec 100 L de mélange miR-133a-3p mimic et Lipofectamine 2000); groupe si-NC (injection stéréotaxique avec 100 L de mélange de si-PSAT1 NC et de Lipofectamine 2000); groupe si-PSAT1 (injection stéréotaxique avec 100 L de mélange de si-PSAT1 et de Lipofectamine 2000); et groupe miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 (injection stéréotaxique avec 100 L de mélange miR-133a-3p mimic et oe-PSAT1 et Lipofectamine 2000). Toutes les injections ci-dessus ont été effectuées une fois par jour et ces rats ont été élevés dans un laboratoire animalier exempt d'agents pathogènes spécifiques (SPF) pendant 12 semaines. Après 12 semaines, les rats de chaque groupe ont été anesthésiés et la cavité thoracique a été ouverte comme décrit ci-dessus. Du ventricule gauche intubant dans l'aorte, le sang a été libéré en coupant le cava. Dans le même temps, 30 ml de solution saline contenant de l'héparine sodique (37 ° C) ont été perfusés à travers le conduit, puis du tampon phosphate à 10 % de polyformaldéhyde/0,1 M (pH 7,4) a été lentement injecté dans le cerveau par le conduit. Une fois la perfusion fixée, le cerveau a été ouvert. L'anneau artériel à la base du crâne a été séparé et retiré au microscope chirurgical, les modifications des anévrismes ont été observées au microscope et les caractéristiques pathologiques ont été étudiées. Les mimiques NC, miR-133a-3p, si-NC, si-PSAT1 et oe-PSAT1 ont été composées par Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Chine).

Détection de l'hémodynamique

Le débit sanguin au bout de l'artère carotide commune gauche des rats a été testé avant 3 jours d'intervention et 12 semaines après le traitement d'intervention. La méthode était la suivante :les rats ont été placés dans le châssis animal de la machine d'anesthésie pour l'inhalation, et les paramètres d'écoulement ont été ajustés. Après que les rats aient respiré de manière stable et qu'il n'y ait eu aucune réaction évidente lorsque la queue des rats a été touchée, les rats ont été fixés sur la table d'opération expérimentale avec un élastique. Les poils du cou du rat ont été rasés avec un rasoir électrique. Le détecteur à ultrasons Doppler couleur a été allumé et la vitesse du flux sanguin à l'extrémité de l'artère carotide commune gauche a été mesurée et les données ont été enregistrées après que la sonde a été enduite d'un agent de couplage approprié. Après la mesure, les rats ont été soigneusement remis dans la cage pour garder les voies respiratoires dégagées jusqu'à ce que les rats se réveillent après l'anesthésie.

RT-qPCR

L'ARN total a été extrait sur la base du kit d'extraction d'ARN total simple ARN (TIANGEN Biotechnology Co., Ltd., Pékin, Chine). L'ARN de haute qualité a été confirmé par analyse ultraviolette et électrophorèse de dénaturation au formaldéhyde, et l'ARN a été inversement transcrit en ADN complémentaire par le kit de réactif PrimeScript RT. La réaction PCR a été réalisée par SYBR Permix Ex Taq ^II (Takara, Dalian, Liaoning, Chine). Les amorces PCR ont été conçues et composées par Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Pékin, Chine) (tableau 1). U6 a été sélectionné comme paramètre interne pour miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, -caténine, Bax, Bcl-2, Ki-67 et CyclinD1 avec la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme paramètre interne. Les données ont été mesurées par 2 ^−ΔΔCt .

Analyse Western Blot

Les protéines totales ont été extraites des cellules et des tissus, et les échantillons de protéines ont été quantifiés par le kit de dosage des protéines à l'acide bicinchoninique (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Chine). Les échantillons ont été mélangés avec 1/4 de volume de tampon d'échantillon 5 × et bouillis pendant 5 min. Le gel de séparation à 10 % et le gel concentré à 5 % ont été sélectionnés pour l'électrophorèse. La membrane a éclos dans 5 % de poudre de lait écrémé pendant 60 min. La membrane a été jointe avec l'anticorps primaire PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-caténine (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CyclinD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 g/mL), VEGF (1:1000) (tous de Abcam, Cambridge, MA, USA). Ensuite, la membrane a été hachurée avec un anticorps secondaire (1:2000) pendant 60 min. La membrane a été immergée dans la solution de réaction d'électrochimiluminescence (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Chine) pendant 1 min, puis recouverte d'un emballage alimentaire après avoir retiré le fluide. La membrane a été exposée aux rayons X et le résultat a été observé après développement et fixation. GAPDH (1:10000, Abcam) a été utilisé comme contrôle de chargement et l'image de la protéine a été analysée par le logiciel ImageJ2x.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

La relation cible entre miR-133a-3p et PSAT1 et le site de liaison entre miR-133a-3p et PSAT1 3′ région non traduite (3′UTR) ont été prévues par un site Web de bioinformatique (https://cm.jefferson.edu/rna22 /Précalculé/). La séquence de la région du promoteur PSAT1 3'UTR contenant le site de liaison miR-133a-3p a été amplifiée et clonée dans le plasmide pGL3-basic luciférase (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japon) pour construire le plasmide de type sauvage (WT) ( PSAT1-WT) de PSAT1 3′UTR, tandis que le plasmide recombinant mutant (MUT) PSAT1-MUT a été formulé en mutant le site de liaison miR-133a-3p sur PSAT1-WT avec un kit de mutation ponctuelle (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga , Japon). Les CE vasculaires en phase de croissance logarithmique ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits. Lorsque la confluence atteint environ 70%, les plasmides PSAT1-WT et PSAT1-MUT ont été mélangés avec des plasmides mimiques NC et miR-133a-3p par Lipofectamine 2000 et co-transfectés dans des CE vasculaires. Les cellules ont été rassemblées et lysées 48 h après la transfection, et l'activité luciférase a été vérifiée par un kit de détection de luciférase (Promega Corporation, Madison, WI, USA).

Analyse statistique

Toutes les données ont été expliquées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Les données de dénombrement ont été indiquées par taux ou pourcentage, et l'analyse a été déterminée par le test du chi carré ou le test de Fisher. Les données de mesure soumises à une distribution normale ont été transmises par moyenne ± écart type. La comparaison entre deux groupes a été réalisée par t test, tandis que la comparaison entre plusieurs groupes a été analysée par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey. Un P la valeur <0,05 a été considérée comme significative.

Résultats

Données générales des patients atteints d'AI

Comme le montre le tableau 2, les données générales du groupe IA et du groupe témoin ont été comparées. Les informations spécifiques sont répertoriées dans le tableau 2.

L'expression de miR-133a-3p est liée au nombre et à la taille de l'IA

En analysant la relation entre l'expression de miR-133a-3p et les caractéristiques clinicopathologiques de l'IA, il a été détaillé dans le tableau 3 qu'à la lumière de l'expression relative moyenne de miR-133a-3p dans l'IA, 75 cas d'IA ont été répartis en deux groupes :groupe à haute expression miR-133a-3p (n =47) et groupe à faible expression miR-133a-3p (n =28). La relation entre miR-133a-3p et différents paramètres clinicopathologiques a été analysée statistiquement par le test du chi carré ou le test de Fisher. Les résultats ont montré que l'expression de miR-133a-3p n'était pas liée à l'âge, au sexe, à la forme et à la position de l'anévrisme (tous les P> 0,05), mais associé au nombre et à la taille de l'anévrisme (à la fois P <0,05).

L'expression MiR-133a-3p est refusée et l'expression PSAT1, GSK3β et -caténine est augmentée dans les tissus IA

L'expression de miR-133a-3p dans IA a été déterminée par RT-qPCR, et les résultats ont révélé que par rapport aux tissus normaux des artérioles intracrâniennes (le groupe témoin), l'expression de miR-133a-3p était réduite dans les tissus IA (le groupe IA) (P <0,05) (Fig. 1a). L'analyse par RT-qPCR et western blot a montré que l'expression de PSAT1, GSK3β et -caténine était augmentée dans les tissus IA par rapport à celle des tissus normaux des artérioles intracrâniennes (tous P <0,05) (Fig. 1a–c).

L'expression de MiR-133a-3p est diminuée et l'expression de PSAT1, GSK3β et -caténine est augmentée dans les tissus IA. un Expression de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β et -caténine dans le groupe IA et le groupe normal. b Bande protéique de l'expression de PSAT1, GSK3β et -caténine. c Expression protéique de PSAT1, GSK3β et -caténine dans le groupe IA et le groupe normal par test western blot. n =75, *P <0,05 vs le groupe témoin. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne ± écart type, et les comparaisons entre deux groupes ont été effectuées par un échantillon indépendant t tester

Modifications pathologiques de l'anévrisme et de l'expression de MMP-9 et VEGF dans les tissus IA

En observant directement le tissu normal des artérioles intracrâniennes et les tissus IA, il a été présenté que dans le groupe témoin, les vaisseaux des tissus artériels étaient rouge vif et qu'aucune plaque athéroscléreuse et thrombus latéral évident n'avait été trouvé dans la lumière. La tumeur des tissus de l'anévrisme du groupe IA était principalement brune ou rouge foncé, et l'apparence était scrotiforme ou fusiforme, et la texture était principalement dure. Lorsque la tumeur a été ouverte, il est apparu des plaques athéroscléreuses blanches ou rouge foncé sur la paroi tumorale de certains échantillons de tumeur, qui étaient de forme plate, ronde ou ovale. Dans certains échantillons de tumeur, il y avait un thrombus mural dans la cavité tumorale et la texture du thrombus était molle. L'épaisseur de la paroi tumorale s'est progressivement amincie à partir du col de la tumeur, dont certaines n'avaient qu'une fine membrane fibreuse au sommet de la tumeur, et certaines d'entre elles s'étaient même rompues. La crevasse de l'anévrisme rompu était située au sommet ou près du sommet de la tumeur.

La coloration HE a montré que sous le microscope optique, l'épaisseur de la paroi des tissus normaux de l'artériole intracrânienne était uniforme ; la structure anatomique des couches interne, médiane et externe était claire et intacte ; la morphologie des cellules dans chaque couche était normale; le sarcolemme des cellules adjacentes formé souvent étroitement; et les cellules inflammatoires de la paroi étaient rares. Dans le groupe IA, les protubérances locales formées dans la cavité vasculaire latérale distale au sommet de la bifurcation de l'artère intracrânienne dans la paroi de l'anévrisme sont devenues obtuses et plus petites, et les CE locales ont été perdues. Un petit nombre d'échantillons a montré une migration de la couche de cellules musculaires lisses vers la couche intimale et une prolifération de cellules intimales myogéniques. Les CE ont diminué ou même disparu. La couche de cellules endothéliales était composée de cellules myointimales hyperplasiques et de CE disposées linéairement, ou de CE apoptotiques et de cellules sanguines attachées à la lumière. Sa vacuole a dégénéré et présenté une interruption de continuité. Certains d'entre eux ont été décollés avec la membrane basale et les fibres de collagène de l'intima ont augmenté. L'athérosclérose était modifiée et la paroi de l'artériole était manifestement plus mince et était remplie d'un grand nombre de tissus conjonctifs en échelle. Une infiltration cellulaire inflammatoire et une diffusion partielle ont été observées dans toutes les couches, principalement dans les membranes médianes et externes. Des dépôts de cristaux de lipides et de cholestérol ont été observés dans certaines cellules. Certaines des parois tumorales étaient complètement ou localement amincies et élargies vers l'extérieur (Fig. 2a, b).

Modifications pathologiques de l'anévrisme et expression de MMP-9 et VEGF dans l'IA. un Coupes de tissus des artérioles intracrâniennes normales dans le groupe témoin sous coloration HE (× 10). b Coupes de tissus IA colorées à l'HE (x 10). c Ultrastructure of normal intracranial arterioles tissues in the control group under an electron microscope (× 10,000). d Ultrastructure of IA tissues under an electron microscope (× 10,000). e Expression of MMP-9 in the control group and the IA group by immunohistochemical staining (× 200). f Expression of VEGF in the control group and the IA group by immunohistochemical staining (× 200)

The sections of the normal intracranial arterioles tissues and IA tissues were observed by an electron microscope, and it performed that in normal intracranial arterioles tissues, the matrix fibers of the cerebral vascular wall could be seen clearly, and there was no endothelial injury, cell pyknosis, or degeneration. In the IA tissues, obvious endothelial cell injury, cell pyknosis, or vacuole degeneration were observed, the number of middle smooth muscle cells was declined, most of the nucleus pyknosis was appeared, and chromatin aggregation and apoptotic bodies could be seen. Some cells showed swelling of the mitochondria and disappearance of normal internal structure. The extracellular matrix that formed the cytoskeleton was blurred and showed amorphous floc. There were many fragments in the missing parts of the cells (Fig. 2c, d).

Immunohistochemical staining was utilized to test MMP-9 and VEGF expression, and the results revealed that there was no expression of MMP-9 and VEGF in 75 cases of the control group. It existed 60 cases of positive expression of MMP-9 in the 75 cases of IA samples. MMP-9 positive expression appeared in the inner and the outer membranes of IA wall, but the expression was not uniform. The positive expression was mainly characterized by a brownish yellow cytoplasm. The positive expression of VEGF was 66 cases in 75 cases of IA samples. In the wall of IA, there was a high positive expression in the middle and the outer membranes and a low positive expression in the intima. The positive expression was also mainly characterized by a brownish yellow cytoplasm (Fig. 2e, f). The expression of MMP-9 and VEGF in the two groups is shown in Table 4.

Identification of Vascular ECs

The expression of factor VIII and CD31 in ECs were analyzed by immunohistochemical staining. The results reported that vascular ECs reacted positively to factor VIII and CD31-related antigen antibodies, and the positive rate was 95%. In addition, there were a large number of brown particles in the cytoplasm, and the fifth passage of cells of brown staining was dramatically higher than the primary passage of cells (Fig. 3a, b).

Vascular ECs react positively to FVIII and CD31 related antigen antibodies. un Identification of ECs by CD31. b Identification of ECs by FVII

Upregulation of miR-133a-3p and Downregulation of PSAT1 Suppress Apoptosis and Advance Proliferation and Migration of ECs in IA

Flow cytometry, RT-qPCR, and western blot analysis were adopted for observing the apoptosis and Bax and Bcl-2 expression in ECs of IA after treated with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1. It was indicated that compared to the control group, the apoptosis rate of cells and Bax expression was elevated in the IA group and the Bcl-2 expression was decreased (all P <0,05). The cell apoptosis and Bax and Bcl-2 expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group had no significant change (all P> 0,05). By comparison with the si-NC group and mimic NC group, the apoptosis rate of cells in the si-PSAT1 group and miR-133a-3p mimic group was suppressed, the Bax expression was declined, and the Bcl-2 expression was raised (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, the apoptosis rate and Bax expression were enhanced, and the Bcl-2 expression was reduced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 4a–e).

Highly expressed miR-133a-3p and lowly expressed PSAT1 inhibit apoptosis and promote proliferation and migration of IA ECs. un Detection of apoptosis of ECs by flow cytometry. b Detection of apoptosis rate of ECs in each group. c Bax and Bcl-2 expression in ECs detected by RT-qPCR. d Protein band of Bax and Bcl-2 expression. e Bax and Bcl-2 protein expression in ECs detected by western blot analysis. f MTT assay was used to detect proliferation activity of ECs in each group. g RT-qPCR was used to detect the expression of Ki-67 and CyclinD1 in each group of ECs. h Protein band of Ki-67 and CyclinD1 expression. je Ki-67 and CyclinD1 protein expression in ECs detected by western blot analysis. j Detection of the migration of ECs in each group by scratch test. k Statistical results of endothelial cell migration in each group. N =3, *P <0.05 vs. the control group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation; data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test

MTT assay, RT-qPCR, and western blot analysis were utilized to observe the proliferation and the expression of Ki-67 and CyclinD1 in ECs of IA after treated with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1. It was displayed that in contrast to the control group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were reduced in the IA group (all P <0,05). There was no significant difference in the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression of the IA group, mimic NC group, and si-NC group (all P> 0,05). In relation to the si-NC group and the mimic NC group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were heightened in the si-PSAT1 group and the miR-133a-3p mimic group (all P <0,05). In comparison to the miR-133a-3p mimic group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were reduced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 4f, i).

The migration of ECs in each group after treatment with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1 for 24 h was observed by scratch test. It was revealed that the migration of cells in the IA group was inhibited relative to that in the control group (P <0,05). There was no markedly change in cell migration of the IA group, the si-NC group, and the mimic NC group (all P> 0,05). Compared to the si-NC group and the mimic NC group, the cell migration in the si-PSAT1 group and the miR-133a-3p mimic group was elevated (both P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, the cell migration was declined in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P <0.05) (Fig. 4j, k).

Restored miR-133a-3p and Depleted PSAT1 Reduce PSAT1, GSK3β, and β-Catenin Expression in ECs of IA

RT-qPCR was used to detect miR-133a-3p expression in ECs of IA; it was yielded that compared to the control group, miR-133a-3p expression in the IA group was reduced (P <0,05). miR-133a-3p expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change markedly (P> 0,05). MiR-133a-3p expression in the miR-133a-3p mimic group was enhanced relative to that in the mimic NC group (P <0,05). In contrast with the si-NC group, there was no distinct change in miR-133a-3p expression in the si-PSAT1 group (P> 0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, miR-133a-3p expression was showed no significant difference in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P> 0.05) (Fig. 5a).

Upregulation of miR-133a-3p and downregulation of PSAT1 decrease PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in ECs of IA. un miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in ECs detected by RT-qPCR. b Protein bands of PSAT1, GSK3β, and β-catenin. c PSAT1, GSK3β, and β-catenin protein expression in ECs in each group detected by western blot analysis. N =3, *P <0.05 vs. the control group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test

The expression of PSAT1, GSK3β, and β-catenin in ECs of IA was tested by western blot analysis and RT-qPCR. It was indicated that in relation to the control group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group was raised (all P <0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change dramatically (all P> 0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group was degraded relative to that in the mimic NC group and si-NC group (all P <0,05). In relation to the miR-133a-3p mimics group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression was elevated in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 5a–c).

Upregulating miR-133a-3p and Downregulating PSAT1 Alleviate the Pathological Changes of IA Tissues

By testing the hemodynamic changes of rats after modeling, we monitored the blood flow velocity of rats in each group 3 days before operation and 12 weeks after intervention treatment. It was performed that there was no obvious difference in blood flow velocity in each group 3 days before operation (P> 0,05). After 12 weeks of intervention, the blood flow velocity of rats in the IA group depressed relative to that in the normal group (P <0,05). There was no distinct difference in the degree of decrease of blood flow velocity in the IA group, mimic NC group, si-NC group, and miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P> 0,05). By comparison with the si-NC group and the mimic NC group, the blood flow velocity was heightened in the miR-133a-3p mimic group and the si-PSAT1 group (both P <0,05). In contrast to the miR-133a-3p mimic group, the blood flow velocity was declined in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P <0.05) (Fig. 6a).

Upregulated miR-133a-3p and downregulated PSAT1 alleviate the pathological changes of IA tissues. un Hemodynamic changes at each time point after successful modeling in rats. b Changes of IA tissue after transfection. n =12, *P <0.05 vs. the normal group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test.

The changes of IA tissues were verified by HE staining. The results displayed that in the normal group, the elastic fibers in the middle layer of intracranial vascular tissue were neat, the normal elastic protein wave-like structure was appeared, and there was no broken and degradation. In relation to the normal group, the lumen of intracranial vascular tissue was enlarged, the normal elastic protein wave-like structure was disappeared, the elastic fiber in the middle layer of local elastic protein vessel was broken, and some of the elastic fibers were completely degraded in the IA group. There was no distinct change in the morphology of IA tissues in the si-NC group, mimic NC group, IA group, and miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group. In contrast with the si-NC group and the mimic NC group, the wave structure of elastic protein in intracranial vascular tissue of rats in the miR-133a-3p mimic group and the si-PSAT1 group was existed, and the local elastic protein vascular structure was slightly disordered, but there was no fracture and dissolution (Fig. 6b).

Highly Expressed miR-133a-3p and Lowly Expressed PSAT1 Reduce PSAT1, GSK3β, β-Catenin, VEGF, and MMP-9 Expression in IA Tissues in Vivo

The expression of miR-133a-3p in IA tissues in vivo was tested by RT-qPCR, it was suggested that in relation to the normal group, miR-133a-3p expression was declined in the IA group (P <0,05). miR-133a-3p expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change obviously (all P> 0,05). MiR-133a-3p expression in the miR-133a-3p mimic group was elevated relative to that in the mimic NC group (P <0,05). By comparison with the si-NC group, there was no marked change in miR-133a-3p expression in the si-PSAT1 group (P> 0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, miR-133a-3p expression showed no significant difference in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P> 0.05) (Fig. 7a).

Overexpression of miR-133a-3p and low expression of PSAT1 decrease PSAT1, GSK3β, and β-catenin, VEGF and MMP-9 expression in IA tissues in vivo and PSAT1 is a target gene of miR-133a-3p. un Detection of miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in IA tissues of rats in each group by RT-qPCR. b Protein bands of PSAT1, GSK3β, and β-catenin. c Detection of PSAT1, GSK3β, and β-catenin protein expression in IA tissues of rats in each group by western blot analysis. d Protein bands of VEGF and MMP-9. e Detection of VEGF and MMP-9 protein expression in IA tissues of rats in each group by western blot analysis. f Prediction of the target site of PSAT1 binding to the corresponding miR-133a-3p by Target Scan. g Result of dual luciferase reporter gene assay. un –e , n =12; f –g , N =3, *P <0.05 vs. the normal group/the Wt + NC group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test

The expression of PSAT1, GSK3β, and β-catenin in IA tissues in vivo was tested by western blot analysis and RT-qPCR. It was appeared that in contrast with the normal group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group was increased (all P <0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change markedly (all P> 0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group was decreased compared with that in the mimic NC group and si-NC group (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression was enhanced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 7a–c).

Western blot analysis was used to verify the VEGF and MMP-9 expression in IA tissues in vivo; the results perceived that by comparison with the normal group, VEGF and MMP-9 expression in the IA group were enhanced (both P <0,05). VEGF and MMP-9 expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change obviously (all P> 0,05). In relation to the mimic NC group and si-NC group, VEGF and MMP-9 expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group were declined (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, VEGF and MMP-9 expression were elevated in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 7d, e).

PSAT1 Is a Target Gene of miR-133a-3p

The online prediction software (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) was utilized to forecast and analyze the target site of PSAT1 binding to the miR-133a-3p, and the sequence of 3′UTR region combined by PSAT1 and miR-133a-3p. In order to prove that the predicted binding site of miR-133a-3p resulted in a change in the luciferase activity, the mutation sequence and the wild sequence of PSAT1 3′UTR deleting miR-133a-3p binding site were devised. Luciferase activity was verified by co-transfection of miR-133a-3p mimic and WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) or MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) recombinant plasmids in vascular ECs. The results revealed that miR-133a-3p mimic had no distinct effect on luciferase activity in the Mut-miR-133a-3p/PSAT1 group (P> 0.05), while the luciferase activity in the Wt-miR-133a-3p/PSAT1 group was markedly declined (P <0.05) (Fig. 7f, g).

Discussion

IA is an abnormal dilatation of the intracranial artery, which weakens the arterial wall through continuously pushing outwards the vascular wall, which results in a higher risk of aneurysm rupture [17]. In a study conducted by Liu et al., it has shown that some miRNAs are involved in modulating the cell proliferation of vascular smooth muscle cells, which is closely associated with IA [18]. Also, a recent study has provided a proof that circulating miRNAs can be used as a new biomarker to assess the possibility of IA occurred in high-risk individuals [19]. It is customarily considered that PSAT1 may be involved in schizophrenia spectrum conditions and alters serine metabolism [20]. The current study was designed to explore the regulatory role of miR-133a-3p modulated vascular endothelial injury and triggered IA through modulating the PSAT1/GSK3β/β-catenin signaling pathway.

In this present study, the relationship among miR-133a-3p expression and clinicopathological features of IA was analyzed, and the results demonstrated that the expression of miR-133a-3p was not related to age, gender, shape, and position of aneurysm but associated with the number and size of aneurysm. Some scholars considered that the shear stress of regional blood flow in the arterial wall induced the induction of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and macrophage inflammatory protein 1α (MIP-1α) expression by fibroblasts and vascular ECs within the vascular wall. The highly reactive chemotactic factors MCP-1 and MIP-1α made an aggregation of macrophagocyte in the vascular wall and mediated inflammatory response, then, induced the excitation of nuclear transcription factor c-Jun and then regulated the activation of activated protein 1 (AP-1), then activated MMP-9 promoter in its structural domain to raise MMP-9 mRNA expression, and finally induced the dissolution of extracellular matrix of vascular wall, causing the formation of intracranial aneurysm [21,22,23]. Saito et al. [24] found that MMP-9 positive cells were mainly from the middle and the outer membranes of the artery macrophages, which certified that MMP-9 expressed by macrophages mediated the degeneration of the arterial wall, leading to the formation of arterial aneurysm. The above studies have indicated that MMP-9 was linked to the formation of IA. The results of our study revealed that MMP-9 was upregulated in IA; thus, we speculated that mR-133a-3p might be involved in the occurrence and development of IA by regulating the PSAT1/GSK3β/β-catenin pathway and further regulating MMP-9. In our study, we found that restoring miR-133a-3p reduced the expression of PSAT1, GSK3β, β-catenin, and MMP-9 in intracranial aneurysm tissues. We will carry out relevant research in the future study to verify our findings.

Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-133a-3p expression was decreased and the PSAT1, GSK3β, and β-catenin was elevated in IA. Emerging evidence has suggested that miR-133a-3p plays a suppressive role in different kinds of tumors. Recent study has presented that miR-133a-3p expression was dramatically degraded in breast cancer tissues in contrast with that in non-cancer tissues [25]. Another study has purported that miR-133a-3p expression is declined in advanced prostate cancer (PCa) tissues relative to that in the adjacent normal tissues or benign prostate lesion tissues, especially in bone metastatic PCa tissues [26]. The promoting effect of PSAT1 in other types of diseases are found in some literatures. It is reported that PSAT1 expression was remarkably heightened in non-small cell lung cancer (NSCLC) and forecasted poor clinical outcome of NSCLC patients [27]. Furthermore, PSAT1 is considered as the highest upregulated gene in CRC tumors as well as highly expressed in chemoresistant disease patients [28]. It has been manifested that GSK3β activity was elevated in cancerous tissues [29]. Moreover, the phosphorylation level of GSK3β as well as the expression of nuclear β-catenin are also enhanced, suggesting that GSK3β/β-catenin pathway may be participated in osteopontin regulation [30].

Other results emerged from our data suggested that upregulation of miR-133a-3p and downregulation of PSAT1 suppressed apoptosis and advanced proliferation and migration of IA ECs, reduced VEGF, and MMP-9 expression in IA tissues. It has been suggested previously that the over-expression of miR-133a-3p retrains the invasion, growth, and mitosis of oral squamous cell carcinoma cells by targeting collagen type I alpha 1 (COL1A1) [31]. It is reported that highly expressed miR-133a-3p can repress the propagation of ESCC cells, advance cell apoptosis, and decline the migration and invasion of ESCC cells by targeting COL1A1 [32]. Another study has verified that transient upregulation of miR-133a-3p suppresses the migration, invasion, and growth abilities of gallbladder carcinoma cells through directly targeting recombination signal-binding protein Jκ [33]. In like manner, this study suggests that miR-133a-3p exerts its role in IA through targeting PSAT1. It is displayed that PSAT1 overexpression boosts ESCC cell growth and matrigel invasion in vitro, and injection of mice with ESCC cells with high expression of PSAT1 induces tumor formation in vivo [14]. Other study also has reported that PSAT1 is highly expressed and forecasts a poor clinical outcome of patients, as well as enhances cell tumorigenesis and proliferation in vivo and in vitro [13]. Prior research generally confirms that PSAT1 advances cell cycle progression, proliferation, and tumorigenesis through loss- and gain-of-function experiments [27]. It has been indicated that MMPs are composed of a series of enzymes which cleaves protein substrates on the basis of a conserved mechanism referring activation of an active site-bound water molecule through a Zn ²⁺ ion [34]. MMP-9 is a distinct protease which push forward an immense influence on many biological processes [35]. A study has contended that MMP-9 is elevated in the aneurysm groups compared to the control group [36]. Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) is recognized as the key modulator of endovascular differentiation of trophoblast [37]. A study has revealed that silenced PSAT1 expression suppresses VEGF, β-catenin, and GSK3β phosphorylation expression [10].

Conclusion

To briefly conclude, our study confirms our hypothesis that overexpression of miR-133a-3p or downregulation of PSAT1 restrain endothelial cell damage and advance endothelial cell proliferation via inhibiting the GSK3β/β-catenin pathway in IA. These findings provide a new insight in a novel target therapy for IA. These findings underscore the role of miR-133a-3p in IA in relation the PSAT1/GSK3β/β-catenin pathway. However, a conclusion about the effects of miR-133a-3p and PSAT1 cannot be made clearly due to limited known researches on this. It needs to be monitored rigorously and reported appropriately in the future clinical trials.

Disponibilité des données et des matériaux

Not applicable

Abréviations

miR-133a-3p:

MicroRNA-133a-3p

IA:

Intracranial aneurysm

PSAT1:

Phosphoserine aminotransferase 1

GSK3:

β-glycogen synthase kinase 3β

SAH:

Subarachnoid hemorrhage

MiRNAs:

MicroRNAs

CRC:

Colorectal cancer

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

HE:

Hematoxylin-eosin

PBS :

Tampon phosphate salin

MMP :

Matrix metalloprotease

VEGF:

Vascular endothelial growth factor

NC :

Contrôle négatif

DAB:

Diaminobenzidine

FBS :

Sérum fœtal bovin

UEAI:

Ulex europaeus agglutinins I

IP :

Propidium iodide

FITC:

V-fluorescein isothiocyanate

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

OD :

Densité optique

SD :

Sprague-Dawley

SPF:

Specific pathogen-free

GAPDH:

Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

BCA:

Bicinchoninic acid

3′UTR:

3′ Untranslated region

WT:

Wild type

MUT:

Mutant

ANOVA :

Analysis of variance

NSCLC:

Non-small cell lung cancer

VEGF-A:

Vascular endothelial growth factor-A